全 文 ：中国农学通报 第 ! 卷 第 # 期 !

$$% 年 # 月 &’’()**+,’-./&0,12345,16.,7’./, 白鹤芋是天南星科，白鹤芋属，多年生草本植物。 高25~40cm，叶片长椭圆状披针形，两端渐尖，具明显 中脉，深绿色，叶柄长，叶柄基部具鞘。春、夏开花，花 葶直立，肉穗花序白色，外被乳白的佛焰苞片。极耐 荫，忌阳光直射，叶色四季常青。开花时，佛焰苞片薄 似蜡，为优美的室内观叶、观花植物，观赏价值极高。 白鹤芋繁殖一般采用分株和播种方法。分株繁殖时， 生长健壮的植株两年可以分株1次，繁殖系数极低。 应用播种方法繁殖也比较困难，因为白鹤芋在自然状 态下很难自然结实，需经人工授粉才能得到种子，种 子采收后，应立即播种，在播种时如遇到低温，种子易 腐烂。组织培养是白鹤芋非常有效的繁殖方法[1]。 众所周知，对于植物组织培养外植体的形态发生 而言，体细胞胚发生途径较器官发生途径有明显的优 点[2]。在天南星科植物中，体细胞胚发生有过报道，火 鹤（!#$%&’%( )*+,&-,&’.%(）[3]利用叶片、花烛（/! #+%&’%( 01&0,0%(）[4]利用花瓣、半夏属植物 2’,33’0 4,10#’),*#0[5]利用种子作外植体诱导出体细胞胚。花丝 含有敏感细胞可以诱导出体细胞胚，这在多种植物上 已有报道，如欧洲七叶树（/,)*%3%) +’445*0)#0%(）[6]、 现代月季（65)0 +78&’1,）[7]、木槿（9’8’)*%) )7&’0*%)）[8] 等。2004—2005年，笔者在杨凌职业技术学院与比利 时佛拉芒国外教育计划协会园艺合作项目——植物组 织培养实验室，就不同的激素组合和花序的不同发育 时期，以及雄蕊在花序上的位置等因素，对花丝体细胞 胚诱导的影响作以研究探讨。 ! 材料和方法 . 材料 实验材料为比利时根特技术学院温室提供 的白鹤芋品种“stephanie”和“max”。取开花前不同发 育阶段的肉质花序为外植体。白鹤芋肉质的花轴上着 生无柄的两性花，每个雌蕊周围有三枚雄蕊和鳞片。 尚未开放的花序发育可分为三个阶段。阶段1：淡绿色 白鹤芋花丝体细胞胚的诱导及快繁技术 秦静远 （杨凌职业技术学院，陕西杨凌712100） 摘 要! 适合白鹤芋两种基因型的雄蕊花丝体细胞胚诱导的培养基是 89:;<=$.$%>?*@:ABB.%>?*@! 体细胞胚发生于花丝基部幼嫩的雄蕊!其花丝细胞较敏感!易于诱导体细胞胚的发生C!D后!将形成 的体细胞胚转接至培养基 89:EFGB!>?*@:ABB$.$%>?*@上诱导次生体细胞胚发生 再过 C!D!它们就 可以诱导成苗 最好的诱导体细胞胚成苗培养基是 89无激素培养基 关键词!白鹤芋#花丝#胚胎发生#快繁 #$%&’()# )* +),-’(& .,/01)23#34(4 )# ’53 6#’530 7(8-,3#’ -#$ 9-:($ ;0):-2-’()# )* !#$%&%’(()* +#,,&-.(&)*/ <= H0, I0,?J41, K:0;3’; <5*0#’503 01 =,*+’*03 >533,;,L M1,?60,? 9&11,N0 O!$$ P
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@31 A)0$4B ?40#+’4+733%(T W061>7,’T X>-7J3?7,R0RT Y1(0D Z53(1?1’03, 基金项目!杨凌职业技术学院——比利时佛拉芒国外教育计划协会（YLVTC—VVOB）园艺合作项目基金资助。作者简介!秦静远，男，1968年出生，在读硕士 研究生，讲师。主要从事植物组织培养教学和科研工作。先后发表论文10余篇。E-mail:qinjy2000@yahoo.com.cn.。通信地址：陕西省杨凌农业高新技术示范 区西农路10号，杨凌职业技术学院农学系。收稿日期!2005-04-12。修回日期：2005-05-10。 农业生物技术科学 !! ! ChineseAgriculturalScienceBuletinVol.21No.92005September !#$%%&’()*+,’-./01’-2)34)*3
