全 文 ：西北林学院学报 ２０１３，２８（２）：８３～８９
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
　　ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－７４６１．２０１３．０２．１６
　收稿日期：２０１２－０７－０７　修回日期：２０１２－１０－１２
　基金项目：国家自然科学基金项目（３１０６００９５）。
　作者简介：黎丽倩，女，硕士研究生，主要研究方向：恢复生态学。Ｅ－ｍａｉｌ：３９５００５３９６＠ｑｑ．ｃｏｍ
＊通信作者：刘强，男，博士，教授，主要从事植物生态学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｎｓｙｌｑ＠１６３．ｃｏｍ
假臭草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与优化
黎丽倩，李妮亚，刘　强＊，王　婷，杨　丽，石俊菲
（热带动植物生态学省部共建教育部重点实验室 海南师范大学 生命科学学院，海南 海口５７１１５８）
摘　要：采用单因子试验、Ｌ１６（４５）正交试验设计，以假臭草ＤＮＡ为模板，研究了ＰＣＲ反应体系中
的５种主要成分，即 Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶、引物及模板，对假臭草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增结果的影响，并
对引物退火温度进行了筛选和优化。建立了假臭草ＩＳＳＲ最佳反应体系：在２０μＬ的反应体系中，
Ｍｇ２＋为２．０ｍｍｏｌ／Ｌ，模板 ＤＮＡ用量为６０ｎｇ，ＴａｑＤＮＡ聚合酶为１．５Ｕ，ｄＮＴＰｓ浓度为０．２
ｍｍｏｌ／Ｌ，引物浓度为０．３μｍｏｌ／Ｌ。假臭草ＩＳＳＲ反应体系的建立为利用该技术分析假臭草遗传多
样性及探索防控措施提供良好的基础。
关键词：假臭草；ＩＳＳＲ；反应体系；优化
中图分类号：Ｓ７２２．３３　　　文献标志码：Ａ　　　文章编号：１００１－７４６１（２０１３）０２－００８３－０７
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ　ｃａｔａｒｉｕｍ
ＬＩ　Ｌｉ－ｑｉａｎ，ＬＩ　Ｎｉ－ｙａ，ＬＩＵ　Ｑｉａｎｇ＊，ＷＡＮＧ　Ｔｉｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｌｉ，ＳＨＩ　Ｊｕｎ－ｆｅｉ
（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｆｏｒ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ａｎｉｍａｌ　ａｎｄ　Ｐｌａｎｔ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，
Ｈａｉｎａｎ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｉｋｏｕ，Ｈａｉｎａｎ５７１１５８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　５ｆａｃｔｏｒｓ（Ｍｇ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｄＮＴＰｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，Ｔａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｄｏｓ－
ａｇｅ，ｐｒｉｍｅｒ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅｓ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）ｏｎ　ＩＳＳＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｔｅｓｔｅｄ，ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｎ－
ｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｗａｓ　ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ　ｆｏｒ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｓｕｉｔａｂｌｅ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ
ｏｆ　Ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ　ｃａｔａｒｉｕｍｔｈｒｏｕｇｈ　ｓｉｎｇｌｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｔｅｓｔ　ａｎｄ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　ｄｅｓｉｇｎ　ｏｆ　Ｌ１６（４５）．Ｔｈｅ　ｒｅ－
ｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍａｌ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ（２０μＬ）ｃｏｎｔａｉｎｅｄ　２．０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｍｇ
２＋，６０ｎｇ　ＤＮＡ
ｔｅｍｐｌａｔｅ，１．５ＵＴａｑ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，２００μｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰｓ　ａｎｄ　０．３μｍｏｌ／Ｌ　ｐｒｉｍｅｒ．Ｔｈｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ
ｔｈｅ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｃｏｕｌｄ　ｌａｙ　ａ　ｆａｖｏｒａｂｌｅ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ
Ｅ．ｃａｔａｒｉｕｍａｎｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｓｔｒａｔｅｇｙ　ｆｏｒ　Ｅ．ｃａｔａｒｉｕｍ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ　ｃａｔａｒｉｕｍ；ＩＳＳＲ；ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
　　 假臭草又名猫腥草（Ｅｕｐａｔｏｒｉｕｍ　ｃａｔａｒｉｕｍ）或
（Ｐｒａｘｅｌｉｓ　ｃｌｅｍａｔｉｄｅａ　Ｒ．Ｍ．Ｋｉｎｇ）［１］，自２０世纪８０
年代首次发现于我国香港特别行政区的荒地、路边
及市区的假臭草［２］，属双子叶植物纲（Ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｅ－
ａｅ）菊目（Ａｓｔｅｒａｌｅｓ）菊科（Ｃｏｍｐｏｓｉｔａｅ）泽兰属（Ｅｕ－
ｐａｔｏｒｉｕｍ）植物。到了９０年代，开始在深圳被发现，
后来陆续在广州等其他地方也被发现 ［３］。目前，海
南分布的主要外来入侵植物共有９１种，其中假臭草
为最严重的入侵植物之一［４］。海南省２００４年首次
记录假臭草［５］，但之前可能已经生长并开始蔓延。
因其特有的生态、生理特性，如生态位宽度较大，且
与其他物种在生态位上都存在重叠［６］，说明它的适
应性极强，致使入侵后很快便存活下来，并在入侵地
成为优势单种，对入侵地带来了不可忽视的破坏，引
起生态多样性锐减，农业耕地面积减少，土壤肥力下
降等问题。邓世明［７］等对假臭草的黄酮类成分进行
研究，为其入侵机制提供基础。
ＩＳＳＲ又称简单重复序列区间扩增，是近年来发
展起来的一类新型的分子标记技术，具有无需知道
任何靶标序列的微卫星背景信息、遗传多态性高、检
测快速等特点［８－９］。因此，如果能将该技术用于外来
入侵物种遗传多样性的研究将带来突破性的发现，
对防范该物种的入侵取得重要进步。
对于假臭草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立和优化
研究鲜见报道，由于该方法是基于ＰＣＲ 的一种标
记，其反应条件同样易受到ＰＣＲ 反应各因素的影
