全 文 ：吉林农业大学学报　2001 ,23(1):18 ～ 20
Journal of J ilin Agricultural Universi ty
利用外源 DNA 导入技术培育
向日葵育种新材料
张美善　卢　敏　陈展宇　崔喜艳　徐惠风　徐克章
(吉林农业大学农学院　长春 130118)
摘　要:采用氯仿-异戊醇-RNA酶法 , 从菊芋 、罗马尼亚向日葵幼叶中提取总 DNA ,利用花粉管通道法和
子房注射法导入向日葵品种“吉农 92-1” 、吉农 92-5”中 ,发现 D1 代及 D2 代在植株形态 、种皮色 、百粒重 、籽
粒大小等性状上出现了新的变异类型。
关键词:外源 DNA;向日葵;导入
中图分类号:S565.503.2　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2001)01-0018-03
Sunflow er Breeding by Using Technique of Introduction of Exogenous DNA
ZHANG M ei-shan , LU Min , CHEN Zhan-yu , CUI Xi-yan , XU Hui-feng , XU Ke-zhang
(College of Agronomy , J ilin Agricultural Universi ty , Changchun 130118 , China)
Abstract:Total DNA was isolated , through using trichloromethane-isoamy l alcohol-RN Aase ,
f rom young leaves of Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus L .)and Romania sunf lower
(Helianthus annuus L .)and introduced into sunf lower varietiesJ inong 92-1 and J inong 92-
5 through pollen tube pathway and the inject ion into ovule.New variations were found in such
morphological characters as the color of seed coat , the hundred-seed weight and the size of seed
in the D1 and D 2 progenies.
Key words:exogenous DNA ;sunf lower (Helianthus annuus L .);introduct ion
　　向日葵已成为世界第二大油料作物 ,1982年
已是我国的第五大油料作物 ,栽培面积仅次于大
豆 、油菜 、花生和芝麻[ 1] 。由于向日葵在我国是
一个新兴的油料作物 ,并且适合发展向日葵的土
地面积潜力很大 ,因此在常规育种的同时 ,应用新
的生物技术手段和方法培育新材料具有重要的意
义。周光宇[ 2～ 4] 根据远缘杂交出现的一些变异
现象 ,提出染色体水平以下的 DNA 片断杂交的
假设 ,并设计了授粉后外源 DNA 导入植物的技
术。1978 年以来 ,利用这一技术在棉花 、水稻等
作物上成功地转移了不同来源的抗病性和其它有
益性状的基因[ 5～ 7] ,但在向日葵中的应用目前国
内尚未见详细报道。从 1998年开始 ,我们对向日
葵属间及种间外源 DNA 的导入进行了研究 。
1　材料和方法
1.1　材料
供体材料为菊芋和罗马尼亚向日葵(油用
型)。
受体材料为食用型向日葵品种 “吉农 92-
基金项目:吉林省科委资助项目(吉科合字第 960104-2)
作者简介:张美善 ,女 , 1965年出生 ,硕士 ,讲师 ,主要从事生物技术研究
收稿日期:2000-08-28
DOI :10.13327/j.j jlau.2001.01.006
1” 、“吉农 92-5” 。
1.2　方法
1.2.1　DNA 的提取和纯化　用来提取 DNA 的
供试材料 ,选用了细胞分裂旺盛 、DNA 含量丰富
的幼嫩黄化叶片及在恒温箱培养的黄化幼苗 。称
取供试材料 10 ～ 20 g 贮于-20℃冷冻 1 ～ 3 d 待
用。提取方法采用了陈永强[ 8]的氯仿 -异戊醇
-RN A 酶法。其简要步骤是:①将冷冻的备用
材料在冰浴中研磨(研磨用缓冲液:0.45 mol/ L
NaCl+0.045 mol/ L 柠檬酸三钠 +0.1 mol/ L
