全 文 ：2种羊蹄甲植物花粉生活力快速测定
邓旭1 ,2 ,付 辉2 ,谭济才1　
(1.湖南农业大学生物安全科技学院 ,湖南长沙 411128;2.玉林师范学院化学与生物系 ,广西玉林 537000)
摘要　对红花羊蹄甲、宫粉羊蹄甲 2种植物的花粉生活力进行测定。选用染色法(1%TTC液染色法、1%醋酸洋红液染色法、I-KI染色
法)和无机酸(0.8 mol/L硝酸)处理 ,测定羊蹄甲属花粉生活力。结果表明 , 1%醋酸洋红、1% TTC液染色法、0.8 mol/ L硝酸处理法测定
羊蹄甲属植物的花粉生活力都是快速有效的。
关键词　羊蹄甲属植物;花粉生活力;检测方法
中图分类号　S 685.99　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)19-08071-03
Quick Determination on Pollen Viability of Two Kinds of Bauhinia Plants
DENG Xu et al　(College of Bio-safety Science and Technology , Hunan Agricultural University, Changsha , Hunan 411128)
Abstract　 The pollen viability of two kinds of plants of B.blakeana and B.variegata were determined.The staining methods(1% TTC , 1% acetic
acid carmine liquid , I-KI)was selected and treated with the inorganic acid(0.8 mol/L nitric acid)to determine the pollen viability of Bauhinia.The re-
sult showed that the stainingmethods of 1% acetic acid carmine liquid, 1% TTC and the treatment method of 0.8mol/Lnitric acidwere all the quick and
effective methods for determination on the pollen viability of Bauhinia plant.
Key words　 Bauhinia plant;Pollen viability;Determination method
作者简介　邓旭(1971-),女 ,湖南醴陵人 ,在读博士 ,副教授 ,从事园
艺植物栽培及虫害生物防治的研究。
收稿日期　2008-05-04
　　羊蹄甲为苏木科羊蹄甲属多年生乔木 ,学名 Baubinia ,
该属植物主要包括红花羊蹄甲(B.blakeana);宫粉洋紫荆
(B .variegata);白花羊蹄甲(B .acuminata)等 ,主要分布于我
国广东 、广西 、云南 、福建等省。羊蹄甲在秋冬季节开花 ,花
期长 ,花色鲜艳夺目 ,叶形奇 ,是我国热带和亚热带地区园林
中的优良观赏花木[ 1-2] 。另据报道羊蹄甲在某些地区作为
野菜食用 ,还可从中提取多种化学成分[ 3-5] 。羊蹄甲属植物
的繁殖一般采用种子播种 ,花粉的生活力是种子形成的关
键。关于羊蹄甲属植物花粉生活力的研究尚未见报道 ,笔者
采用多种方法对蕾期与盛花期的花粉生活力进行快速测定。
1　材料与方法
1.1　试验材料　①材料采集 。红花羊蹄甲(B .blakeana)(图
1)、宫粉羊蹄甲(B .variegata)(图 2)2种植物均采自玉林市郊
和睦村 ,选取带有花蕾的枝条 。②材料预处理。蕾期花粉的
图1　红花羊蹄甲　　　　　图 2　宫粉羊蹄甲
Fig.1　Bauhinia blakeana　　Fig.2　Bauhinia variegata
获得 ,将采集来的花蕾剥开 ,用镊子将花药取下放入干燥培
养皿中 ,然后放入 25～ 28 ℃恒温箱中 6～ 8 h ,干燥散粉[ 6-9] ;
盛花期花粉的获得 ,将采回的含苞待放的花蕾在实验室培养
到花朵完全开放 ,按上述方法采集花粉备用。 ③仪器。玻
片 ,培养皿 ,显微镜 ,恒温培养箱 ,电子天平 ,滴瓶 ,烧杯 ,移液
管 ,解剖显微镜 ,倒置生物显微镜。 ④药品。TTC 液(浓度
1%),醋酸洋红(浓度 1%),硝酸(浓度 0.8 mol/L),碘 ,碘
化钾 。
1.2　试验方法　①醋酸洋红染色法 。将预处理好的花粉分