响。为了确保假臭草ＩＳＳＲ分析结果的可靠性和重
复性，本研究通过单因素试验和反应参数正交试验
设计相结合的方式对假臭草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系进
行优化，以期为利用ＩＳＳＲ分子标记对不同地理来
源假臭草的遗传多样性分析，进而为假臭草的分布、
入侵路线及亲缘关系提供可靠的信息。
１　材料与方法
１．１　材料
假臭草样品采集于广东省３个不同的市县（鹤
山市、徐闻县、阳江市）及海南省５个不同市县（海
口、琼海、三亚、琼中、儋州）中生长的假臭草群落，每
个地区又在３个不同的采集地点分别采集２０个样
品，及每个地区采集６０个样。将采集到的假臭草新
鲜叶片放入封口袋中，转至－２０℃冰箱保存、备用。
１．２　方法
１．２．１　假臭草ＤＮＡ的提取　采用ＴＩＡＮＧＥＮ公
司的植物基因组提取试剂盒法从假臭草成熟叶片中
提取ＤＮＡ，操作按照说明书进行。
１．２．２　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的单因子试验　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
扩增反应体系的优化按常规采用单因素试验，共试
验了５个因素各８个水平。经初步筛选以引物
ＵＢＣ８５６（ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＹＡ）为优化试
验的引物。分别对 Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、Ｔａｑ酶、引物和模
板ＤＮＡ 浓度等５个因素进行梯度试验，筛选其合
适的使用浓度。在 Ｍｇ２＋ 浓度试验中设０．５、１．０、
１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０ｍｍｏｌ·Ｌ－１　８个梯度；
ｄＮＴＰ浓度试验中设０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、
０．３０、０．３５、０．４０ｍｍｏｌ·Ｌ－１　８个梯度；Ｔａｑ酶浓度
设０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０Ｕ／２０μＬ　８
个梯度；引物浓度设０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、
０．７、０．８μｍｏｌ·Ｌ
－１８个梯度；模板ＤＮＡ 浓度设５、
１０、２０、４０、６０、８０、１６０、３２０ｎｇ／２０μＬ　８个梯度。反
应程序为：９４℃预变性１０ｍｉｎ，然后按９４℃变性１
ｍｉｎ，５３℃退火３５ｓ，７２℃ 延伸７２ｓ，４０次循环；７２℃
延伸１０ｍｉｎ，４℃保存 ［１０］。
１．２．３　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反映因素水平的正交试验设计
　根据单因子试验结果，初步建立假臭草ＩＳＳＲ反
应体系各主要成分的适宜浓度范围，针对影响ＰＣＲ
反应的 Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰｓ、引物、Ｔａｑ酶和模板ＤＮＡ　５
个因素，选用Ｌ１６（４５）正交表在４个水平上进行试
验（表１）。ＰＣＲ反应体系总体积为２０μＬ。ＰＣＲ反
应程序同１．２．２。
１．２．４　ＩＳＳＲ引物的筛选与退火温度的确定　依据
上述试验的最优反应体系对退火温度进行优化，采
用梯度ＰＣＲ模式，自动设定温度从５０．５～５９℃，生
成的温度梯度为５０．５、５０．９、５１．３、５２．２、５３．２、５４．２
、５５．２、５６．２、５７．３、５８．１、５８．５、５９．０℃。通过引物的
Ｔｍ值，选取了５０．９、５２．２、５４．２、５５．２、５６．２、５８．１℃
６个较相近的温度作为引物退火温度的确定试验，
ＰＣＲ扩增程序同１．２．２。
表１　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ正交设计试验 （Ｌ１６（４５））
Ｔａｂｌｅ　１　Ｌ１６（４５）ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ　ｆｏｒ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
