全 文 ：北方园艺 2010(9):139 ～ 142 ·生物技术 ·
第一作者简介:孙秀霞(1985-),女 ,硕士 ,研究方向为植物遗传学。
E-mail:sunxiuxia1985@yahoo.com。
通讯作者:张霞(1964-),女, 教授 ,现主要从事遗传学教学及科研
工作。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30660031)。
收稿日期:2010-01-13
SSR标记对大颖针禾种群遗传结构的研究
孙秀 霞 , 齐 妍婷 , 王建 明 , 陆 　爽 , 张 　霞
(石河子大学生命科学学院 ,新疆石河子 832000)
　　摘　要:以大颖针禾 7个不同地理种群 100个样本为研究对象 ,利用 SSR技术从群体水平进
行遗传结构的研究。结果表明:大颖针禾遗传多样性丰富 , Nei s基因多样性指数 H=0.2244 ,
Shannon多样性指数 I=0.3355 ,这2个指标都在 YT 种群最高 ,MSS种群最低;大颖针禾种群的
遗传分化系数 Fst=0.5475 ,即在总的遗传变异中有 54.75%存在于种群间 ,种群间遗传距离 GD
变幅为 0.0871 ～ 0.2441 ,地理距离和遗传距离之间无相关性;通过聚类分析 ,以遗传距离0.14为
标准 ,大颖针禾种群可划分为 4个类群。
关键词:大颖针禾;SSR标记;遗传多样性;遗传结构
中图分类号:S 543+.9　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2010)09-0139-04
　　长期以来 ,由于人类活动的频繁增加 ,沙漠化情况
越来越严重。在新疆南北两大沙漠的边缘区域 ,随着农
垦事业的不断发展 ,绿洲—沙漠过渡带和沙漠边缘的草
本植物种群的生境破碎化趋势正在加剧[ 1] 。此外 ,我国
北方广大地区国土沙漠化 、荒漠化严重 ,且目前还不能
有效阻止这一进程 ,近年频繁发生的沙尘暴就是最好证
据。试验证明 ,植物措施是防治沙尘暴的有效方法之
一[ 2] ,而草本植被最能对荒漠起沙过程起阻止作用。此
外 ,沙尘暴也与我国大范围的草原 、荒漠和沙漠草本植
被退化有直接的关系 ,对于这些环境的生态恢复 ,采取
人工辅助的方式促进自然草本植被的恢复。
从植物自然分布规律可以观察到 ,在某些地区 ,随
环境水量由多到少的梯度变化 ,植物区系中禾本科草本
植物所占比例逐渐增多。禾草类植物大多以其良好的
旱生适应特性 ,强烈的分蘖克隆能力和密集的地上地下
构件分布等特征而成为优秀的固沙植物。大颖针禾
(Stipagrostis grandiglumis(Roshev.)Tzvelev),隶属禾
本科针禾属 ,为多年生草本植物。在我国主要分布于甘
肃敦煌 ,新疆南部和内蒙古 ,从安西 、敦煌沿阿尔金山
麓 ,经新疆库姆塔格沙漠直至塔克拉玛干沙漠东部和南
部的边缘地带 ,多生于水道边 、流动沙地 、丘间低地或沙
山上[ 3-4] 。大颖针禾是超旱生植物 ,可适应年降水量在
250 mm以下的沙质荒漠地区[ 4] ,是优异的固沙禾草。
种群的遗传结构就是遗传变异 ,即基因和基因型在
时间和空间上的分布式样 ,其包括种群内遗传变异和种
群间遗传分化[ 5] 。研究种群的遗传结构及其影响因子 ,
是探讨植物的适应性 、物种形成过程和分化式样 、进化
的基础内容 ,对于濒危物种 、具重要生态功能物种的保
护和生态恢复都可提供可靠的分子依据。SSR标记由
于具有遗传方式简单 、多态性好 、操作简便 、重复性好、
稳定可靠等特点 ,而被认为是生物种群遗传结构与变异
研究中极有价值的分子遗传标记[ 6] 。现利用SSR标记 ,
从分子水平探讨大颖针禾自然种群的遗传结构 ,填补
SSR标记技术在大颖针禾资源遗传研究领域的空白 ,为
制定科学的保护策略及今后的持续利用提供依据。
1　材料与方法
1.1　试验材料
大颖针禾样本取自 7个不同的地理种群 ,共 100
份 ,种群的地理信息 、代号和取样数目见表1。试验采取
随机取样 ,个体采集间距大于5 m ,采集时取无病虫害的
叶片 ,分株丛编号将叶片装入信封置于阴凉处自然
风干。
　　表 1 大颖针禾种群样本采集信息
种群代号 取样地点 经度(E)维度(N)海拔/m 取样数目
MF 新疆民丰县 82°05′ 36°44′ 1 670 11
YT 新疆于田县 81°48′ 36°49′ 1 435 22
QM 新疆且末县 86°39′ 38°43′ 988 11
