全 文 ：文章编号:1001- 4276-(2008)01-0054-06
收稿日期:2008 -12-04
基金项目:国家十一五重大科技支撑计划(2006BAD08A13);福建科技重大专项专题 (2006NZ0002-1)。
作者简介:郭琼霞 , (1954 -), 女 , 研究员 , 研究方向:植物检疫。
检疫性杂草假高粱及其近似种
SSR分子标记的遗传多样性
郭琼霞 1 , 黄娴1, 2虞　赟 1 ,庄　蓉3 ,李　宁 2
(1.福建出入境检验检疫局 ,福建 福州 350003;2.福建农林大学 ,福建 福州 350002;3.福州
延安中学 ,福建 福州 350000)
摘要:　利用 SSR标记对 8个假高粱及其近似种样品的遗传多样性进行研究 ,结果发现:(1)在 11对 SSR引
物中 , 有 5对扩增出多态性 ,这 5对引物共检测到 25个多态性位点 ,每对引物平均能检测到 5个多态性位点;
(2)根据 Nei s遗传距离分析的聚类树显示:这 8个高粱属物种共可分为 2个类群 , 7个亚类群;假高粱和黑
高粱 、拟高粱和明福 1号间的亲缘关系极近;(3)SSR结果揭示出所测 8个群体的 Gst为 0.0864,说明本文研
究的 Sorghum属 8个物种的群体遗传分化程度属于中度。
关键词:　假高粱;近似种;SSR;亲缘关系
中图分类号:　S41-30　　文献标识码:　A
假高粱 Sorghumhalepense(L.)Pers是世界十大恶性杂草之一 ,它能以根状茎和种子共同
繁殖 ,破坏我国植被多样性能力强 ,其植株和种子形态都与高粱属的黑高粱 、拟高粱 、苏丹草 、
甜高粱十分相似 。虽然形态近似 ,但检疫地位却不尽相同 ,如黑高粱也是一种检疫性杂草 ,而
拟高粱 、苏丹草 、甜高粱都可作为牧草 。
随着 DNA技术的快速发展 ,遗传标记特别是基于 DNA多态性的 RFLP、RAPD、ISSR、
AFLP、SSR、SCAR等分子标记在作物种质资源多样性与系统发育分析 、品种指纹图谱绘制等
方面广泛应用。其中 , SSR(simplesequencerepeats,简单序列重复)标记因其数量丰富 、信息含
量高和重复性好等特点已被用于成功应用于高粱遗传图谱的构建和基因定位以及种间遗传多
样性的分析 [ 1, 2, 3] 。本文采用 SSR分子标记对 8份假高粱及其近似种样品进行分析 ,旨在搞清
其遗传多样性程度及其变异情况 ,揭示假高粱及其近似种间的遗传相似性和复杂性 ,检验该标
记在检测假高粱及其近似种亲缘关系的分辨力 ,为阐明其系统发育与进化等问题 ,积累资料 ,
提供试验依据 ,也为今后有效地鉴别这些物种提供分子基础 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
选用福建出入境检验检疫局杂草实验室多年来收集积累的种子材料 ,见表 1。
　第 24卷 武　夷　科　学 Vol.24　
2008年 12月 WUYISCIENCEJOURNAL Dec.2008
DOI :10.15914/j.cnki .wykx.2008.00.013
表 1　供试的假高粱及其近似种种类 、进口国及采集地
编号 种类 种子来源
1 假高粱 S.halepense(L.)Pers 福建出入境检验检疫局
2 黑高粱 S.almumParodi 中国检科院
3 拟高粱 S.propinguum(Kunth.)Hitche 福建出入境检验检疫局
4 明福一号 S.propinguum(Kunth.)Hitche(MingfuNo.1) 福建农林大学
5 苏丹草 S.sudanense(Pipes)Stapf 福建出入境检验检疫局
