全 文 ：园　艺　学　报　2008, 35 (12):1787-1794
ActaHorticulturaeSinica
收稿日期:2008-05-12;修回日期:2008-09-18
基金项目:国家自然科学基金项目 (30471419);北京市自然科学基金项目 (502208);国家 `863 计划项目 (2006AA100109,
2007AA021403)
＊通讯作者 Authorforcorrespondence(E-mail:silandai@sina.com)
甘菊 BADH基因启动子的克隆与瞬时表达分析
刘振林 1, 4 , 曹华雯 1 , 夏新莉 3 , 尹伟伦3 , 戴思兰 1, 2＊
(1北京林业大学园林学院 , 北京 100083;2国家花卉工程技术研究中心 , 北京 100083;3北京林业大学生物科学与技
术学院 , 北京 100083;4河北科技师范学院园艺园林系 , 河北昌黎 066600)
摘　要:为了给菊花 [ Dendronthema×grandiflora(Ramat.)Kitam.] 的转基因育种提供诱导型启动子 ,
借鉴 5′RACE策略 , 利用锚定PCR步移的方法克隆了甘菊 [ Dendranthemalavandulifolium(Fisch.exTrautv.)
Makino] 甜菜碱醛脱氢酶 (betainealdehydedehydrogenase, BADH)基因的 4个启动子序列 , 分别命名为
DBP11、 DBP12、 DBP21和 DBP22 (GenBank登录号:DQ497620 ～ DQ497623), 序列长度分别为 1 230、
1 249、 1 273和 574 bp。 4个启动子序列对应区域的同源性在 89%以上。其中 DBP12和 DBP21分別是甘菊
BADH基因 DlBADH1和 DlBADH2 (GenBank登录号:DQ011151和 DQ011152)的启动子序列 , DBP11和
DBP22为甘菊 BADH基因家族中其它成员的启动子序列。序列分析表明 , 上述启动子序列中均含有多处与
水分胁迫和脱落酸诱导相关的顺式作用元件。在表达载体 pCAMBIA1305.2的基础上 , 用所克隆的 4个甘菊
BADH基因启动子序列分别置换驱动其报告基因表达的 35S启动子 , 建立了新的植物表达载体。用其转化
农杆菌 , 并用叶盘法侵染甘菊 , 瞬时表达的结果表明这些启动子序列均具备驱动报告基因表达的功能。
关键词:甘菊;甜菜碱醛脱氢酶基因;启动子;克隆;瞬时表达
中图分类号:S682.1+1　　文献标识码:A　　文章编号:0513-353X(2008)12-1787-08
CloningandTransientExpressionAssayofBADHGenePromotersfrom
Dendronthemalavandulifolium
LIUZhen-lin1, 4 , CAOHua-wen1 , XIAXin-li3 , YINWei-lun3 , andDAISi-lan1, 2＊
(1ColegeofLandscapeArchitecture, BeijingForestryUniversity, Beijing100083, China;2ChinaNationalCenterforFlowerEngi-
neeringTechnique, Beijing100083, China;3ColegeofBiologyScienceandTechnology, BeijingForestryUniversity, Beijing
100083, China;4DepartmentofHorticultureandLandscapeArchitecture, HebeiNormalUniversityofScienceandTechnology,
Changli, Hebei066600, China)
Abstract:Inordertoprovideinduciblepromoterforchrysanthemum[ Dendronthema×grandiflora(Ra-
mat.)Kitam.] transgenicbreeding, referingtothestrategyof5′RACE, fourpromotersequencesofbetaine
aldehydedehydrogenase(BADH)genefromDendranthemalavandulifolium(Fisch.exTrautv.)Makinowere
clonedbyanchoredPCRwalking, whichwerenamedDBP11, DBP12, DBP21andDBP22(GenBankacces-
sionNo.DQ497620-DQ497623).Thefoursequencesare1 230 bp, 1 249 bp, 1 273 bpand574 bpre-
spectively.Thehomologyofthecorespondingregionsbetweeneverytwosequencesisabove89%.DBP12
andDBP21 arethepromotersofDlBADH1 andDlBADH2 (GenBankaccessionNo.DQ011151 and
DQ011152), DBP11andDBP22 arethepromotersofothermembersinBADHgenefamilyfromDendranthe-
malavandulifolium.Manycis-actingelementsrelatedtowaterstressandABAinducementwerefoundinal
thesequences.Newexpressionvectorswereconstructedbyreplacingthe35S-CaMVpromoterwiththeabove
promotersequencestodrivethereportergeneGUSplusoftheexpressionvectorpCAMBIA1305.2.Thenew
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vectorsweretransferredintoAgrobacteriumtoinfectleafdisksofDendranthemalavandulifolium.Theresultof
transientexpressionindicatedthatalthesequenceshadthefunctiontodrivereportergene.
