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天人菊菌核病病原鉴定及其拮抗木霉菌株的筛选



全 文 :·植物保护· 北方园艺2012(05):142~145
第一作者简介:刘威(1982-),女,广西北流人,本科,助理工程师,
现主要从事药用植物病虫害研究工作。E-mail:liuwei98@
126.com。
基金项目:广西药用植物园青年基金资助项目(桂药基200807)。
收稿日期:2012-01-04
天人菊菌核病病原鉴定及其拮抗木霉菌株的筛选
刘   威,叶 云 峰,李 林 轩,蒋   妮,刘 丽 辉
(广西壮族自治区药用植物园,广西药用资源保护与遗传改良重点实验室,广西 南宁530023)
  摘 要:通过致病性测定、病害症状、病原菌培养性状及形态特征等对天人菊菌核病病原菌
进行鉴定;通过室内拮抗作用测定和盆栽防治效果测定筛选生防木霉菌株。结果表明:将天人菊
菌核病的病原菌鉴定为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum (Lib)de Bary);筛选到对天人菊菌核病菌
拮抗作用最强,盆栽防治效果最好的菌株是哈茨木霉H5,其拮抗指数为Ⅰ级,防治效果为93.2%。
在测试的5个木霉菌株中,哈茨木霉H5对天人菊菌核病的防治效果最好。
关键词:天人菊;菌核病;病原鉴定;拮抗木霉;筛选
中图分类号:S 482.2+92 文献标识码:B 文章编号:1001-0009(2012)05-0142-04
  天人菊(Gailardia pulchela Foug.)为菊科1a生
草本植物,别名虎皮菊、六月菊。原产北美,喜阳光,耐
半阴,是干旱地区良好的防风固沙植物。由于其花期较
长,色彩绚丽,深得人们喜爱,是花坛、庭园美化的理想
花卉,也是城市园林绿化中的重要观赏植物之一。此
外,该植物全株含天人菊内脂(gailardin),有抗肿瘤(人
体鼻咽癌)和治疗阿米巴痢疾、阴道滴虫等药用功效[1]。
   
2011年以来,随着政府刺激内需政策效应的逐渐显现以
及国际经济形势的好转,天人菊内酯市场需求膨胀,面
临巨大的市场投资机遇。目前,该植物在我国的台湾、
四川、广西、贵州、云南等中、南部省区有大量栽培。随
着天人菊种植年限的增加和种植面积的扩大,其生育期
间的病害问题也日渐突显,尤其是近2a在广西的多个
栽培区出现了菌核病,病害严重时发病率达40%~
50%,常造成大片植株枯死,严重影响了天人菊的品质
和产量。目前,对天人菊的研究主要集中在快速繁殖方
面[2-3],关于其病虫害方面的研究尚未见报道。
为了有效控制天人菊菌核病的发生和蔓延,现对该
病的病原种类进行了鉴定,并通过室内拮抗作用测定和
   
Optimizing Study on Tissue Technology of the Purple Skin Dendrobe
QI Yong-qiong1,CHEN Zhi-yuan1,LI Kai-yun2,LI Chang-ke1
(1.Yunnan Vocational and Technical Colege of Agriculture,Kunming,Yunnan 650031;2.West Mountain Forest Station of Kunming,
Kunming,Yunnan 650100)
Abstract:With the purple skin Dendrobe seed and stem section as explants,the bud seedling proliferation,rooting,and
optimized conditions of plantlets were studied.The results showed that the seed was most appropriate as rapid
propagation explant,seeds through the smal bud seedling,the proliferation and seedling rooting of the way into complete
plant regeneration;And a suitable culture medium formula was explored:beginning the generation of inductive medium for
1/2MS+1mg/L BA+0.5mg/L NAA,seed germination directly grow,growth of large green and sterile smal bud
seedling;Proliferation medium for MS+2mg/L BA+0.5mg/L NAA+5%potatoes juice+5% mashed bananas,bud
seedling multiple of 4.6times as high proliferation and growth better,the bud seedling stout;Rooting medium 1/2MS+
0.5mg/L NAA+10%mashed bananas+0.1%activated carbon,take root seedlings root number and root for average to
best,root system developed,seedling height,robust,and the leaves deep green.Medium suitable for the AGAR
concentration of 6g/L,therefore,higher multiples,erect plant,leaf also didn’t bend.