MSS 甘肃敦煌鸣沙山 94°40′ 40°05′ 1 300 4
CB 新疆策勒县波斯坦公社 81°20′ 36°24′ 2 020 11
SS 新疆鄯善县 89°50′ 42°44′ -23 15
AKS 甘肃敦煌阿克塞沙湾 94°21′ 39°45′ 1 520 26
1.2　试验方法
1.2.1　基因组 DNA的提取及检测　参考华山新麦草
DNA的提取方法[ 7] 提取基因组 DNA ,并根据实际情况
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略做改进。0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其质量 ,紫外
分光光度计测定其浓度 、纯度 ,最后将 DNA 稀释至
50 ng/μL ,于-20℃下保存备用。
1.2.2　SSR扩增及扩增产物的检测　参考已发表的羽
毛针禾[ 8] 和野生水稻的相关文献 ,共筛选出扩增效果
好、多态性高的 20对 SSR引物用于研究。引物由上海
捷锐生物工程公司合成 ,相关信息见表 2。SSR扩增反
应在 My Cycle(BiosinRAD)扩增仪上进行 ,采用 25 μL
反应体系:1×buffer(10 mM Tris HCl ,50 mM KCl ,pH
8.3)、2.5 mM MgCl2 、0.2 mM dNTPs 、正反向引物各1.0
μM 、1 U Taq 聚合酶 、50 ng 模板 DNA 、ddH2O 12.5μL。
反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性45 s ,50℃退火
45 s ,72℃延伸1 min ,36个循环;72℃延伸10 min ,4℃保
存。
　　表 2 SSR引物的序列及扩增结果
引物 正向引物序列 反向引物序列 N P/ %
RM20A ATCTTGTCCCTGCAGG TCAT GAAACAGAGGCACATTTCATTG 16 84.21
RM21 ACAGTATTCCGTAGGCACGG GCTCCATGAGGGTGGTACAG 12 100
RM72 CCGGCGATAAAACAATGAG GCATCGGTCCTAACTAAGGG 18 85.71
RM118 CCAATCGGAGCCACCGGAGAGC CACATCCTCCAGCGACGCCGAG 7 43.75
RM135 CTCTGTCTCCTCCCCCGCGTCG TCAGCTTCTGGCCGGCCTCCT 8 57.14
RM167 GATCCAGCGTGAGGAACACGT AGTCCGACCACAAGGTGCGTTGTC 10 47.62
RM205 CTGGTTCTGTATGGGAGCAG CTGGCCCTTCACGTTTCAGTG 8 53.33
RM216 GCATGGCCGATGGTAAAG TGTATAAAACCACACGGCCA 12 70.59
RM230 GCCAGACCGTGGATGTTC CACCGCAGTCACTTTTCAAG 11 57.89
RM239 TACAAAATGCTGGGTACCCC ACATATGGGACCCACCTGTC 9 64.29
RM240 CCTTAATGGGTAGTGTGCAC TGTAACCATTCCTTCCATCC 5 35.71
RM253 TCCTTCAAGAGTGCAAAACC GCATTGTCATGTCGAAGCC 8 44.44
RM267 TGCAGACATAGAGAAGGAAGTG AGCAACAGCACAACTTGATG 10 58.82
RM282 CTGATTCCACACACTTGTGC GATTCCACGTCAGGATCTTC 7 50
RM289 TTCCATGGCACACAAGCC CTGTGCACGAACTTCCAAAG 11 64.71
RM324 CTGATTCCACACACTTGTGC GATTCCACGTCAGGATCTTC 23 92
RM331 GAACCAGAGGACAAAAATGC CATCATACATTTGCAGCCAG 16 69.57
RM334 GTTCAGTGTTCAGTGCCACC GACTTTGATCTTTGGTGGACG 7 43.75
RM335 GTACACACCCACATCGAGAAG GCTCTATGCGAGTATCCATGG 14 77.78