Keywords:Dendranthemalavandulifolium;betainealdehydedehydrogenasegene;promoter;cloning;
transientexpression
甜菜碱在一些植物中是重要的渗透调节物质 , 由胆碱经两步氧化生成 , 合成途径简单 , 遗传操作
方便。甜菜碱醛脱氢酶 (betainealdehydedehydrogenase, BADH)催化甜菜碱合成的第 2步反应。
BADH基因被看作是最有希望的胁迫抗性基因 。BADH基因的表达受盐和干旱等渗透胁迫的诱导 (刘
振林和戴思兰 , 2004)。为了给菊花 [ Dendronthema×grandiflora(Ramat.)Kitam.] 的转基因育种提供
有效的诱导型启动子 , 作者根据陈柏君等 (2004)的报道 , 依据本实验室从菊花二倍体近缘种甘菊
中克隆到的 BADH基因的两个 cDNA序列 (GenBank登录号:DQ011151和 DQ011152) (戴思兰 ,
1994), 克隆了该基因的启动子序列 , 并通过瞬时表达的方法证明了其具有启动基因表达的功能 。
1　材料与方法
1.1　材料
供试材料甘菊 [ Dendranthemalavandulifolium(Fisch.exTrautv.)Makino] 2005年 5月采于北京
林业大学校园内 , 并于北京林业大学花圃进行盆栽培养 。摘取其幼嫩叶片提取 DNA。农杆菌侵染的
甘菊叶片取自本实验室组培苗。末端转移酶 (TdT)、 DNA限制性内切酶 、 克隆载体 pMD18-Tvector
为 Takara公司产品;TaqplusDNA聚合酶 、 大肠杆菌感受态细胞 TOP10、 离心柱型琼脂糖凝胶 DNA
回收试剂盒为天根公司产品;PCR产物纯化试剂盒 (EZ-10 SpinColumnPCRProductPurificationKit)
为 BBI公司产品;UltraPureTM质粒 DNA小量提取试剂盒为赛百盛公司产品;抗生素 、 x-gluc为 Sigma
公司产品。表达载体 pCAMBIA1305.2和根癌农杆菌菌株 EHA105由北京林业大学吕晋慧博士惠赠。
引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1.2　甘菊总 DNA的提取及 BADH基因第一内含子的扩增
总 DNA的提取采用 CTAB法 (王关林和方宏筠 , 2002)。根据两个甘菊 BADH基因的 cDNA序列
(戴思兰 , 1994)的第一外显子和第二外显子序列分别设计如下引物:P1 (正向):5′-ACAACGAT-
ACCATCACGACAG-3′, P2 (反向):5′-GCAACATCAACATCCTCAGC-3′;P3 (正向):5′-ACAACGA-
CAATCCCGATACC-3′, P4 (反向):5′-GCAACGTCAACATCCTCAGC-3′, 扩增两基因的第一内含子序
列 。反应程序为:94 ℃预变性 5 min, 94 ℃变性 1 min, 退火温度分别为 59℃和 58℃, 时间均为 1
min, 72℃延伸 1 min, 30个循环 , 72 ℃延伸 10min。
1.3　启动子克隆和全长启动子的扩增
第一次步移:根据上述两基因的第一内含子和第一外显子中序列相同的区域设计基因特异性引物
GSP1:5′-ACAAATCAATTAACGAAAAAGTTAG-3′;GSP2:5′-TACCGACGATCTGTTCAGTAG-3′;GSP3:
5′-AGGCTCTCTCCATTCACCGTC-3′。 锚 定 引 物 AAP: 5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIGGGI-
IGGGIG-3′;通用引物 AUAP:5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′。
特异性单引物线性扩增的反应体系和程序参见文献 (陈柏君 等 , 2004), 退火温度为 50 ℃。单
引物 PCR产物的纯化按试剂盒 (EZ-10SpinColumnPCRProductPurificationKit)说明书进行。单引物