处理
组合
因素
Ｍｇ２＋
／（ｍｍｏｌ·
Ｌ－１）
Ｔａｑ酶
／（Ｕ·
２０μＬ－１）
引物
／（μｍｏｌ·
Ｌ－１）
模板ＤＮＡ
／ｎｇ
ｄＮＴＰ
／（ｍｍｏｌ·
Ｌ－１）
１　 １．５　 ０．５　 ０．３　 ５０　 ０．１
２　 １．５　 １．０　 ０．４　 １００　 ０．２
３　 １．５　 １．５　 ０．５　 １５０　 ０．３
４　 １．５　 ２．０　 ０．６　 ２００　 ０．４
５　 ２．０　 ０．５　 ０．４　 １５０　 ０．４
６　 ２．０　 １．０　 ０．３　 ２００　 ０．３
７　 ２．０　 １．５　 ０．６　 ５０　 ０．２
８　 ２．０　 ２．０　 ０．５　 １００　 ０．１
９　 ２．５　 ０．５　 ０．５　 ２００　 ０．２
１０　 ２．５　 １．０　 ０．６　 １５０　 ０．１
１１　 ２．５　 １．５　 ０．３　 １００　 ０．４
１２　 ２．５　 ２．０　 ０．４　 ５０　 ０．３
１３　 ３．０　 ０．５　 ０．６　 １００　 ０．３
１４　 ３．０　 １．０　 ０．５　 ５０　 ０．４
１５　 ３．０　 １．５　 ０．４　 ２００　 ０．１
１６　 ３．０　 ２．０　 ０．３　 １５０　 ０．２
２　结果与分析
２．１　假臭草ＤＮＡ提取结果
从图１的琼脂糖凝胶电泳图中可以看出，所提
取的２０个ＤＮＡ样的主带都较清晰，迁移率低，排
列整齐，完整性好，无明显降解现象，点样孔基本无
滞留，能满足ＩＳＳＲ分析的要求。
２．２　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的单因素试验分析
２．２．１　Ｍｇ２＋浓度对ＩＳＳＲ扩增的影响　本试验设
立了０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０ｍｍｏｌ·
Ｌ－１（由左至右）８个浓度梯度。扩增结果表明（图
２－Ａ），当 Ｍｇ２＋浓度为０．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１时扩增谱带
不明显，Ｍｇ２＋浓度为１．０～３．０ｍｍｏｌ·Ｌ－１时都有
扩增条带出现，但 Ｍｇ２＋浓度为１．０ｍｍｏｌ时，扩增
条带较弱，不清晰，当Ｍｇ２＋为１．５、２．０、２．５ｍｍｏｌ·
４８ 西北林学院学报 ２８卷　
Ｌ－１时扩增的谱带清晰、完全，Ｍｇ２＋ 浓度为３．０、
３．５、４．０ｍｍｏｌ·Ｌ－１时有一定的弥散和拖尾现象。
再比较１．５、２．０、２．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１的条带，浓度２．０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１的 Ｍｇ２＋的条带更清晰、完全。因此，本
试验选用 Ｍｇ２＋浓度２．０ｍｍｏｌ·Ｌ－１为ＩＳＳＲ的扩
增参数。
注：１～２０为不同样地的ＤＮＡ，Ｍ为标准分子。
图１　用试剂盒提取的鹤山地区２０个样的ＤＮＡ
Ｆｉｇ．１　２０ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ｉｎ　Ｈｅｓｈａｎ　ｂｙ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ
注：Ａ：不同 Ｍｇ２＋浓度对假臭草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果的影响１－８，Ｍ．标准分子量（表３同）；Ｂ：不同ｄＮＴＰ浓度对假臭草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果
的影响，１－８．从低到高的不同浓度水平；Ｃ：不同Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶浓度对假臭草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ扩增效果的影响；Ｄ：不同引物浓度对假臭草ＩＳ－
ＳＲ－ＰＣＲ扩增效果的影响。
图２　假臭草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系优化的ＰＣＲ扩增结果