装在已编号的凹玻片中 ,滴加 1 ～ 2 滴醋酸洋红液染色 15
min ,在显微镜下观察其染色情况。每次染色制作 3个玻片 ,
重复 3次 ,每片玻片每次检查统计 30个花粉粒 ,检查 3次 ,根
据染色程度的不同分别记数 ,计算出花粉生活力。②TTC
(2 ,3 , 5-氯代三苯基四氮唑)染色法。取 1 g TTC 固体结晶溶
于 99ml的蒸馏水配制成 1%的TTC液 ,染色时取少数预处理
好的花粉置于已编号的载玻片上 ,滴加 1～ 2滴TTC溶液 ,盖
上盖玻片 ,室温下放置 15～ 20min ,在显微镜下观察。每次染
色制作 3个玻片 ,重复 3次 ,每片玻片每次检查统计 30个花
粉粒 ,检查 3次 ,根据染色程度的不同分别记数 ,计算出花粉
生活力。③I-KI染色法。取 1.3 g KI溶于水 ,加 0.3 g碘结晶
定容至 100ml ,取少量预处理好的花粉置于编号的凹玻片上 ,
滴上 1～ 2滴 I-KI ,在 30 ℃培养箱中培养 30 min ,置于相差显
微镜下观察 ,每次染色制作 3个玻片 ,重复 3次 ,每片玻片每
次检查统计 30个花粉粒 ,检查 3次 ,根据染色程度的不同分
别记数 ,计算出花粉生活力。④无机酸(硝酸)处理 。取少量
预处理好的花粉分装在已编号的凹玻片中 ,滴上 1～ 2滴硝
酸(0.8 mol/L)。在 10min内置于显微镜下观察 ,每次处理制
作 3个玻片 ,重复 3次 ,每片玻片每次检查统计 30个花粉粒 ,
检查 3次 ,根据是否形成瞬时的花粉管 ,分别记数 ,计算出花
粉生活力。
2　结果与分析
2.1　醋酸洋红染色法　用醋酸洋红液染色 15 min后镜检 ,
没有生活力的花粉或败育的花粉被染成红色(图 3),有生活
力的花粉则不会被染色(图 4),重复 3次 ,结果见表 1 、2。
　　从表 2可知 ,盛花期羊蹄甲的花粉很多容易被醋酸洋红
染色 ,红花羊蹄甲的花粉的平均生活力为 9.9%,宫粉羊蹄甲
的为 10.5%;蕾期红花羊蹄甲的花粉的平均生活力为
56.6%,宫粉羊蹄甲花粉的平均生活力为 53.2%。2种植物
的花粉生活力很接近 ,差异不大 。这说明了盛花期的花粉生
安徽农业科学, Journal of Anhui Agri.Sci.2008 , 36(19):8071-8073 ,8111　　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　庆 　责任校对　卢瑶
注:a为红花羊蹄甲(B .blakeana);b为宫粉羊蹄甲(B .variegata),
下同。
Note:a stands for B.blakeana;b stands for B .variegata.The same as
below.
图3　被醋酸洋红染色的花粉
Fig.3　Pollens with acetic acid magenta staining
活力相对较差 ,蕾期花粉生活力则高出了很多。结果表明 ,
用醋酸洋红染色来快速测定这 2种羊蹄甲花粉生活力是可
行的 。
2.2　TTC染色法　用TTC染色 15～ 20min后镜检 ,凡被染
图 4　未被醋酸洋红染色的花粉
Fig.4　Pollens without acetic acid magenta staining
表 1　醋酸洋红对花粉染色结果的比较
Table 1　The comparison of pollen stained with acetic acid magenta
植物
Plant
花粉
Pollen
分项
Subentry
03-19
1组 2组 3组
03-20
1组 2组 3组
03-26
1组 2组 3组
红花羊蹄甲 盛花期 染色 Stained∥个 　79.0 　79.0 　77.0 　83.0 　83.0 　82.0 　83.0 　82.0 　 82.0
B.blakeana Full-blooming 未染色Unstained∥个 11.0 11.0 13.0 7.0 7.0 8.0 7.0 8.0 8.0
stage 生活力Viability∥% 12.2 12.2 14.3 7.8 7.8 8.9 7.8 8.9 8.9
蕾期 染色 Stained∥个 43.0 39.0 45.0 35.0 36.0 42.0 32.0 37.0 43.0
Bud stage 未染色Unstained∥个 47.0 51.0 45.0 55.0 54.0 48.0 58.0 53.0 47.0
生活力Viability∥% 52.2 56.7 50.0 61.1 60.0 53.3 64.4 58.9 52.2