6 高丹草 S.HybridSudangras 福建出入境检验检疫局
7 二色高粱 S.bicolor(L.)Moench 福建出入境检验检疫局
8 甜高粱 S.bicolor(L.)Moench(sweetsorghum) 福建出入境检验检疫局
1.2　基因组 DNA提取
采用改良的 moler法[ 4]提取种子的基因组 DNA,并进行 DNA样品的浓度和纯度的测定。
取适量 DNA稀释为 50ng/ul备用。
1.3　SSR-PCR反应
本研究采用 Brown[ 5] , L.Kong[ 6] , Taramino[ 7]等为 S.bicolor设计的 11对 SSR引物(见表
2),上海生物工程公司合成 。从中筛选出 5对条带清晰 、多态性高 、重复性好的的引物进行分
析 。
SSR-PCR扩增反应体系经过比较和优化确定为 25ul的反应体积 ,内含:50ng模板 DNA,
10 ×PCRbufer(with15mMMgCl2)2.5ul, dNTP(10mM)0.5ul, Taq酶 1U, 引物各 5μM。
PCR反应在 ABI9700热循环仪上进行 , SSR-PCR反应程序为:94℃ 3min;94℃ 46s, 56℃
1min, 72℃ 1min;35cycle;72℃ 10min。
PCR产物采用 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,硝酸银染色。
表 2　供试SSR引物序列及其扩增出来的等位位点数目
引物名称 正向引物 反向引物 连锁群 退火温度
Xtxp8[ 6] 5 -ATATGGAAGGAAGAAGCCGG-3 5 -AACACAACATGCACGCATG-3 B 56℃
Xtxp43[ 6] 5 -AGTCACAGCACACTGCTTGTC-3 5 -AATTTACCTGGCGCTCTGC-3 A 58℃
SvPEPCAA[ 7] 5 -GCAGCTCAGGGACAAATAC-3 5 -CTGCTTCAGGTAAGGATCG-3 56℃
Xtxp25[ 6] 5 -CCATTGAGCTTCTGCTATCTC-3 5 -CATTTGTCACCACTAGAACCC-3 B 55℃
Sb1-10[ 5] 5 -GTGCCGCTTTGCTCGCA-3 5 -TGCTATGTTGTTTGCTTCTCCCTTCTC-3 D 55℃
1.4　数据统计与分析
取重复性好的扩增条带用于统计 ,在电泳图谱中 ,电泳迁移率一致的 DNA条带被认为是
具有同源性的。每一条带均为一个分子标记 ,代表一个引物结合位点。根据各分子标记的迁
移率及其有无来统计所得为点的二源数据:有带记为 “1”,无带记为 “0”,并对谱带进行拍照。
利用 POPGENE软件和 NTSYS软件计算群体间遗传分化系数(Gst)、遗传一致度(GI), GI=
2Nxy/(Nx+Ny),其中 Nxy为两基因型共同拥有的条带数目 , Nx和 Ny分别为 x和 y基因型各
自的条带数 。Nei s遗传距离(D),运用公式:D=1 -GI计算。根据遗传一致度(GI),按非加
权配对算数平均法(UPGMA)建立聚类系统分支树状图。
2　结果与分析
2.1　SSR标记的多态性
SSR分析结果表明 ,在 11对 SSR引物(表 2)中 ,有 5对位点扩增出多态性条带 ,其余 6对
·55·第 24卷 郭琼霞等:检疫性杂草假高粱及其近似种 SSR分子标记的遗传多样性
未扩增出清晰且重复性好的多态性带 , SSR标记的片断大小范围为 130 -600bp(表 3)。这 5
对 SSR引物共检测到 27条重复性高清晰的条带(图 1), 25条为多态性带 ,多态性比率为 92.