Ｆｉｇ．２　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ　ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ａｂｏｕｔ　ｐｒａｘｅｌｉｓ
２．２．２　ｄＮＴＰ浓度对ＩＳＳＲ扩增的影响　ｄＮＴＰｓ
参与新链ＤＮＡ的合成，它的大小与ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的
扩增条带数及清晰度密切相关。本试验设计了８个
ｄＮＴＰｓ浓度梯度：０．０５、０．１０、０．１５、０．２０、０．２５、
０．３０、０．３５、０．４０ｍｍｏｌ·Ｌ－１（由左至右），试验结果
显示（图２－Ｂ），当浓度为０．０５ｍｍｏｌ·Ｌ－１时，基本
没有条带出现；当浓度为０．１０、０．１５ｍｍｏｌ·Ｌ－１时，
扩增条带较弱；当浓度为０．２０～０．２５ｍｍｏｌ·Ｌ－１
５８第２期 黎丽倩 等：假臭草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与优化
时，出现的条带清晰、整齐，随着浓度的增加；当
ｄＮＴＰ为０．３０～０．３５ｍｍｏｌ·Ｌ－１时，条带开始变弱，
变少；当为０．４ｍｍｏｌ·Ｌ－１时，出现了弥散现象。所
以本试验ｄＮＴＰ的最适宜浓度为０．２ｍｍｏｌ·Ｌ－１。
２．２．３　Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶浓度对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ的影响
　Ｔａｑ酶对扩增结果影响较大，当 Ｔａｑ酶量过低，
ＰＣＲ反应的敏感性差，扩增产物少；Ｔａｑ酶量过高
扩增反应的特异性降低，产生大量的弥散片断，形成
很亮的背景。如（图２－Ｃ）显示，浓度由左至右分别
为０．５，１．０，１．５，２．０，２．５，３．０，３．５，４．０Ｕ，当Ｔａｑ
酶为０．５、１．０Ｕ时，条带太弱，不易辨别；当Ｔａｑ酶
为１．５～４．０Ｕ时均有条带出现。但从２．０Ｕ开始
它们的条带都开始有弥散现象，相比较而言，在１．５
Ｕ时比较的清晰整齐。故本试验 Ｔａｑ酶的最适宜
浓度为１．５Ｕ。
２．２．４　模板 ＤＮＡ量对ＩＳＳＲ扩增的影响　结果
（图３－Ａ）显示模板用量从５、１０、２０、４０、６０、８０、１６０
到３２０ｎｇ，均有条带出现，出５ｎｇ时条带模糊外，其
他基本都较整齐，由此可知，ＩＳＳＲ扩增对模板浓度
不太敏感，适宜范围较宽。
２．２．５　引物浓度对ＩＳＳＲ带的影响　如图（２－Ｄ），
由左至右０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８
μｍｏｌ·Ｌ
－１这８个浓度的引物都有扩增条带出现，
当浓度较低时，扩增强度弱，条带不清晰；浓度为０．３
～０．４μｍｏｌ·Ｌ
－１时，条带明显；当浓度为０．５～０．８
μｍｏｌ·Ｌ
－１时，虽也有条带出现，但开始逐渐变模
糊，出现弥散现象。因此将本试验引物的适宜浓度
确定在０．３μｍｏｌ·Ｌ
－１。
２．３　ＰＣＲ正交试验设计直观分析
由于ＰＣＲ各因子之间存在交互作用，单因素试
验筛选ＩＳＳＲ－ＰＣＲ各成分适宜浓度的任意组合并不
一定能扩增出理想条带。本研究在单因子试验的基
础上，设计 Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰｓ、引物、模板和Ｔａｑ酶５因
素４水平的正交试验建立了适合假臭草ＩＳＳＲ分子
标记的反应体系（表１）。根据正交试验Ｌ１６（４５）
表，进行了正交反应体系的优化（图３－Ｂ），Ｌ１６（４５）
正交试验结果显示不同引物ＩＳＳＲ－ＰＣＲ各成分适宜
浓度组合存在一定的差异，仔细比较这１６条泳道。
可以直观看出第７条泳道出现的条带数较多、清晰、
整齐。且该泳道组合与单因素试验的结果也吻合。
为此选用第７个组合确定为最佳反应体系：在２０
μＬ的反应体系中，Ｍｇ
２＋２．０ ｍｍｏｌ·Ｌ－１，模板
ＤＮＡ用量为６０ｎｇ，Ｔａｑ酶为１．５Ｕ，ｄＮＴＰｓ浓度
为２００μｍｏｌ／Ｌ，引物浓度为０．３μｍｏｌ·Ｌ
－１。
２．４　引物筛选结果及退火温度的确定
退火温度明显影响扩增谱带式样。它不仅与引
注：图３－Ａ：不同浓度模板ＤＮＡ量对ＩＳＳＲ扩增的影响，图３－Ｂ：
正交试验ＰＣＲ产物电泳结果，１－１６．不同处理组合，Ｍ．标准分
子。
图３　假臭草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系建立和