的花序，无肿胀的雌蕊；阶段2：白色花序，轻微肿胀的
雌蕊；阶段3：白色花序，肿胀的雌蕊，苞片几乎开放。
5)6 方法
5)6)5 外植体消毒 将处于开花前不同发育阶段的幼
嫩花序切下，移至超净工作台中，剥去苞片，浸入70%
酒精溶液中10s，用2%NaClO溶液 (加0.005%洗涤
剂)灭菌20min，无菌水冲洗3次，再用无菌滤纸吸干
水分备用。在灭菌过程中将灭菌瓶置于电磁搅拌器上
进行搅拌，以赶走粘附在外植体上的气泡，提高灭菌
效果。
5)6)6 接种及诱导初代体细胞胚 诱导初代体细胞胚
所使用基本培养基为MS，同时附加不同浓度TDZ和
NAA，同时附加30g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH5.8。经高压
灭菌后（121!，20min），于无菌情况下，将尚未凝固的
培养基分装至直径为6cm的培养皿（使用前经湿热灭
菌）中，培养基厚度为1.5~2mm。
在无菌状态下，将花序切成三段：顶部、中部、基
部。在解剖镜下，左手持镊子固定花序，右手持解剖刀
解剖肉质花穗，将花丝连同花药一起切下，用解剖刀
直接将其接种在上述培养基上。每个基因型在一种培
养基接种量为270枚（每个培养皿30枚3部位#3
发育阶段）。注意切割材料时不要使花药受伤。因为在
雄蕊中，花丝和花药壁是二倍体，而花粉粒则是单倍
体，若花粉粒发生脱分化则会在培养物中出现混倍现
象。接种后用胶带封口，以防止培养皿盖与底不慎打
开而造成污染。然后培养在温度为（20$2）%的黑暗 中，以诱导初代体细胞胚的发生。 1.2.3次生体细胞胚的诱导 初代培养接种后42d，将 形成的花丝初代体细胞胚转接入MS附加不同浓度 6-BA和NAA组合的培养基中，诱导次生体细胞胚胎 的发生。转接时，注意用手术刀将雄蕊上的花药切掉， 将花丝连同初代体细胞胚一起接种在培养基上。培养 容器同样使用6cm的培养皿。培养温度(23&2)’，每 天16h光照，8h黑暗，光照度2000~3500Lx。 5)6)7 诱导体细胞胚成苗 继代培养42d，将诱导形成 的次生体细胞胚团切成小块，转接至无细胞分裂素和 生长素的MS固体或液体培养基上，同时在培养基中 附加 0、0.5mg/L、1mg/L的 ABA。培养容器为 250ml 的三角瓶。培养温度(23(2))，16h光照，8h黑暗，光 照度2000~3500Lx。液体培养以8~10rpm进行振荡培 养，诱导体细胞胚长大成苗。 5)6)8 炼苗 在小苗长至株高为 7*9 时! 移至温室中 进行炼苗 首先打开瓶盖，注入约1cm高的自来水驯 化4d，然后用自来水冲洗掉培养基。冲洗时，可将纱布 绑在水龙头上，使水流减缓，防止水流过大伤及幼苗。 移栽至泥炭与珍珠岩1:1的混合基质中。泥炭使用前 要进行湿热灭菌，灭菌温度为60*，30min。基质中添 加CaCO3调剂pH为5.7~6.0，使用量为700g/m3。用塑 料薄膜保湿，置于温室中炼苗，7d后揭去薄膜。每隔 7d用1/8MS(不含有机物质)液体培养基浇灌一次。 ! 结果与分析 6)5 不同激素组合对花丝体细胞胚胎诱导的影响 通 过系列试验，得出 MS附加 0.05~0.10mg/LTDZ和 1~2mg/LNAA适合于白鹤芋品种“stephanie”和“max” 表 不同激素组合对花丝体细胞胚胎诱导的影响 初代体细胞胚的诱导（表1）。在NAA2mg/L时形成的 愈伤组织较多，体细胞胚形成的几率有所下降。根据 各培养基上外植体的情况，筛选出 MS+TDZ0. 05mg/L+NAA1.5mg/L最适合于两种基因型白鹤芋花 丝初代体细胞胚的诱导。在接种7d即可看到有些外 植体在花丝基部切口处形成肿胀的愈伤组织，17~21d 即可形成体细胞胚，在不同激素的培养基上形成的时 间并不相同。体细胞胚发生于肿胀的花丝基部，两种 基因型的诱导情况稍有不同。 