PCR产物的加尾按末端转移酶 (TdT)说明书进行 。加尾产物 PCR扩增和巢式扩增的反应体系和程
序参见 Invitrogen公司 5′RACE说明书 , 退火温度分别为 55℃和 61 ℃。
根据第一次步移所得序列设计上游引物:5′-CCTTAGACGCCATGCACCAC-3′, 根据 DlBADH1和
DlBADH2序列的不同之处分别设计下游引物:5′-ACTGTCGTGATGGTATCGTTGTC-3′;5′-GATGG-
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TATCGGGATTGTCGTTG-3′。以总 DNA为模板进行扩增 。反应程序同前 , 退火温度为 61℃。
第二次步移:根据第一次步移后的 PCR扩增所得序列设计引物:1GSP1:5′-TGGACAACTCA-
CATGCTAATATGCTAC-3′, 1GSP2:5′-ATCGTGCACCAAGAACATG-3′, 1GSP3:5′-GCCAAACACCAT-
GTGTGTCTAGG-3′;2GSP1:5′-CAGACCATCTAAAGAACACCATCG-3′, 2GSP2:5′-CCAAACACCATGT-
GTGTCTAG-3′, 2GSP3:5′-GGTGGTGCATGGCGTCTAAG-3′。方法同第一次步移 。其中单引物线性扩
增 、加尾产物的 PCR扩增和巢式扩增的退火温度分别为 58、 55和 60℃。
第三次步移:根据第二次步移所得序列设计引物 3GSP1:5′-AACTTGTGCAAAATGGTATATGTG-
GAG-3′, 3GSP2: 5′-GTGTACATATCCATTCCCTAAGG-3′, 3GSP3: 5′-GCATGGTCTATGCTCCTCTGC-
3′; 4GSP1: 5′-AGCTGACGTGACATTGAGGTAAATATG-3′, 4GSP2: 5′-CATTACACACGGCCTAACAC-
3′, 4GSP3:5′-CGAGACCTGTCCAATTGATTCG-3′。方法同第一次步移 。其中单引物线性扩增 、 加尾
产物的 PCR扩增和巢式扩增的退火温度分别为 57、 55和 58℃。
全长启动子的扩增:根据 3次步移所获序列的拼接结果 , 选择最长序列设计上游引物 5′-CAAAC-
CGGATAGACCCAAC-3′, 并根据 DlBADH1和 DlBADH2近 5′端不同序列处设计下游引物:5′-TGTCGT-
GATGGTATCGTTG-3′;5′-GATGGTATCGGGATTGTCG-3′。退火温度为 58 ℃, 延伸时间为 90 s。
1.4　PCR产物的回收 、连接 、转化与鉴定及 DNA序列测定与分析
琼脂糖凝胶中 PCR产物的回收按天根公司离心柱型琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒说明书进行 , 连
接按 Takara公司 pMD18-T载体说明书进行 , 重组质粒由抗生素及 α-互补筛选 , 并用 PCR方法进行
检测。 DNA序列测定由奥科生物技术有限公司完成。序列分析采用 DNAMAN软件进行 。启动子元件
分析采用 PLACE(Higoetal., 1999)软件。
1.5　表达载体的构建
根据克隆载体 pMD18-T设计上游引物:5′-GAAACAGCTATGACCATGATTACG-3′。根据甘菊
BADH基因启动子序列设计下游引物:5′-ACTCCATGGACGGAGAGTTAATGGCAGATG-3′。以测序用菌
液为模板进行 PCR扩增 , 将回收的 PCR产物再次与克隆载体 pMD18-T连接 , 构建中间载体 。
将以上中间载体和表达载体 pCAMBIA1305.2分别转入大肠杆菌 TOP10中 , 摇菌后提取质粒。质
粒的提取采用赛百盛公司的 UltraPureTM质粒 DNA小量提取试剂盒进行 。将中间载体质粒和 pCAM-
BIA1305.2分别用 EcoRⅠ和 NcoⅠ进行双酶切 。然后用琼脂糖凝胶电泳分离酶切片段 , 回收目的片段