乙二胺四乙酸(EDTA)+1%十二烷基硫酸钠
(SDS), pH 7.0),用氯仿-异戊醇(24∶1)脱去组
织蛋白质 ,在 72℃恒温水浴保温 3 ～ 4 min 以灭
活DNA 酶 ,用冷乙醇沉淀 DNA ,再用1×SSC溶
液(0.15 mol/ L NaCl +0.015 mol/ L 柠檬酸三
钠)溶解 DNA ,即可得到 DNA 粗制品。 ②加入
RNA 酶溶液 ,使其最终浓度在 50 ～ 75 μg/mL ,
在37℃恒温水浴中保温 30 min ,以除去 RNA 。
再用氯仿-异戊醇提取 ,用冷乙醇沉淀 DNA ,即
可得到纯化的 DNA 。
1.2.2　DNA 纯度鉴定　在纯 DNA 中加入适量
0.1 × SSC 溶 液 (0.015 mol/ L NaCl +
0.0015 mol/ L柠檬酸三钠)中 ,待完全溶解后加
入 10×SSC 溶液(1.5 mol/ L NaCl +0.15 mol/
L 柠檬酸三钠),使最终浓度为 1×SSC。以 1×
SSC 溶液为空白 ,用美国 BECKMAN DU7500
紫外分光光度计扫描 , 测定波长 230 nm 、260
nm 、280 nm 处的光密度值。 A260/ A280 =1.80 ,
A 260/ A230=2.50 ,达到外源 DNA 的纯度要求 ,
呈典型的 DNA 紫外光谱曲线。DNA 浓度(μg/
mL)=A260×50×稀释倍数 。导入时将纯 DNA
用1×SSC溶液与5 mmol/ L CaCl 2 溶液(CaCl 2
起防霉作用)配制成浓度为 250 ～ 330 μg/mL 的
DNA 溶液 。
1.2.3　导入时间和方法　向日葵为异花授粉作
物 ,因此我们在舌状花开放前进行套袋 ,在管状花
开 4 ～ 5轮时进行品种内人工授粉 ,授粉时间为上
午 9 ～ 11时(或下午 3 ～ 5时)。对照植株同时进
行人工授粉和套袋。导入方法有 2种:
(1)花粉管通道法
①在人工授粉后 3 ～ 6 h ,管状花的羽状柱头
萎蔫 ,表示授粉已经完成。用镊子拔除 2 行管状
花 ,将第 3 ～ 5行作为导入区用眼科剪刀剪去柱
头。
②用 25 μL 微量进样器在花柱上滴DNA 溶
液 3 ～ 5 μL ,为了防止 DNA 液蒸发 ,重复滴3次 ,
操作时将 DNA 溶液置于冰浴中保存 , 以免被
DNA 酶降解 。
③挂标签 、套袋 。
(2)子房注射法
①在人工授粉后 24 ～ 30 h ,摘除花冠及花丝
筒 ,使子房暴露出来 。
②用细玻璃针刺子房顶部正中位置 ,然后将
100 μL 微量进样器插入子房室约 0.5 cm ,推进
DNA 溶液约 10 μL 。
③挂标签 、套袋 。
2　结果与分析
2.1　导入时间的选择
我们选择了受体的受精过程和胚胎发育早期
转化种胚细胞。此期细胞壁尚不完整 , DNA 易
于渗入 。而且这一时期细胞分裂旺盛 ,也是接受
异源遗传物质的敏感期 ,又由于受精后细胞的
DNA 复制活跃 , DNA 易于整合。向日葵花粉粒
落到雌蕊柱头上 ,在气温 25℃～ 27℃、相对湿度
76%～ 80%时 ,一般在 5 ～ 10 min 就可发芽[ 9] 。
在一般情况下 ,花粉落到柱头上到子房受精时间
需 1 h 。在授粉后 5 ～ 6 h ,初生胚乳核开始第一
次分裂 。根据这些特点 ,我们确定花粉管通道法
导入外源 DNA 的适宜时间为人工授粉后 3 ～ 6
h ,子房注射法为人工授粉后 24 ～ 30 h 。
2.2　不同导入方法对结实率的影响
对处理花盘进行单独收获 、脱粒和保存。
1998 年导入 6 株 , 收获 5 株 。1999 年共处理
14株2 923个小花(花粉管通道法 11 株 、子房注
射法 3株),其中以花粉管通道法导入 2 250个小
花 ,得到结实种子 1 900粒 ,平均结实率 84.4%;
用子房注射法导入 673 个小花 ,得到结实种子
284粒 ,平均结实率 42.2%。
实验结果表明 , 子 房注射法的结实率
(42.2%)低于花粉管通道法(84.4%);花粉管通
道法的结实率接近该品种人工授粉的结实率
(88.0%)。子房注射法结实率低的主要原因是因
为注射对子房有机械损伤。而供体 DNA 来源差
异影响不大。
2.3　导入后代植株的变异
19第 23 卷　第 1 期　　　　　　　　　　　张美善等:利用外源 DNA导入技术培育向日葵育种新材料
从表 1可以看出:外源 DNA 导入向日葵后
使植株株高增加 ,叶面积 、茎直径和花盘直径下
降 ,叶片夹角变小 ,但导入后代植株抗倒伏能力增
强。由于外源 DNA 导入后代植株的叶片总面积