6)6 不同发育阶段对花丝体细胞胚胎诱导的影响 以 培养基 MS+TDZ0.05mg/L+NAA1.5mg/L上的情况统 计比较得出，基因型“Stephanie”发育阶段1较阶段2 形成较多的体细胞胚，而阶段2较阶段3形成较多的 体细胞胚(表2)。由此可以得出，不同发育阶段花序的 花丝对激素的应答明显的不同，发育早期阶段的花 序，其花丝较发育期较晚的花序，敏感性较强，易于诱 导出体细胞胚胎。 6): 不同位置对花丝体细胞胚胎诱导的影响 以培养 农业生物技术科学!! ! 中国农学通报 第 ! 卷 第 # 期 !$$% 年 # 月 &’’()**+,’-./&0,12345,16.,7’./, 基 MS+TDZ0.05mg/L+NAA1.5mg/L上的情况统计比 较得出，基因型“Stephanie”花丝在肉穗花序上的位置 对体细胞胚的诱导也有影响。在同一肉穗花序上，不 同部位的雄蕊发育程度也不同，愈往上，其发育程度 愈幼嫩。上部幼嫩雄蕊的花丝较下部的敏感，易于诱 导出的体细胞胚，且诱导出的数目也较多（表3）。 !.8 不同激素组合对次生体细胞胚胎诱导的影响 以 MS附加不同浓度6-BA与NAA的组合对于次生体 细胞胚的诱导是有效的，尤其是在培养基 MS+6-BA2mg/L+NAA0.05mg/L上次生体细胞胚形成 的较多(表4)，说明该激素浓度组合适合于两种基因 型白鹤芋次生体细胞胚的诱导，同时可以用于白鹤芋 的快速繁殖。 在花序的发育阶段和雄蕊位置之间，对体细胞胚 诱导未发现明显的相互影响。 !.% 体细胞胚成苗 尽管ABA已应用于数种植物诱 导体细胞胚长大成苗[9]，在笔者的实验中得出相反的 结论。经过10周的培养，在附加0.5mg/LABA的培养 基上，无生长迹象，附加1mg/LABA会引起外植体的 死亡，这与前人的实验结果一致[10]。由实验笔者得出 无激素的MS培养基适合于白鹤芋体细胞胚胎的生 长，能顺利的长大成苗。液体振荡培养对体细胞胚胎 的分离无明显提高。 幼苗移栽后，在温室中进行遮荫培养，苗能正常生 长长大，成活率为84.5%。 ! 小结 体细胞胚的诱导已应用于各种目的，其突出的特 点在于体细胞胚的单细胞起源性，是良好的基因转化 受体和突变体筛选材料，可以有效地避免其他形态发 生途径容易产生的嵌合现象，同时体细胞胚胎发生途 径形成的植株在遗传上是相对稳定的，这一点对于无 性系的建立是非常重要的。TDZ的细胞分裂素活性源 于对细胞分裂素氧化酶的抑制作用，后者通过氧化作 用减少内源性细胞分裂素[11]。TDZ用于多种植物体细 胞胚的诱导[12]。白鹤芋的幼嫩花丝在含有TDZ的培养 基上可诱导体细胞胚的发生，不同发育时期和不同位 置的花丝，对激素的应答表现也不同，发育早期及同 一花序上部的花丝易于诱导出体细胞胚。在无激素的 MS固体培养基上，可长成小植株，植株在温室中可正 常的发育。同时由于体细胞胚的发生途径比器官发生 途径有较高的再分化率，该方法适用于白鹤芋的组织 培养快速繁殖。存在问题是所形成的次生体细胞胚在 增殖过程中的分离现象不是非常理想，如何提高其分 离程度有待进一步探讨。 参考文献 1 曾宋君,余志满,柯萧霞.常见观叶花卉——天南星科植物.[M].北京. 中国林业出版社,2004.132~139 2 王蒂.细胞工程学[M].北京.中国农业出版社,2003.161~162 3 HamidahM,KarimAGA,DeberghPC.Somaticembryogenesisand plantregenerationin!#$%&’%( )*+,&-,&’.%(/ PlantCel,Tissueand
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表 不同发育阶段对体细胞胚诱导的影响
表 ! 不同位置对体细胞胚诱导的影响
表 # 不同激素对次生体细胞胚胎诱导的影响
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