并进行连接 。将连接产物转化大肠杆菌 TOP10感受态细胞。挑取单菌落摇菌后进行 PCR检测 , 选择
PCR反应呈阳性的菌液提取质粒进行酶切鉴定 , 同时进行测序鉴定 。测序由奥科公司完成 。
农杆菌感受态细胞的制备 , 表达载体质粒导入农杆菌 , 农杆菌叶盘侵染及组织化学染色法 Gus活
性检测按王关林和方宏筠 (2002)的方法进行。染色结果用数码相机拍照。
2　结果与分析
2.1　启动子扩增结果
第一次步移获得长 574bp的序列 (编号 Q32-3)。该序列在第一外显子区域与 DlBADH2一致 , 与
DlBADH2重叠区域的同源性为 95.11%, 含有该基因比 DlBADH1长出的 9个核苷酸 , 推测该序列为
DlBADH2基因另一拷贝的启动子序列。由于第一次步移没有获得与基因 DlBADH1和 DlBADH2 5′端非
编码区完全一致的序列 , 但所获得的序列 Q32-3与基因 DlBADH2重叠区域的同源性很高 , 推测甘菊
BADH基因家族的不同成员间启动子序列的同源性比较高。因此 , 根据序列 Q32-3设计正向引物 , Dl-
BADH1及 DlBADH2近 5′端的不同序列设计反向引物 , 进行 PCR扩增 , 共获得 3个序列 , 其中由正向
引物和与 DlBADH1序列一致的引物扩增所得序列 (NK1-3)长 515 bp, 与 DlBADH1重叠区域的同源
性为 94.89%, 推测为该基因另一拷贝的启动子序列 。由正向引物和与 DlBADH2序列一致的反向引物
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进行扩增获得两个序列 , 序列 NK2-1长 512 bp, 与 Q32-3完全一致;序列 NK2-3长 556 bp, 与 Dl-
BADH2重叠区域的同源性为 100%, 表明该序列为 DlBADH2的启动子序列 。
第二次步移获得长分别为 648bp(1S2)和 398bp(2S6)的序列。第三次步移获得长分别为 317
bp(B1S11)和 402bp(B2S1)的序列。
　　如图 1所示 , 由上游引物和根据 DlBADH1设
计的下游引物配合扩增全长启动子序列 , 获得
2Q111 (1 230 bp)和 2Q116 (1 249 bp)序列;
由上游引物和根据 DlBADH2设计的下游引物扩增
获得 3Q122 (1 273 bp)序列。序列 2Q111与上
述序列 NK1-3一致 , 为基因 DlBADH1另一拷贝的
启动子序列;序列 2Q116与 DlBADH1重叠区域
(135bp)完全一致 , 为 DlBADH1的启动子序列。
序列 3Q122与基因 DlBADH2重叠区域 (152 bp)
图 1　全长启动子扩增结果
Fig.1　BandofPCRforful-lengthpromoter
完全一致 , 为 DlBADH2的启动子序列 。本次未获得与 Q32-3一致的序列 。
至此 , 共获得 BADH基因的 4个启动子序列:2Q111、 2Q116、 3Q122及 Q32-3, 分别将其命名为
DBP11、 DBP12、 DBP21、 DBP22 (GenBank登录号:DQ497620 ～ DQ497623)。序列的比对见图 2。
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2.2　启动子序列分析
通过序列比对可以发现 , 4个启动子序列相对应的部分 (即从与 DBP22序列第一个核苷酸相对
应的核苷酸起至转录起始密码子之前的序列)差异较大 , 分别将其命名为 DBP11-2、 DBP12-2、
DBP21-2、 DBP22, 而在此之前的序列差异较小 , 分别命名为 DBP11-1、 DBP12-1、 DBP21-1, 并对以
上各部分序列分别进行比较和分析。
　　DBP11-1、 DBP12-1和 DBP21-1序列的长度
均为 691 bp, 其中 DBP11-1、 DBP21-1两序列的
同源性为 100%, 二者与序列 DBP12-1的同源性
均为 97.68%。 DBP11-2、 DBP12-2、 DBP21-2、