Key words:purple skin Dendrobe;rapid propagation;seed;agar
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北方园艺2012(05):142~145 ·植物保护·
盆栽防治试验,从几种对植物菌核病具有生防潜力的木
霉菌株(包括哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康氏
木霉(T.koningi)和绿色木霉(T.viride))[4-6]中筛选出
防治作用最好的生防菌株,以期为该病害的生物防治提
供理论依据,也为天人菊的无公害产业化发展打下理论
基础。
1 材料与方法
1.1 病原菌的鉴定
1.1.1 标本采集及症状观察 2010年10月在广西药
用植物园内种植基地观察天人菊菌核病的症状,采集新
鲜病株,并对典型发病症状进行描述和数码照相。
1.1.2 病原菌的分离 采用常规的组织分离法[7]进行
病菌的分离。选取初发病的叶片和茎组织进行病菌的
分离。剪取病健交界处的叶片组织,每小块约0.5cm×
0.5cm,先用75%的乙醇浸泡10s,再用0.1%升汞浸泡
20~30s,用灭菌水漂洗3次,置于PDA培养基上;此
外,剪取病健交界处的茎段组织,每小段长约0.5cm,先
用75%的乙醇浸泡20s,再用0.1%升汞浸泡1min,用
灭菌水漂洗3次,置于PDA培养基上。分离物均置于
28℃条件下培养,待长出菌丝后取菌落边缘菌丝转接至
PDA上培养,直至获得纯培养分离物。
1.1.3 致病性测定 将纯培养的分离物菌丝块通过针
刺接种法接种到天人菊的健康叶片及茎秆上,置于28℃
的恒温培养箱内保湿培养,以针刺伤口处放PDA培养
基块的叶片及茎秆为对照,4次重复。定期观察叶片、茎
秆的发病情况。发病后再对病斑进行组织分离,根据柯
赫氏法则验证分离物是否为致病菌株。
1.1.4 病原菌的培养性状及形态特征观察 将纯化后
的致病菌株置于PDA平板上,在28℃的恒温箱中培养,
观察记录病原菌的培养性状,并制片在显微镜下观察病
原菌的产孢结构及孢子形态,测其大小,进行种类鉴定。
1.2 拮抗木霉菌株的筛选
1.2.1 供试木霉菌株 供试的生防木霉菌株:①哈茨木
霉H1(T.harzianum)(广西农科院微生物研究所生物防
治研究室提供)、②哈茨木霉H2(T.harzianum)(中国工
业微生物菌种保藏中心提供)、③哈茨木霉 H5
(T.harzianum)(中国工业微生物菌种保藏中心提供)、
④康氏木霉K(T.koningi)(中国工业微生物菌种保藏
中心提供)、⑤绿色木霉L(T.viride)(广西农科院微生物
研究所生物防治研究室提供)。
1.2.2 木霉菌株对天人菊菌核病菌的室内拮抗作用测
定 试验采用对峙培养法[8],以PDA为供试培养基,在
培养皿上将天人菊菌核病菌分别与哈茨木霉 H1、H2、
H5、康氏木霉K、绿色木霉L 5个不同来源的木霉菌株
进行对峙培养试验,4次重复,于28℃恒温培养箱中培
养,观察木霉菌株和病原菌的生长情况。6d后,采用拮
抗指数及抑菌率评价不同木霉间的拮抗作用强度,筛选
出拮抗作用较强的木霉菌株。拮抗指数采用张丽荣