RM341 CAAGAAACCTCAATCCGAGC CTCCTCCCGATCCCAATC 13 81.25
　　在 0.5×TBE缓冲系统下采用10%聚丙烯酰胺凝
胶电泳对扩增产物进行检测 ,并使用 DNA Marker标定
分子量。采用硝酸银染色 ,用数码相机拍照并保存。
1.3　数据统计及分析方法
选择扩增强且具有代表性的条带进行统计 ,有带赋
值“1” ,无带赋值“0”。根据每个个体产生的条带位置确
定基因型 ,从而将原始图形数据转化为数字数据。统计
每个引物的多态性条带数 N 及多态性比率 P。利用
POPGENE version 1.31软件[ 9] 计算观察等位基因数
Na ,有效等位基因数 Ne , Nei s基因多样性指数 H ,
Shannon多样性指数 I ,总种群基因多样度 Ht ,种群内基
因多样度 Hs ,遗传分化系数 Fst ,基因流 Nm以及种群
间的无偏差 Nei遗传相似系数和遗传距离。根据 Nei
氏遗传距离及遗传相似系数 ,利用软件NTSYS-pc ver-
sion 2.10 ,采用非加权算术平均数聚类UPGMA 方法进
行聚类分析[ 10] 。
2　结果与分析
2.1　SSR引物扩增结果分析
选取的 20对SSR引物的扩增带型均清晰稳定 ,多
态性高 ,如引物 RM341(图 1)所扩增的部分谱带。在
100份大颖针禾样本中共检测到 225条多态性谱带 ,分
子量变异范围约为 100 ～ 1 500 bp。每对引物检测到的
多态性带数及其所占的比例见表2。不同引物检测到的
多态性带数差异较大 ,变幅为5(RM240)～ 23(RM324),
平均为 11.25。此外 ,不同引物的多态性比率差异较大 ,
最大为 100%(RM21),最低为 35.71%(RM240),平均为
64.13%。
图 1　引物 RM341的部分扩增结果
2.2　种群的遗传多样性及遗传结构分析
从表 3可以看出 ,大颖针禾不同种群的遗传多样性
差异很大。其中 ,观察等位基因数 Na变幅为 1.1561
(MSS)～ 1.4220(YT),有效等位基因数 Ne 变幅为
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1.1164(MSS)～ 1.2891(YT)。Nei s基因多样性指数 H
变幅为0.0646～ 0.1624 ,种群水平的平均值为0.1013 ,物
种水平为 0.2244。Shannon多样性指数 I的变化范围为
0.0937～ 0.2375 ,种群水平的平均值为0.1490 ,物种水平
是0.3355。从 Nei s基因多样性指数 H 和 Shannon多
样性指数 I来看 ,7个种群遗传多样性水平从高到低的
顺序为:YT>AKS>MF>SS>QM >CB>MSS。大颖
针禾种群的遗传分化系数Fst为 0.5475 ,即在总的遗传
变异中有 54.75%存在于种群间。其总种群基因多样度
Ht为0.2240 ,种群内基因多样度 Hs为0.1014。大颖针
禾7个种群间的基因流 Nm非常有限 ,仅为 0.4133 ,反
映出种群间隔离程度较大 ,并促进了种群内的遗传
分化。
　　表 3　7个大颖针禾种群的遗传多样性指标
种群代号 Na Ne I H
QM 1.2514±0.4345 1.1616±0.3172 0.1368±0.2490 0.0924±0.1727
YT 1.4220±0.4969 1.2891±0.3878 0.2375±0.2967 0.1624±0.2079
MF 1.2543±0.4361 1.1743±0.3338 0.1427±0.2580 0.0976±0.1802
AKS 1.3439±0.4757 1.2320±0.3640 0.1923±0.2810 0.1311±0.1959
MSS 1.1561±0.3634 1.1164±0.2885 0.0937±0.2221 0.0646±0.1550
SS 1.2543±0.4361 1.1625±0.3167 0.1376±0.2498 0.0930±0.1733
CB 1.1965±0.3980 1.1192±0.2827 0.1021±0.2205 0.0684±0.1527
Mean 1.2684 1.1793 0.1490 0.1013
Total 1.6445 1.3844 0.3355 0.2244
2.3　种群间的遗传距离和聚类分析
从表 4可以看出 , 7个种群的遗传相似度分布在