DBP22四个序列的长度分别为 516、 535、 556和
511bp。各序列的同源性比较见表 1。由此可以看
出 4个启动子序列的差异主要在其后面的部分 。
表 1　甘菊 BADH基因启动子序列同源性比较
Table1　HomologyofthenucleotidesequenceintheBADH
promotersfromDendranthemalavandulifolium /%
序列 Sequence DBP11-2 DBP12-2 DBP21-2
DBP12-2 96.31
DBP21-2 93.27 91.98
DBP22 89.66 89.38 90.64
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　　利用 PLACE软件对上述 4个启动子序列的顺式作用元件进行分析 , 根据现有文献报道 , 发现其
中含有若干与受水分胁迫和 ABA诱导相关的顺式作用元件 , 具体分析结果见表 2和图 2。其中 , AC-
ACNNGcore元件是从 Dc3基因启动子上鉴定出的与 ABA诱导相关的顺式作用元件 (Kimetal.,
1997);GT-1box(GAAAAA)是从 SCaM-4基因启动子上鉴定出的与盐诱导相关的顺式元件 (Parket
al., 2004);MYB识别 的元 件 [ WAACCA (CTAACCA)、 YAACKG] 和 MYC识别 的元 件
(CANNTG)也已被证明在受干旱 、盐胁迫和 ABA诱导的 rd22和 erd1等基因的表达调控中发挥重要
的作用 (Uraoetal., 1993;Abeetal., 1997, 2003;Simpsonetal., 2003;Tranetal., 2004)。以上分
析表明 , 甘菊 BADH基因可能是通过上述作用元件 (或其中的一部分)调控其表达的 。
表 2　与水分胁迫和 ABA诱导相关的顺式作用元件
Table2　cis-actingelementsrelatedtowaterstresandABA
顺式作用元件
cis-element
序列
Sequence
(5′-3′)a
位置 Locationb
DBP11 DBP12 DBP21 DBP22
ACACNNGcore ACACNNG -898(+), -324(+), -917(+), -344(+), -924(+), -350(+), -558(-)-57(+)
-266(+), -62(+), -532(-) -276(+), -62(+), -551(-)
GT-1box GAAAAA -175(+), -98(+), -786(-) -185(+), -98(+), -805(-) -182(+), -95(+), -812(-) -93(+)
MYBrecognition WAACCA -433(+), -24(+), -524(-) -452(+), -24(+), -543(-), -459(+), -15(+), -550(-) -15(+),
-463 -156(-)
MYBrecognition YAACKG +85(-) +85(-) +99(-) +96(-)
MYCrecognition CANNTG -898(+-), -587(+-), -324 -917(+-), -606(+-), -344 -924(+-), -613(+-), -350 -269(+-),
(+-), -236(+-), +47(+-) (+-), -246(+-), +47(+-) (+-), -209(+-), +62(+-) +58(+-)
　　注:a.保守序列 , W=A/T, Y=C/T, N=A/T/G/C, K=G/T;b.相对于预测转录起始位点的位置;+示正向 , -示互补序列。
Note:a.Conservedsequence, W=A/T, Y=C/T, N=A/T/G/C, K=G/T;b.Locationofcis-actingelementstothesupposedtranscrip-
tionstarts;+indicatesplusstrand, -indicatescomplementationstrand.