等[9]的分级标准:Ⅰ级,木霉菌丝占据平皿100%,Ⅱ级,木
霉菌丝占据平皿>2/3;Ⅲ级,木霉菌丝占据平皿1/3~
2/3;Ⅳ级,木霉菌丝占据平皿<1/3;Ⅴ级,病原菌丝占据
平皿100%;抑制率(%)=(病原菌对照菌落半径-病原
菌落指向木霉菌的半径)/病原菌对照菌落半径×100。
1.2.3 木霉菌株对天人菊菌核病的盆栽防效测定 对
筛选出拮抗活性较强的木霉菌株进行盆栽防治试验。
选择长势一致的天人菊幼苗进行盆栽试验。试验设2
种处理,处理1:以含有生防木霉菌(H1、H2、H5)的麦麸
基质与盆土混匀后栽种天人菊幼苗,待生长分蘖期(移
栽后20d),用病原菌孢子悬浮液(1×106个孢子/mL)以
每株30mL的量灌根;处理2:以不含生防木霉菌的麦麸
基质与盆土混匀后栽种天人菊幼苗,在同一生长分蘖期
伤根后,用病原菌孢子悬浮液(1×106个孢子/mL)以每
株30mL的量灌根。2种处理均在接种病原菌24h后,
用木霉孢子悬浮液(1×106个孢子/mL)以每株30mL的
量灌根。对照(CK)的盆土同样与麦麸基质混合,在接种
病原菌24h后,用稀释相同倍数的空白培养液以每株
30mL的量灌根。3次重复,每重复30株,15d后调查
发病情况,计算各处理的病情指数和防治效果。病害分
级标准:0级:无病;1级:轻微发病,发病面积占茎秆表面
积的5%以下;3级:轻度发病,发病面积占茎秆表面积的
6%~15%;5级:中等发病,发病面积占茎秆表面积的
16%~30%;7级:高度发病,发病面积占茎秆表面积的
31%~50%;9级:严重发病,发病面积占茎秆表面积的
50%以上。病情指数=∑(各级病叶数×相对级指数)/
(调查总叶数×9)×100;防治效果(%)=(对照区病情指
数-处理区病情指数)/对照区病情指数×100。
2 结果与分析
2.1 病害症状及病原菌的鉴定
2.1.1 症状特点 调查发现,植株感病一般在分蘖盛期
至开花结果期。主要为害茎基部及茎秆,也可为害叶
片。发病初期茎基部形成水渍状淡褐色不规则病斑,随
后病斑向上部茎秆和叶柄扩展蔓延,病健交界明显。湿
度大时病斑发展迅速,病斑表面可见白色棉絮状菌丝,
并逐渐形成近圆形或不规则形黑色鼠粪状菌核。叶片
感病,多从下部叶片的叶尖或叶缘开始出现水渍状、褐
色、不规则形病斑,边缘不明显,潮湿时病斑迅速扩展,
全叶腐烂,上面长出白色絮状菌丝。后期植株茎髓变成
空腔,维管束成麻状易折断,最后全株萎蔫枯死。
2.1.2 病原菌的分离与致病性测定 从病叶、茎组织中
共分离、纯化得到3种真菌,将其分别回接到天人菊的
健康叶片及茎秆上,只有其中1种真菌于接种后的第3
天在叶片和茎秆上表现感病变化,发病初期病变部位出
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·植物保护· 北方园艺2012(05):142~145
现褐色斑点,成软腐状,病斑扩展快,接种3d后病斑表
面出现白色棉絮状菌丝,9d后形成黑色菌核(图1),其
症状特点与田间病株症状(图2)相似,对照无发病症状。
从接种的病组织分离到的病原菌与田间发病组织分离
到的培养物形态一致,表明该种真菌是天人菊菌核病的
病原菌。
2.1.3 病原菌的培养性状及形态特征 病原菌在PDA