0.7834 ～ 0.9166之间 ,其中 QM和 CB的遗传相似度最
低 ,MF和 AKS的遗传相似度最高。反之 , MF 和 AKS
的遗传距离最小为 0.0871 ,而 QM 和 CB的遗传距离最
大为 0.2441 ,可以看出地理距离和遗传距离并不是一致
的。
根据 Nei s遗传距离用 NTSYS软件对 7个种群进
行UPGMA 聚类分析 ,结果如图 2所示。7个种群在
0.14处分为4个大支:第 1支包含 QM 和 YT 种群;第 2
支包含 MF 和AKS种群;第3支包含MSS种群和SS种
群;CB种群单独分为第 4支。
　　表 4　大颖针禾种群间的遗传相似系数和遗传距离
种群代号 QM YT MF AKS MSS SS CB
QM ＊＊＊＊ 0.8939 0.8466 0.8385 0.7966 0.8221 0.7834
YT 0.1121 ＊＊＊＊ 0.9004 0.8704 0.8199 0.8425 0.8163
MF 0.1666 0.1049 ＊＊＊＊ 0.9166 0.8141 0.8291 0.8042
AKS 0.1762 0.1388 0.0871 ＊＊＊＊ 0.8487 0.8613 0.8404
MSS 0.2274 0.1985 0.2056 0.1640 ＊＊＊＊ 0.9163 0.8225
SS 0.1959 0.1714 0.1874 0.1493 0.0874 ＊＊＊＊ 0.8747
CB 0.2441 0.2030 0.2179 0.1739 0.1954 0.1339 ＊＊＊＊
　　注:遗传相似系数(斜线上),遗传距离(斜线下)。
3　讨论与结论
3.1　引物的获得
微卫星侧翼序列在属内种间和亲缘关系接近的属
间是相当保守的 ,这一特征奠定了微卫星共用引物的理
图2　大颖针禾7个种群的 UPGMA聚类图
论基础。属内种间微卫星共用引物的扩增成功率比较
高 ,在亲缘关系较近的种间一般能够共用 ,而属间共用
微卫星主要取决于属间亲缘关系的远近[ 11] 。该研究参
考了羽毛针禾和野生水稻的相关文献 ,从 38对 SSR引
物中筛选出20对首次用于大颖针禾的 SSR标记 ,结果
显示 20对SSR引物的扩增带型均清晰稳定 ,多态性高。
这充分证明了 SSR位点的通用性和保守性 ,即 SSR位
点序列在属内种间甚至在科内属间是保守的 、相似的。
其中 ,引物 RM21、RM72 、RM20A 、RM341 、RM335具有
较高的多态性比率(均高于 70%),可以将其用于大颖针
禾进一步的SSR标记研究。
3.2　遗传多样性及遗传结构
遗传多样性是每种生物所固有的特性 ,是长期适应
与进化的产物。对于任何一个物种来说 ,其遗传多样性
越丰富 ,对环境变化的适应能力就越强 ,就越容易扩展
其分布范围和开拓新的环境[ 12] 。大颖针禾的 Nei s基
因多样性指数 H 明显高于单子叶植物 Nei s遗传多样
性的平均值0.1909[ 13] ,这可能与其生存环境有关。Ran-
di
[ 14]对以色列石鸡(Aletoris chukar)种群遗传结构的研
究表明 ,年平均降水量与种群的遗传多样性呈显著负相
关 ,干旱区的种群有更高的遗传多样性。这在一定程度
上解释了大颖针禾具有较高遗传多样性的原因。大颖
针禾的 Nei s基因多样性指数 H 和 Shannon多样性指
数 I均明显高于羽毛针禾 ,主要原因在于所检测SSR位
点的数量和分布以及材料多样性的差异。7个种群中 ,
MSS种群的遗传多样性水平最低 ,这可能与其位于风景
旅游区 ,有大量的人畜活动 ,原生境受到干扰或破坏有
关。很多物种的遗传多样性研究结果表明 ,物种生境的
破坏 ,不仅缩小物种适宜的生存环境 ,而且增加了近亲
个体的交配机会 ,这可能是导致种群灭绝和遗传变异丢
失的重要原因[ 15] 。
遗传结构是通过物种群体内和群体间的遗传分化
来体现的。基因流是影响群体内部和群体之间遗传变
异程度的重要因素[ 16] 。基因流的大小可以反映群体遗
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传结构的大小 ,一般来说 ,基因流大的物种 ,种群间遗传
分化小 ,大的基因流可以阻止群体间的遗传分化;反之 ,
种群间的遗传分化大。大颖针禾 7个种群间的基因流
Nm非常有限 ,仅为0.4133 ,说明大颖针禾种群间遗传分
化大。遗传距离可表示不同种群之间遗传差异的程度 ,
遗传距离越大 ,说明种群间亲缘关系越远。7个种群的