优化的ＰＣＲ扩增结果
Ｆｉｇ．３　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ
ａｎｄ　ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ
物序列有关，而且还与物种的序列有密切关系。本
研究采用优化后的反应体系为试验条件，对委托上
海生物工程技术服务有限公司合成的６０条引物同
时进行退火温度优化和有效引物筛选。６个退火温
度下ＰＣＲ 扩增的结果见图４，从图中可以看出，退
火温度对假臭草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应的影响很大。以引
物ＵＢＣ－８５６为例：当退火温度为５０．９～５４．２℃时，
产生的条带较为清晰、一致，当退火温度为５５．２～
５８．１℃时，条带虽清晰，但不稳定，相比较而言，当退
火温度为５４．２℃时，条带数较多且清晰，所以引物
ＵＢＣ－８５６的最佳退火温度为５４．２℃。又如引物
ＵＢＣ－８８１：当退火温度为５０．９～５６．２℃时，产生的
条带数逐渐增多但是条带模糊，当退火温度为
５８．１℃时，条带数明显减少，而当退火温度为５６．２℃
时条带数较为清晰且条带数最多。因此，ＵＢＣ－８８１
的最佳退火温度为５６．２℃。再如引物ＵＢＣ－８４４（图
略），由于无条带扩增出来，故ＵＢＣ－８４４不是假臭草
的有效引物。
２．５　ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系稳定性的检测
根据上述假臭草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系建立和优
化的试验结果，采用最佳反应体系，对徐闻样区假臭
草的６０个样本进行ＰＣＲ扩增（图５），可以看出均
６８ 西北林学院学报 ２８卷　
注：泳道１～６分别表示６个不同的退火温度：５０．９、５２．２、５４．２、５５．２、５６．２、５８．１℃，Ｍ：标准分子，
Ａ～Ｆ分别代表引物ＵＢＣ８１０、ＵＢＣ８１７、ＵＢＣ８８１、ＵＢＣ８５６、ＵＢＣ８５５、ＵＢＣ８４７。
图４　引物筛选结果及退火温度
Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｎｎｅａｌｉｎｇ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
能扩增出较清晰的条带且稳定性很好，表明通过优
化试验筛选出的反应体系稳定和重复性好，适合于
假臭草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应。
３　讨论
３．１　ＩＳＳＲ反应体系中几个主要成分对ＰＣＲ反应
稳定性的影响
本研究以假臭草ＤＮＡ为模板，采用了单因子
试验和正交试验２种方法对ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系进
行优化。这２种方法的试验结果都显示ＰＣＲ产物
的质量和生成都主要受这一反应体系中 Ｍｇ２＋ 浓
度、ｄＮＴＰｓ、Ｔａｑ酶、假臭草 ＤＮＡ模板和引物这５
个主要因子及其浓度的影响。
Ｍｇ２＋浓度对ＰＣＲ扩增的特异性和产量有显著
影响，Ｍｇ２＋浓度过高，容易产生非特异性扩增，而过
低会降低扩增率，甚至不出现扩增条带。Ｍｇ２＋还能
跟反应液中的模板ＤＮＡ及引物结合，影响引物与
模板的结合效率，模板与产物的解链温度以及产物
的特异性和引物二聚体的形成［１１］。不同引物和模
板的最适 Ｍｇ２＋浓度都不同，对于假臭草ＩＳＳＲ反应
体系 Ｍｇ２＋浓度在１．５～２．０ｍｍｏｌ·Ｌ－１这一范围
扩增效果比较好。本研究得到的 Ｍｇ２＋优化浓度为
２．０ｍｍｏｌ·Ｌ－１也证实了这一点。
ｄＮＴＰｓ作为ＰＣＲ反应的原料，量太少会影响扩
增反应的稳定性，使扩增不完全，量太多可能出现非
特性扩增，本研究初步确定ｄＮＴＰｓ的最适宜浓度为
０．２ｍｍｏｌ·Ｌ－１。Ｔａｑ酶用量是影响ＰＣＲ反应的重
要因子，酶量过多不仅增加试验成本，而且会导致非
特异性扩增产物的增加，反之酶量过低则会引起ＰＣＲ
扩增量的不足，本试验Ｔａｑ酶用量确定为１．５Ｕ。
　　 从单因子的试验中可以看出模板ＤＮＡ的量对
扩增影响不是很大，ＩＳＳＲ扩增对模板的范围较宽。
引物与模板ＤＮＡ结合的程度和结合量是影响ＰＣＲ