宫粉羊蹄甲 盛花期 染色 Stained∥个 79.0 81.0 77.0 83.0 80.0 82.0 80.0 79.0 84.0
B.variegata Full-blooming 未染色Unstained∥个 11.0 9.0 13.0 7.0 10.0 8.0 10.0 11.0 6.0
stage 生活力Viability∥% 12.2 10.0 14.3 7.8 11.1 8.9 11.1 12.2 6.7
蕾期 染色 Stained∥个 44.0 42.0 46.0 43.0 39.0 44.0 40.0 40.0 41.0
Bud stage 未染色Unstained∥个 46.0 48.0 44.0 47.0 51.0 46.0 50.0 50.0 49.0
生活力Viability∥% 51.1 53.3 48.9 52.2 56.7 51.1 55.6 55.6 54.4
表 2　不同日期醋酸洋红染色的花粉生活力比较
Table 2　The viabilitiy comparison of pollen stained with nitric acid magenta
at different date %
植物 Plant 花粉 Pollen 03-19 03-20 03-29
红花羊蹄甲 盛花期 　12.9 　 8.2 　　8.5
B.blakeana Full-blooming stage
蕾期 Bud stage 52.9 58.1 58.5
宫粉羊蹄甲 盛花期 12.2 9.3 10.0
B.variegata Full-blooming stage
蕾期 Bud stage 51.1 53.3 55.2
成红色的花粉(图 5),其生活力较强 ,淡红色次之 ,无色的为
不具活力的花粉或不育花粉(图 6),重复 3次 ,结果见表 3、4。
图5　被 TTC染色的花粉
Fig.5　Pollens stained with TTC
　　从表 4可知 ,2种羊蹄甲的花粉都能被TTC 染色 ,但不同
时期的花粉染色效果有明显的差异 。蕾期花粉都很容易被
TTC染色 ,盛花期的花粉相对难染色 ,且染色时间要达 20
min 。结果表明 ,盛花期红花羊蹄甲花粉的平均生活力为
10.3%,宫粉羊蹄甲的为 10.7%,蕾期红花羊蹄甲花粉的平均
生活力为 51.7%,宫粉羊蹄甲的为 53.2%。这 2种植物各期
花粉生活力都很接近 ,这说明了红花羊蹄甲和宫粉羊蹄甲的
花粉生活力随着花朵的开放而降低。结合试验结果和显微
镜观察 ,用TTC染色来快速测定羊蹄甲花粉生活力是可行的
方法。
图 6　没有被 TTC染色的花粉
Fig.6　Pollens without TTC staining
2.3　I-KI染色法　用 I-KI处理培养 30min后在相差显微镜
下观察 ,未观察到花粉被染色成蓝黑色或淡蓝色 ,即没有观
察到明显的试验现象 , I-KI 染色法不适合用来快速测定花粉
生活力。
2.4　无机酸(硝酸)处理　用硝酸处理 10min后镜检 ,有生活
力的花粉胞质内含物会喷射出来会形成瞬时的花粉管(图
7),没有生活力的花粉或败育的花粉胞质内含物则不会喷射
出来 ,从而不会长出花粉管(图 8),重复 3次 ,结果见表 5、6。
8072 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年
表 3　TTC对花粉染色结果的比较
Table 3　The comparison of pollen stained with TTC
植物 Plant 花粉 Pollen 分项
Subentry
03-21
1组 2组 3组
03-23
1组 2组 3组
03-29
1组 2组 3组
红花羊蹄甲 盛花期 染色Stained∥个 　8.0 　14.0 　14.0 　 7.0 　 7.0 　 8.0 　 9.0 　 9.0 　 7.0
B.blakeana Full-bloom- 未染色Unstained∥个 82.0 76.0 76.0 83.0 83.0 82.0 81.0 81.0 83.0
ing stage 生活力Viabi lity∥% 8.9 15.6 15.6 7.8 7.8 8.9 10.0 10.0 7.8
未开放 染色Stained∥个 48.0 48.0 46.0 44.0 48.0 48.0 45.0 47.0 45.0
Unopened 未染色Unstained∥个 42.0 42.0 44.0 46.0 42.0 42.0 45.0 43.0 45.0
生活力Viabi lity∥% 53.3 53.3 51.1 48.9 53.3 53.3 50.0 52.2 50.0