6%(表 4)。每对引物平均产生 5条多态性条带。
表 3　供试SSR引物扩增出来的等位位点数目
引物名称 总条带 多态性带数 片断大小 重复情况
Xtxp8 5 5 200 -600 (CT)14
Xtxp43 5 4 130 -540 (CT)28
SvPEPCAA 6 6 170 -400 (AT)10
Xtxp25 5 5 100 -400 (CT)12
Sb1-10 6 5 200 -600 (AG)27
表 4　SSR标记产生的带型分析
标记 引物对数 总带数 多态性比率 /% 每对引物产生带数 每对引物产生的多态性带数
SSR 5 27 92.6 5.4 5
图 1　SSR引物 Xtxp25(A)扩增假高粱及其近似种的 6%聚丙烯酰胺非变性胶电泳图
M.100bpDNALadder;1.S.halepense(L.)Pers;2.S.almumParodi;3.S.silk;4.S.propinguum(Kunth.)Hitche;
5.S.propinguum(Kunth.)Hitche(MingfuNo.1);6.S.sudanense(Pipes)Stapf;
7.S.HybridSudangrass;8.S.bicolor(L.)Moenchsweetsorghum;CK为清水对照。
2.2　SSR标记揭示的遗传多样性
SSR标记揭示出假高粱及其近缘种的遗传一致度 GI值变化范围在 0.4737 -0.8684之
间 ,平均值为 0.6362;假高粱和明福 1号的遗传一致度最低 ,拟高粱和明福 1号的遗传一致度
最高。遗传距离(D)的变化范围在 0.1411-0.7472之间 ,平均值为 0.4571(表 5)。
2.3　聚类分析揭示的遗传关系
基于 Nei s遗传距离 ,利用 NTSYS-pc(ver.2.1)软件中的 SHAN程序对供试的 8个高粱
属物种的遗传距离进行 UPGMA法聚类分析 。从 SSR分子标记得到的聚类树可以看出(图
2),这 8个高粱属物种共可分为 2个类群 , 7个亚类群。在遗传距离为 0.57时 ,可分为两大类
群 ,第 1类群是假高粱 、黑高粱 、拟高粱 、明福 1号 、苏丹草 、甜高粱 ,第 2类群是高丹草和二色
高粱。当遗传距离为 0.0.438时 ,类群 1又可分为两个亚类群 ,一类是假高粱 、黑高粱 、拟高
粱 、明福 1号 ,另一类是苏丹草和甜高粱;当遗传距离为 0.394时第 1亚类群可分为两个小亚
类群 ,一类即假高粱和黑高粱 ,另一类为拟高粱和明福 1号。上述结果映证了假高粱和黑高
·56· 武 夷 科 学 第 24卷　
粱 、拟高粱和明福 1号间的近缘关系 。
表 5　假高粱 、黑高粱及其近似种 SSR分析的遗传一致度(上三角)及遗传距离(下三角)
pop 1 2 3 4 5 6 7 8
1 ＊＊＊＊ 0.8684 0.6579 0.5789 0.4737 0.4737 0.5000 0.6316
2 0.1411 ＊＊＊＊ 0.7368 0.7105 0.6579 0.6053 0.6316 0.6579
3 0.4187 0.3054 ＊＊＊＊ 0.8684 0.6053 0.6579 0.6316 0.6579
4 0.5465 0.3417 0.1411 ＊＊＊＊ 0.6842 0.5789 0.6053 0.6842
5 0.5465 0.4187 0.5021 0.3795 ＊＊＊＊ 0.5263 0.5000 0.7368
6 0.7472 0.5021 0.4187 0.5465 0.6419 ＊＊＊＊ 0.7632 0.5263
7 0.6931 0.4595 0.4595 0.5021 0.6931 0.2703 ＊＊＊＊ 0.6053
8 0.4595 0.4187 0.4187 0.3795 0.3054 0.6419 0.5021 ＊＊＊＊
图 2　基于SSR标记的假高粱及其近似种聚类图
3　讨论
本文利用 5个 SSR标记对 8个假高粱及其近似种样品的遗传多样性进行研究 ,结果发现:
(1)用 5对 SSR引物可以检测到 27个等位变异 ,其中 25个为多态性位点 ,每对引物平均能检
测到 5个多态性位点 ,多态性位点百分率为 92.6%;(2)SSR结果揭示出所测 8个群体的 Gst
为 0.0864,说明本文研究的 8个 Sorghum属群体的遗传分化程度属于中度;(3)根据 SSR分析
的遗传距离进行 UPGMA聚类 ,种间及品种间遗传距离(D)变幅为 0.1411 -0.7472 ,平均值为
0.4571。苏丹草与甜高粱的遗传距离为 0.3054,与另一种二色高粱的遗传距离为 0.6931;高
丹草与二色高粱的遗传距离为 0.6419,其与二色高粱的遗传距离为 0.2703,与苏丹草和甜高
粱的遗传距离均为 0.6419,这些分析结果表明了苏丹草 、高丹草以及二色高粱之间的较复杂
的近缘关系 。据此认为 ,假高粱 、黑高粱及其近缘种种间与种内的遗传多样性及其进化的亲缘