扩增产率和稳定性的主要因子，引物浓度过低会影
响ＰＣＲ扩增的稳定性，使得扩增不完全，浓度过高
则会产生非特异性扩增，本试验将引物的适宜浓度
７８第２期 黎丽倩 等：假臭草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与优化
注：１～６０为徐闻地区６０个模板扩增结果，Ｍ：标准分子
图５　引物ＵＢＣ８９１对徐闻地区假臭草的扩增结果
Ｆｉｇ．５　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒ　ＵＢＣ８９１ｏｎ　ＩＳＳＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｘｕｗｅｎ
确定为０．３μｍｏｌ·Ｌ
－１。
３．２　单因子试验与正交试验的优化比较
目前常用于ＩＳＳＲ试验条件优化的方法有２
种，即单因子优化和正交试验优化。正交试验优化
设计具有均衡分散、综合可比及可伸可缩、效应明确
的特性，可了解各因素之间的内在规律，较快地找到
最佳的水平组合［１２］。但正交试验不能很好地估计
试验误差，对结果的评价带有一定的主观成分，使各
因素最佳反应水平缺乏可靠性。大多数研究在设计
正交试验因子水平时，是参考其他类似物种ＩＳＳＲ－
ＰＣＲ反应体系的报道［１３－１４］。为获得理想的试验体
系，试验者一般会多次调整因子浓度水平致使正交
试验变得繁琐。采用单因子ＰＣＲ优化设计对各个
影响因素逐一进行研究，对最佳水平的确定更直观，
但单因子试验不能兼顾各成分之间的交互作用［１５］，
因此单因素试验筛选ＩＳＳＲ－ＰＣＲ各成分适宜浓度的
任意组合并不一定能扩增出理想条带。本研究先是
利用单因子试验建立假臭草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系中
主要成分的适宜浓度范围，再设计正交试验确立最
适ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系。
３．３　ＩＳＳＲ在部分入侵植物遗传多样性分析中的应用
ＩＳＳＲ标记符合孟德尔遗传规律，具有良好的遗
传稳定性和多态性；遗传多态性高［１６］。因此，ＩＳＳＲ
分子标记在研究物种的遗传多样性和遗传结构等方
面已经获得了广泛的应用［８－９］。Ｗ．Ｈ．Ｙｅ［１７］等运用
ＩＳＳＲ技术对中国２７个飞机草（Ｃｈｒｏｍｏｌａｅｎａ　ｏｄｏ－
ｒａｔａ）种群的遗传结构研究表明，所有种群的遗传
变异都很低，多态位点比率为０％～７．６９％，平均
２．３５％。在不同地域和生境广布的假臭草种群可能
有具较高的遗传多样性，通过遗传分化机制适应多
变的生境。Ｗａｎｇ［１０］等采用ＩＳＳＲ标记技术对华南
２８个薇甘菊（Ｍｉｋａｉｎａ　ｍｉｃｒａｎｔｈａ为假臭草的同科
植物）种群的遗传结构进行分析，发现无性繁殖是主
导的繁殖方式，种群遗传结构未受到无性繁殖的影
响。从试验结果可以看出，利用优化后的假臭草
ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系，对广州徐闻地区３种生境假
臭草的６０个样本进行ＰＣＲ 扩增，获得了较好的结
果（图５），为下一步进行假臭草遗传多样性和遗传
结构分析提供试验基础。
４　结论
根据本试验的结果，最终筛选出了假臭草ＩＳ－
ＳＲ－ＰＣＲ的最佳的稳定的反应体系，即在２０μＬ的
反应体系中，Ｍｇ２＋ 为２．０ｍｍｏｌ·Ｌ－１，模板 ＤＮＡ
８８ 西北林学院学报 ２８卷　
用量为６０ｎｇ，Ｔａｑ酶为１．５Ｕ，ｄＮＴＰｓ浓度为２００
μｍｏｌ·Ｌ
－１，引物浓度为０．３μｍｏｌ·Ｌ
－１扩增程序：
９４℃预变性１０ｍｉｎ，然后按９４℃变性１ｍｉｎ，５０．９
～５６．２℃退火３５ｓ，７２℃ 延伸７２ｓ，４０次循环；７２
℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保存。通过反应体系稳定性检
测表明，本试验建立的假臭草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系
稳定可靠，该研究为进一步利用ＩＳＳＲ 分子标记技
术进行假臭草遗传多样性分析奠定了基础。
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９８第２期 黎丽倩 等：假臭草ＩＳＳＲ－ＰＣＲ反应体系的建立与优化