以上顺式作用元件在甘菊 BADH基因启动子序列中 , 大部分分布于 -1 ～ -610 bp之间 , 表明所
克隆的启动子序列中可能已包含了该基因的主要调控区域。
2.3　植物表达载体的构建结果
以启动子序列 DBP12植物表达载体的构建为例进行说明 , 其余序列表达载体的构建与之相似。
阳性对照载体 (原载体)pCAMBIA1305.2和构建的以甘菊 DlBADH1基因启动子 DBP12驱动报
告基因的重组载体分别如图 3和图 4所示 。重组的植物表达载体命名为:pCAMBIA1305.2-DBP12。
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2.4　瞬时表达结果与分析
重组载体转入农杆菌后 , 以 EHA105空菌株为阴性对照 , 以含 pCAMBIA1305.2载体的菌株为阳
性对照 , 对已构建的含甘菊 BADH基因 4个启动子的重组载体进行瞬时表达分析 。从图 5中可以看
出 , 在农杆菌侵染后的甘菊叶片中均检测到 GUSplus基因的产物 , 表明所克隆的 4个甘菊 BADH基因
的启动子序列均具有启动子功能 , 同时也表明在非诱导条件下 , 各启动子也均具有一定的表达水平 。
启动子 DBP22序列能够驱动报告基因的表达也预示其它 3个启动子序列的前半部分 (即
DBP11-1、 DBP12-1和 DBP21-1部分)是该启动子驱动基因表达的非必要部分 , 因而该试验结果也为
其它 3个启动子序列的缺失试验提供了参考。
图 5　瞬时表达检测
Fig. 5　Detectionoftransientexpression
3　讨论
利用锚定 PCR步移的方法克隆基因的启动子序列 , 其最大优点是不需要用限制性内切酶消化基
因组总 DNA(陈柏君 等 , 2004), 因而降低了对 DNA质量的要求 , 这对于难于获得高质量 DNA的
植物种类来说具有重要意义 , 可以避免酶切反应的困难 , 提高克隆的效率 。
在甘菊 BADH基因启动子的克隆过程中 , 由于该基因存在多拷贝现象 (刘振林和戴思兰 ,
2004), 第一次步移并未获得与已克隆到的基因拷贝相对应的启动子序列 , 而是获得了一个与
DlBADH2对应区域有较高同源性的启动子序列 (DBP22), 推测其为该基因另一拷贝的启动子序列。
又考虑到已获得的两个 cDNA序列具有较高的同源性 , 推测不同拷贝的启动子序列间的同源性亦较
高 , 因而根据该序列的 5′端设计了正向引物 , 根据已克隆到的两个 cDNA序列的 5′端外显子中序列有
差异的区域设计了两个反向引物 , 进行两次 PCR扩增反应 , 结果不但得到了与 DlBADH2序列相对应
的启动子序列 (DBP21-2), 还同时得到了另一拷贝的启动子序列 (DBP11-2)。在全长启动子序列的
扩增中 , 又采用了同样的手法 , 不但获得了 DBP11、 DBP21, 还同时获得了与 DlBADH1相对应的
DBP12序列 , 这为今后克隆多拷贝基因不同拷贝的启动子序列提供了借鉴 。
受水分胁迫和 ABA诱导表达的基因的启动子序列中 , 常有一些起关键作用的功能元件 , 如在受
ABA诱导的基因的启动子中常含有 ABRE(ABA-responsitiveelement, PyACGTGGC)元件 (Guiltinan
etal., 1990;Mundyetal., 1990;Yamaguchi-Shinozakietal., 1990)。但有些受 ABA诱导的基因的启
动子中并不含有该元件 , 如 rd22基因的表达虽受 ABA的诱导 , 却不含有该元件 , 经鉴定 , 该基因的
表达受 MYB和 MYC识别的作用元件的调控 (Abeetal., 1997)。在上述甘菊 BADH基因的启动子序
列中也未发现 ABRE元件 , 却含有众多 MYB和 MYC识别的作用元件 , 因此 , 甘菊 BADH基因的表达
调控系统可能类似于 rd22基因 , 受 MYB和 MYC作用元件的调控 , 具体还有待于进一步研究 。
通过上述瞬时表达试验 , 证明了所克隆的 4个甘菊 BADH基因启动子序列均具有启动报告基因表
达的功能 , 并在非诱导条件下均具有一定的表达水平。试验中也曾采用不同的胁迫处理条件 , 分析这
些启动子瞬时表达的差异 , 但此过程中发现 , 即使采用同一处理方法的同一处理水平 , 不同叶盘的显
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色反应也存在很大差异 , 因此认为通过瞬时表达试验 , 只能定性确定这些序列是否能够驱动报告基因
表达 , 而不宜分析其表达差异 。不同启动子序列在不同胁迫条件下的表达差异 , 需要通过永久表达来
完成 , 此项工作正在进行中。
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