培养基上培养3d后,形成白色圆形菌落,菌丝平展,在
菌落边缘和表面形成突起,逐渐在突出的部位上出现晶
莹的水珠。培养至第6天可形成菌核,菌核形成初期为
白色绵状突起,后转为黑色,呈椭圆形、球形或鼠粪状。
菌核质地坚硬,表面黑色,内部灰白色,外层为黑色紧密
的拟薄壁组织。菌核经5℃左右的低温处理1个月后,
菌核萌发成子囊盘。每粒菌核通常可产生5~10个子
囊盘。子囊盘初期为杯状,展开后成盘状,盘柄褐色,子
囊圆筒形,大小(114~160)μm×(8~11)μm。表面着生
子囊和侧丝,排成一层。子囊棍棒状,内有8个单胞、无
色、椭圆形、单行排列的子囊孢子,大小(9~14)μm×
(5~8)μm。侧丝长在子囊之间,无色,丝状。根据上述病
原菌的培养性状及形态特征,参照魏景超的《真菌鉴定手
册》[10],确定该病原菌为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum
(Lib)de Bary),属子囊菌亚门,盘菌纲,柔膜菌目,核盘
菌属真菌。
2.2 拮抗木霉菌株的筛选
2.2.1 木霉菌株对天人菊菌核病菌的室内拮抗作用 
供试的5个木霉菌株与病原菌对峙培养6d后,所有木
霉菌株对核盘菌均表现不同程度的抑制作用(表1),其
中哈茨木霉H5对病原菌的拮抗抑菌作用最强,拮抗指
数表现为Ⅰ级,抑菌率可达100%(图3);与其它木霉菌株
之间存在显著性差异;哈茨木霉H1、H2对病原菌的拮
抗作用也较强,拮抗指数均为Ⅱ级,抑菌率均在80%以
上,二者之间差异不显著;而康氏木霉K与绿色木霉L
对病原菌的拮抗作用较弱,拮抗指数仅为Ⅲ级,抑菌率也
相对较低。
表1 不同木霉菌株对天人菊菌核病菌的拮抗作用
  Table 1   The antagonistic ability of diferent trichoderma
    strains on the pathogen
木霉菌株
Trichoderma
strain
哈茨木霉H1
Trichoderma
harzianumH1
哈茨木霉H2
Trichoderma
harzianumH2
哈茨木霉H5
Trichoderma
harzianumH5
康氏木霉K
Trichoderma
koningi K
绿色木霉L
Trichoderma
viride L
拮抗指数
Antagonistic
index
Ⅱ Ⅱ Ⅰ Ⅲ Ⅲ
抑菌率
Pathogen
inhibitory
ratio/%
82.35b 85.43b 100a 51.14c 61.06c
  注:同一列中不同字母表示差异显著(SAS,P<0.05)。下同。
Note:Numbers in columns with diferent letters are significantly diferent(folowed
by SAS,P<0.05).The same below.
图3 哈茨木霉H5对病原菌的拮抗效果
注:A:哈茨木霉H5;B:病原菌。
Fig.3 The antagonist efect of Trichoderma harzianum H5
against the pathogen
Note:A:Trichoderma harzianum H5;B:pathogen.