宫粉羊蹄甲 盛花期 染色Stained∥个 9.0 13.0 13.0 7.0 9.0 8.0 10.0 11.0 7.0
B.variegata Full-bloom- 未染色Unstained∥个 81.0 77.0 77.0 83.0 81.0 82.0 80.0 79.0 83.0
ing stage 生活力Viabi lity∥% 10.0 14.3 14.3 7.8 10.0 8.9 11.1 12.2 7.8
未开放 染色Stained∥个 46.0 48.0 44.0 47.0 51.0 46.0 50.0 50.0 49.0
Unopened 未染色Unstained∥个 44.0 42.0 46.0 43.0 39.0 44.0 40.0 40.0 41.0
生活力Viabi lity∥% 51.1 53.3 48.9 52.2 56.7 51.1 55.6 55.6 54.4
表4　不同日期 TTC染色的花粉生活力比较
Table 4　Viability comparison of pollens with TTC staining at different data
%
植物 Plant 花粉 Pollen 03-21 03-23 03-29
红花羊蹄甲 盛花期 　13.4 　 8.2 　　9.3
B.blakeana Full-blooming stage
蕾期 Bud stage 52.6 51.8 50.7
宫粉羊蹄甲 盛花期 12.9 8.9 10.4
B.variegata Full-blooming stage
蕾期 Bud stage 51.1 53.3 52.2
图 7　硝酸处理长出花粉管的花粉
Fig.7　Pollens with pollen tube after treatment with nitric acid
表 5　硝酸处理花粉长出花粉管结果的比较
Table 5　The results comparison of pollen with pollen tube after treatment with nitric acid
植物
Plant
花粉
Pollen
分项
Subentry
03-30
1组 2组 3组
04-02
1组 2组 3组
04-06
1组 2组 3组
红花羊蹄甲 盛花期 花粉管∥个 　9.0 　14.0 　14.0 　 7.0 　10.0 　 6.0 　11.0 　11.0 　　9.0
B.blakeana Full-bloom- 无花粉管∥个 81.0 76.0 76.0 83.0 80.0 84.0 79.0 79.0 81.0
ing stage 生活力∥% 10.0 14.3 14.3 7.8 11.1 6.7 12.2 12.2 10.0
蕾期 花粉管∥个 47.0 49.0 49.0 49.0 52.0 52.0 49.0 52.0 51.0
Bud stage 无花粉管∥个 43.0 41.0 41.0 41.0 38.0 38.0 41.0 38.0 39.0
生活力∥% 52.2 54.4 54.4 54.4 57.8 57.8 54.4 57.8 55.6
宫粉羊蹄甲 盛花期 花粉管∥个 9.0 12.0 11.0 11.0 10.0 10.0 12.0 12.0 9.0
B.variegata Full-bloom- 无花粉管∥个 81.0 78.0 79.0 79.0 80.0 80.0 78.0 78.0 81.0
ing stage 生活力∥% 10.0 13.3 12.2 12.2 11.1 11.1 13.3 13.3 10.0
蕾期 花粉管∥个 47.0 52.0 48.0 51.0 52.0 51.0 47.0 49.0 46.0
Bud stage 无花粉管∥个 43.0 38.0 42.0 39.0 38.0 39.0 43.0 41.0 44.0
生活力∥% 52.2 57.8 53.3 56.7 57.8 56.7 52.2 54.4 51.1
表 6　不同日期硝酸处理花粉生活力比较
Table 6　Comparison of pollen viabilities treated with nitric acid at different
date %
植物 Plant 花粉 Pollen 03-30 04-02 04-06
红花羊蹄甲 盛花期 12.9 　　8.5 11.5
B.blakeana Full-blooming stage
蕾期 Bud stage 53.7 56.7 55.9
宫粉羊蹄甲 盛花期 11.8 11.8 12.2
B.variegata Full-blooming stage