关系较近 ,遗传变异较小 , SSR标记所得的遗传距离聚类结果与传统分类学研究的进化关系相
似但不完全相同 。
本研究中从 11对 SSR引物中筛选到 5对 SSR条带清晰 、重复性好的引物 ,分析结果显示
这些引物都可以扩增出多态性带谱 。从多态性位点比率上看 ,本文分析值为 92.6%,这再次
证明了 SSR分子标记能检测出较高的多态性 ,这可能是由于假高粱及其近似种基因组中的
SSR突变率较高 ,在 DNA复制过程中出现 SSR重复序列的滑动和不均等交换等现象 ,使他们
在不同材料或群体间的重复次数差异较大 ,而易引起引物结合位点和两结合位点之间的片断
长度差异。
·57·第 24卷 郭琼霞等:检疫性杂草假高粱及其近似种 SSR分子标记的遗传多样性
从引物的通用性来看 ,所选 SSR引物为 Brown, L.Kong, Taramino等为 S.bicolor设计的
SSR引物。在所选的 11对 SSR引物中 ,有 6对的条带在 6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图中
不是非常清晰 ,条带分辨率不高 ,而 Xtxp8、Xtxp43、SvPEPCAA、Xtxp25、Sb1 -105这 5对引物的
重复性和稳定性相对较好 ,可进行亲缘关系的统计分析 ,由此看出 ,所选 SSR引物的在假高粱
及其近似种间通用性还是较高的。
从 Nei s的遗传一致度的分析结果看 , SSR分子标记能体现出假高粱和黑高粱 、拟高粱和
明福 1号的遗传相似度很高 ,均为 0.8684(表 5)。其他物种间的遗传一致度与根据传统分类
的预测略有不同 。如甜高粱和另一种供试的二色高粱(样品 7)它们是同 1个种(S.bicolor)的
不同品种 ,但二者的遗传一致度仅为 0.6053。
遗传分化系数(Gst)代表群体间的分化程度 ,本研究中的分化系数代表假高粱 、黑高粱 、拟
高粱 、明福 1号 、苏丹草 、高丹草 、二色高粱 8个群体间的分化程度 。当 Gst值范围在 0.05-0.
15之间说明是中度分化 ,而当 Gst值范围在 0.15-0.25之间说明遗传分化程度很大。本研究
中 SSR的遗传分化系数是 0.0844,这说明不同种的 Sorghum属植物间的遗传分化程度属中
度 。
参　考　文　献
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SSRANALYSISOFGENETICDIVERSITYAMONG
QUARANTINEWEEDSORGHUMHALEPENSE
ANDRELEATEDSPECIES
GUOQiong-xia1 , YUYun1 , HUANGXian2 , ZHUANGRong3 , LILing2
(1.FujianEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau, Fuzhou350003, China;2.FujianAgri
cultrueandForestryUniversity, 3.FuzhouYan anMiddleSchool, China)
·58· 武 夷 科 学 第 24卷　
Abstract:　ThegeneticdiversityamongSorghumhalepenseand7 relatedspecieswasinvestigated
bysimplesequencerepeats(SSR)markers.Theresultsshowedthat:(1)5 outof11 SSRprimers
couldamplifythepolymorphicpaterns.Atotalof25 aleleshadbeenidentifiedinthesespecies.
EachpairofSSRprimercoulddetect5 alelesontheaverage.(2)Neighbor-joiningtreesbasedon
Nei sgeneticdistanceshowedthat:the8 Sorghumspeciesweredividedintotwogroupsand7 sub-
groups;therelationshipofS.halepenseandS.almumwasextremelyclosedasS.propinguumand
S.propinguum(MingfuNo.1).(3)Thevalueofdiferentiation(Gst=0.0864)indicatedthat
thereweremoderategeneticdiferentiationsamongthesespecies.
Keywords:　 Sorghumhalepense;relatedspecies;SSR;geneticdiversity
·59·第 24卷 郭琼霞等:检疫性杂草假高粱及其近似种 SSR分子标记的遗传多样性