遗传距离分布在0.0871 ～ 0.2441之间 ,其中MF和 AKS
的遗传距离最小 ,而 QM 和CB的遗传距离最大。聚类
分析结果显示 ,地理距离和遗传距离并不是一致的 ,这
可能与不同种群的生存环境、生活史特性 、分布范围 、繁
育系统等因素有关。
3.3　大颖针禾的保护及利用
保护物种 ,从某种意义上说就是保护物种的遗传多
样性或进化潜力。一个物种的遗传分化系数 Fst高 ,表
明该物种的遗传变异主要存在于种群间 ,就需要选取较
多的种群才能保护其遗传多样性。在实际取样时 ,对于
一个基因流较小 ,Fst为 0.6的物种 ,至少要取 6个种群
才能保护其 95%的遗传多样性 [ 5] 。大颖针禾 Fst为
0.5475 ,且基因流较小 ,因此至少要取 5 ～ 6个种群进行
保护。对于遗传多样性水平最高的 YT 种群应给予重
点保护。此外 ,对于生境遭到严重破坏 ,种群小的 MSS
种群也应给予重点保护。大颖针禾在长期进化过程中形
成了一系列适应沙生环境生态的生物学特征:茎秆纤细
有弹性 ,叶片线形且韧性大 ,这使其耐风蚀;基部保留枯
死的老叶鞘 ,根具沙套等特点可耐高温和严寒;叶片强
烈纵卷 ,具地下和水平根系使其抗旱。考察时发现 ,在
很多沙丘的顶部 ,只有大颖针禾生存 ,且一簇簇 ,生机盎
然。因此 ,可将其作为固定沙地 ,防止沙丘活化的先锋
禾草。参考羽毛针禾[ 17] ,可对大颖针禾进行人工辅助更
新或人工栽培 ,以利增加其沙生植被的密度。满足治沙
保护环境的需要后 ,也可以将其作为牧草加以利用 ,从
而达到一种良性循环。
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Analysis of Genetic Structure by SSRMarkers in Stipagrostis grandiglumis Populations
SUN Xiu-xia, QI Yan-ting ,WANG Jian-ming , LU Shuang , ZHANG Xia
(College of Life Science, Shihezi University , Shihezi , Xingjiang 832003)
Abstract:Taking 100 individuals from seven populations of Stipagrostisgrandiglumis as experiment material , Using the
SSR on the basis of g roup level on the genetic structure w as studied.The results showed that high level of genetic diver-
sity was detected , Nei s gene diversity index was 0.2244 and Shannon diversity index was 0.3355.Those two index all had
maximal level in YT and lowest level in MSS.The genetic differentiation(Fst)was 0.5475.It suggested that 54.75%genetic
variation existed among populations.The genetic distance(GD)ranged from 0.0871 to 0.2441.There was nonsignificant
correlation between geographical distance and genetic distance.The results ofUPGMA indicated that with 0.14 as the
standared genetic distance the Stipagrostis grandiglumis populations were classified into 4 groups.
Keywords:Stipagrostis grandiglumis;simple sequence repeats markers;genetic diversity;genetic st ructure
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