和叶夹角变小 ,有利于植株群体的通风透光 ,使群
体光合生产能力提高 ,同时更有利于通过增加密
度提高产量。导入后代植株的花盘直径虽然较
小 ,但空秕粒明显减少 ,向日葵螟危害率降低 ,抗
菌核病能力增强 ,其单株产量没有降低 。
导入第二代(D 2)变异植株仍表现株型紧凑 、
抗菌核病 、抗向日葵螟等特性 ,尤其是导入菊芋
DNA 所获得的黑色种皮籽粒 ,其向日葵螟危害
率几乎为零。
表 1　D1 代植株形态的变异
Table 1.Plant morphological variation in D 1 progeny
材　　料
Material
株高/ cm
Plan t height
叶片夹角/(°)
Lea f angle
叶面积/ cm2
Leaf area
茎直径/ cm
Diameter of stem
花盘直径/ cm
Diameter of d isk
吉农 92-1对照
Jinong 92-1 control 213.40 51.30 713.9 3.15 22.70
导入罗马尼亚向日葵 DNA
Introd uct ion of Romania sun f lower 259.6±11.93 44.5±3.7 586.2±10.4 2.96±0.22 17.20±1.33
导入菊芋 DNA
Introd uct ion of Jerusalem ar tichoke 260.5±3.22 39.0±3.1 533.5±7.4 2.95±0.17 17.8±0.78
吉农 92-5对照
Jinong 92-5 control 222.4 57 684.9 3.09 21.9
导入罗马尼亚向日葵 DNA
Introd uct ion of Romania sun f lower 260.1±4.3 46.0±57 482.7±9.5 2.95±0.11 18.30±0.35
导入菊芋 DNA
Introd uct ion of Jerusalem ar tichoke 226.0±29.3 59.2±12 412.4±16.0 2.55±0.13 17.30±2.26
2.4　种皮色的变异
1998 ～ 1999年 ,在导入的 19个组合中有6个
组合的导入第一代(D 1)种皮色发生变异 ,表现为
种皮色加深 ,而其中 2个组合的变异非常显著 ,并
出现种皮毛(受体无种皮毛)。种皮色在导入第二
代(D2)继续发生分离。
2.5　籽粒大小及百粒重的变异
导入第一代(D2)出现百粒重比受体增加约
10%,籽粒大小比受体增加 12%～ 33%的大粒 ,
其中 1个组合的变异显著 。
从导入第二代(D 2)表现来看 ,有些 D 1 代变
异材料继续发生分离 ,而有些则开始趋于稳定 。
3　讨　论
利用外源 DNA 导入技术进行农业分子育
种 ,一般供体范围比较宽 ,无需经过组织培养过程
及目的基因的分离 ,要求设备条件也不高 ,方法简
便 ,后代稳定较快 ,能够缩短育种时间。此外 ,由
于导入的是总 DNA ,子代变异是随机的 ,因而可
同时筛选各种变异类型 ,同时可以利用这一技术
实现植物远缘的遗传信息交流 ,为育种工作创造
新种质材料。我们的实践证明 ,这一导入技术是
创造向日葵育种新材料的行之有效的途径。
参 考 文 献
1　李庆文等.向日葵及其栽培[ M] .北京:农业出版社 ,
1991.1
2　周光宇.从生物化学的角度探讨远缘杂交的理论[ J] .
中国农业科学 , 1978 ,(2):16～ 20
3　周光宇等.农业分子育种———授粉后外源 DNA 导入植
物的技术[ J].中国农业科学 , 1988 , 21(3):1～ 6
4　周光宇等.远缘杂交的分子基础———DNA 片段杂交假
设的一个论证[ J] .遗传学报 , 1979 , 6(4):405～ 413
5　黄骏麒等.外源海岛棉 DNA 导致陆地棉性状的变异
[ J] .遗传学报 , 1981 , 8(1):56～ 62
6　段晓岚等.外源 DNA 导入水稻引起性状变异[ J] .中国
农业科学 , 1985 ,(3):6～ 10
7　雷勃钧等.外源野生大豆 DN A导入栽培大豆引起的变
异[ J] .中国油料 , 1989 ,(3):11～ 13
8　陈永强.植物组织 DNA 提取的一种快速方法[ J] .遗
传 , 1979 , 1(1):39～ 40
9　王积善等 .向日葵栽培 [ M] .北京:农业出版社 ,
1980.19
20 　吉　林　农　业　大　学　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　2001年