2.2.2 木霉菌株对天人菊菌核病的盆栽防治效果 用
筛选出的拮抗活性较强的3个哈茨木霉菌株对天人菊
菌核病进行盆栽防治试验。由表2可知,在施用的菌株
相同的情况下,按处理1的方法(即栽苗前用含有哈茨
木霉菌株的基质与盆土混合,并在病原菌接种24h后再
表2 哈茨木霉菌株对天人菊菌核病
的盆栽防治效果
  Table 2 The control eficiency of diferent Trichoderma harzianum
      strains on the sclerotiniose of Gaillardiapulchella
木霉菌株
Trichoderma strain
处理1Treatment 1 处理2Treatment 2
病情指数
Disease
index
防治效果
Control
eficiency/%
病情指数
Disease
index
防治效果
Control
eficiency/%
哈茨木霉H1
Trichoderma
harzianumH1
0.165  81.5b 0.221  72.5b
哈茨木霉H2
Trichoderma
harzianumH2
0.182  79.6b 0.238  70.4b
哈茨木霉H5
Trichoderma
harzianumH5
0.061  93.2a 0.084  89.5a
CK  0.894 – 0.803 –
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次施用哈茨木霉孢悬浮子液)进行防治比处理2的方法
(即在病原菌接种24h后施用1次哈茨木霉孢子悬浮
液)能取得更好的防治效果。在处理方法相同的情况
下,H5菌株的防治效果显著高于H1、H2菌株的防治效
果,其防效高达93.2%。而H1、H2菌株的防治效果分
别为81.5%和79.6%,差异不显著。
3 结论与讨论
培养性状和形态学特征观察是植物病原真菌鉴定
的传统方法。根据菌落的形态和颜色、菌核的形态和颜
色、子囊和子囊孢子的形态、大小,将天人菊菌核病的病
原鉴定为核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum (Lib)de
Bary),属子囊菌亚门,盘菌纲,柔膜菌目,核盘菌属真菌。
核盘菌为土壤习居菌,能在土壤中长期存活和积
累。核盘菌的生活史中有90%的时间是以菌核形式长
期存活于土壤中,诸如轮作、田园清洁等农业技术措施
都很难取得较好的防治效果[11],施用化学药剂虽能取得
一定防治效果,但容易造成环境污染和病原菌产生抗
性。因此,利用土壤中的有益微生物来抑制核盘菌是一
种环保、有效的措施。据报道,从土壤中分离到的木霉
属真菌包括哈茨木霉(T.harzianum)[4]、康氏木霉
(T.koningi)[5]和绿色木霉(T.viride)[6]等对核盘菌均
有较好的拮抗作用。试验结果发现,哈茨木霉对核盘菌
的拮抗作用较好,康氏木霉和绿色木霉的拮抗作用较
差。在测试的3个哈茨木霉菌株中,H5菌株对核盘菌
的拮抗作用最好,其对天人菊菌核病的盆栽防治效果也
是最好的,说明同一种类真菌的不同菌株对病原菌的抑
制效果不同。
在盆栽防治试验中,栽苗前用含有哈茨木霉菌株的
麦麸基质与盆土混合,并在病原菌接种24h后再次施用
哈茨木霉孢悬浮子液的处理能取得很好的防治效果,原
因可能是土壤中加入的麦麸基质为木霉菌提供了营养
载体,因而提高了木霉菌在土壤中的生长能力,使其成
为优势种群定植于植物根际,从而抑制了病原菌在土壤
中的繁殖。
此外,哈茨木霉菌株对天人菊菌核病菌的拮抗机理
及其田间防治效果有待进一步研究。
参考文献
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Identification of the Pathogen of Sclerotiniose on Gailardia pulchela
and Screening of Antagonistic Trichoderma Strain
LIU Wei,YE Yun-feng,LI Lin-xuan,JIANG Ni,LIU Li-hui
(Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant,Guangxi Medicinal Resources Conservation and Genetic Improvement Laboratory,Nanning,
Guangxi 530023)
Abstract:The pathogen was identified based on pathogenicity,disease symptom,cultivation characters and morphology.
The antagonistic Trichoderma strain was screened by antagonistic ability tests in vitro and pot experiments.The results
showed that pathogen of sclerotiniose on Gailardia pulchela was identified as Sclerotinia sclerotiorum (Lib)de Bary.
Trichoderma harzianum H5gave the strongest antagonistic ability in vitro and highest control eficiency in pot
experiments.Its antagonistic index and control eficiency wereⅠand 93.2%,respectively.Among the five tested
Trichoderma strains,Trichoderma harzianum H5had the best control potential for controling the sclerotiniose on
Gailardia pulchela.
Key words:Gailardia pulchela;sclerotiniose;identification of the pathogen;antagonistic Trichoderma strain;screen
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