蕾期 Bud stage 54.4 57.1 52.6
　　从表 5、6可知 ,盛花期红花羊蹄甲花粉的平均生活力为
10.9%,宫粉羊蹄甲为 11.9%,蕾期红花羊蹄甲花粉的平均生
活力为 55.4%,宫粉羊蹄甲为 54.6 %,这说明了 2种羊蹄甲
的花粉生活力在开花之后生活力降低 ,与前面几种染色法的
数据比较接近。结合试验结果和观察来看 ,用无机酸(硝酸)
处理来快速检测羊蹄甲花粉生活力是可行的。
3　讨论
结果表明 ,试验采用醋酸洋红染色法 、TTC染色法 、无机
酸(硝酸)处理 ,红花羊蹄甲和宫粉羊蹄甲盛花期的花粉生活
力分别为 9.9%、10.7%、10.9%和 10.3%、10.7%、11.2%,蕾
期的花粉生活力分别为 56.6%、51.7%、55.4%和 53.2%、
53.2%、54.6%,差异不大 ,说明这 3种方法都可以用来快速
检测羊蹄甲花粉的生活力。
　　(2)I-KI染色法未能观察到明显的试验现象 ,这说明 2种
(下转第 8111页)
807336卷19期　　　　　　　　　　　　　　邓 旭等　2种羊蹄甲植物花粉生活力快速测定
需的环指功能结构域 ,这个结构域能够阻止细胞凋亡的发生
以及 drICE的泛素化 ,DIAP2和 drICE 2 种蛋白的相互作用 ,
能够控制果蝇细胞凋亡的发生。最近有试验发现 DIAP2对
于阻止革兰氏阴性菌的入侵是必不可少的[ 15] ,果蝇DIAP2蛋
白在细胞中控制 caspase活性的水平[ 16] 。Deterin抑制凋亡的
机理目前尚不清楚。
4　果蝇凋亡抑制蛋白的生物学功能
在果蝇中通过 Reaper 、Hid、Grim和 Sickle 4个蛋白中的 1
个或者多个除去DIAP1对 Dronc的抑制 ,从而诱导细胞凋亡
的发生。这个过程和哺乳动物中 Smac0除去 XIAP抑制的
caspase-9一样。上述 4个蛋白在N末端有 4个相同的氨基酸
(即 RGH模序),这 4个氨基酸能和 DIAP1 、DIAP2的BIR结构
域结合[ 17] 。在这 4个蛋白中 , RGH 模序的不同导致它们和
不同的 IAP相互作用 ,这种作用产生了不同的促凋亡效应。
Grim能有效的诱导胚胎细胞凋亡 ,而 Hid和 Reaper 则弱
些[ 18] ,然而 Sickle不能诱导细胞凋亡 ,而是增强了 Reaper和
Grim诱导的凋亡[ 19] 。RGH和DIAP1的结合促使 DIAP1自身
泛素化 、多聚泛素化并降解 ,释放出果蝇 caspase[ 20] 。在果蝇
中 ,几种 E2类泛素连接酶已经被鉴定 ,这些酶与 Reaper 介导
的DIAP1 的泛素化有关 ,它们分别是Morgue[ 21] 、UbcD1 和
UbcD2[ 22] 。这些蛋白和 DIAP1 的环指结构域相互作用 , 在
Reaper存在时使 DIAP1泛素化 , 诱导细胞凋亡。另一方面 ,
也可以通过结合直接使 DIAP1泛素化。Reaper 和Grim 的表
达减少了新的 DIAP1的产生 ,这种机理代替 DIAP1的自我泛
素化 ,从而导致DIAP1的水平不至于阻止 Drone的激活(自身
激活机制),最后诱导细胞凋亡。Reaper 和Grim 在细胞中降
解DIAP1的这种能力和 DIAP1直接与N末端的 4个氨基酸
结合的能力是不同的。关于 DIAP2和Deterin的生物学功能
目前仍不清楚。
5　果蝇凋亡抑制蛋白在农业中的应用
凋亡抑制蛋白在果蝇的生理过程中扮演了重要的角色 ,
而且果蝇的凋亡抑制基因与人类的同源性不高 ,与其他昆虫
有很多类似的地方。因此 ,以果蝇为模式种 ,研究其他害虫
的凋亡抑制基因 ,并将这些凋亡抑制基因或者蛋白作为药物
设计的新靶标 ,通过抑制害虫的这类基因 ,诱导昆虫细胞的
过度凋亡 ,从而导致昆虫的部分组织丧失生理功能 ,达到防
治害虫的目的。目前 ,已经从天然产物中分离到这类化合
物 ,如印楝树中的印楝素[ 23] 。随着研究的深入 ,凋亡抑制蛋
白在害虫防治中将发挥重要的作用。
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羊蹄甲花粉中淀粉含量低 ,此方法不适合用来做快速检测 。
另外 ,在别的植物上有报道用培养法来测定 ,但都需要数天
的时间 ,相对以上几种方法并没有优势 。
(3)羊蹄甲属植物是具有很大开发潜力的野生花卉 ,但
从试验结果来看 ,其花粉生活力不高 ,影响花粉生活力的因
素有遗传因子 、环境因素等 ,对于影响羊蹄甲属植物花粉生
活力的因素有待于更进一步研究。
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