全 文 ：· 148· China Pharm acy 2001 Vol.12 No .3 中国药房 2001年第 12卷第 3期
叶绿素是由叶绿酸(镁卟啉衍生物 ,二元羧酸)与叶绿醇及
甲醇所形成的二醇酯 , 在高等植物叶中分 a 、b两种 , 通常 a∶
b=3∶1 。脱镁叶绿环类(phorbin)衍生物为具有环戊酮结构
的二氢卟吩 (chlo rin)类配合物 , 主要是叶绿素及其酸降解产物 。由于其较高的肿瘤选择性摄入及较强的光敏化特性而被用
于肿瘤的荧光定位和光敏治疗[1 ] 。离体及整体的生物学测定结
果表明 ,具有比血卟啉衍生物(HPD)更好的发展前途[2 ] 。但这
类物质的制备较为困难 , 文献 [3 ～ 8 ]报道有关脱镁叶绿酸的制备
的工艺有多种 。本文针对文献中以叶绿素为基础原料制备脱镁
叶绿酸的工艺成本较高且收率较低 [3 ～ 9 ]的状况 , 选择较成熟的
丙酮法和乙醇皂化法两种工艺进行比较 , 用正交试验考察了药
材粉碎度 , 软化量及时间 , 提取的温度 、时间及次数 , 溶媒用量和 pH值对收率的影响 。
1 原料 、试剂及仪器
原料:蚕砂(重庆市沙坪坝区中药材公司中药饮片厂)。制备
试剂:丙酮 、乙醚、石油醚 、无水乙醇、HCl 、NaOH 均为分析纯 。分析试剂:EDTA(当量粉剂 ,北京化工厂)、铬黑 T 、NH3 ·H2O 、
NH4Cl均为分析纯 。仪器:旋转蒸发器 RE-52(上海青浦沪西仪器厂);LG10-3A 型高速冷冻离心机(北京医用离心机械厂);
电热恒温鼓风干燥箱(重庆试验设备厂)。
2 方法及结果
2.1 叶绿素提取率测定原理及方法
在制备脱镁叶绿酸的过程中 , M g2 +在强酸性条件下被 H +
从叶绿素分子中取代而游离在水溶液中 , 利用M g2 +与 EDTA
为 1∶1络合 ,铬黑 T 作终点指示剂(颜色由紫红变为纯蓝),用配位滴定法测定水溶液中M g2 +来间接测定叶绿素提取率 。计算公式:提取率 A %=(CE DTAVE DT A/V 测水溶液 ×V 总水溶液×M)/
W ×100%,其中 C 为摩尔浓度 , V 为体积 ,M 为叶绿素平均分
子量 , W 为药材质量 。方法:精密量取待测水溶液 3.5ml , 用
0.0 003mol/L EDTA 准确滴定至终点 ,计算提取率 。
2.2 制备工艺比较
2.2.1 丙酮法 [3 ]原理:利用丙酮等有机溶剂从绿色植物的叶
或蚕砂中提取得到的粗品叶绿素在 30%盐酸中脱去金属离子和植醇长链 ,得到主要产物脱镁叶绿酸 。工艺及结果:取中药材
蚕砂 50g ,加水软化 1h ,丙酮 150ml 、70℃回流提取 1h ,抽滤 ,收取滤液 ,浓缩近干 ,加乙醚 100ml 、30%HCl 50ml萃取制备(剧
烈振摇 5min 左右),分离下层水溶液 ,放入冰块 ,用饱和 NaOH
调 pH至 3左右 ,离心 , 沉淀即为脱镁叶绿酸 , 离心液过滤后用
EDTA 滴定 ,测得叶绿素提取率为 0.3 169%。
2.2.2 乙醇法[ 5 ～7 ]原理:叶绿素分子为双羧酸的酯 ,一个为甲基所酯化 ,另一个为叶醇基所酯化 , 经皂化反应及酸化脱镁后 ,
得到脱镁叶绿酸 。工艺及结果:取中药材蚕砂 50g , 加水软化 ,
从蚕砂中制备脱镁叶绿酸的工艺研究
王章阳 1 ,周 滢 2(1.第三军医大学西南医院药学部 ,重庆市 400038;2.贵阳中医学院 ,贵阳市 550002)
中图分类号:R943 文献标识码:B 文章编号:1001-0408(2001)03-0148-02
摘要:目的:优化以蚕砂为原料制备脱镁叶绿酸工艺条件 ,提高产出率 。方法:以叶绿素提取率为指标 ,对脱镁叶绿酸制备的乙醇法
和丙酮法工艺进行比较 , 用正交试验法对丙酮法的工艺条件进行优化。结果:脱镁叶绿酸的最佳制备条件为蚕砂粉碎度 60目 , 加
1/10倍药材量的水软化 5h 以上 ,加 3倍药材量的溶媒 ,提取温度 70℃,回流时间 60min ,提取次数 2次 ,酸化时 pH 调至 2.5。结论:软化水用量 、丙酮量对叶绿素提取率影响较大 ,经优化后可提高丙酮法制备脱镁叶绿酸的产出率 4.6倍 。
关键词:叶绿素;脱镁叶绿酸;提取工艺;正交试验
Study on the Preparation Technic of Pheophrobide From Silkworm Excrement
WANG Zhangyang(Dept.of Pharmacy , Southw est Hospital , T he Third M ilitary Medical Universi ty ,
Chongqing 400038)
ZHOU Ying(Dept.of Pharmacy ,Guiyang College of TCM ,Guiyang 550002)
ABSTRACT:OBJECTIVE:To optimize the f acto rs of preparing pheophrobide f rom silkw orm excremen t and raise the yield o f
pheophrobide.METHODS :Based on the ex t raction rate o f chlo rophy ll , acetone method w as compared wit h a lcoho l method and
the preparing f acto rs of ace tone method w as optimized by or thogonal design.RESULTS:The best conditions fo r pheophrobide
preparation included grinding silkw orm excrement into powder with par ticle size all below 250μm , sof tening the pow der more
then 5h with w a ter 1/10 the vo lume o f pow der , ex trac ting the pow der with ace tone three times the volume of pow der at 70℃
fo r tw o times 60min each , regulating pH of the liquid to 2.5 w ith HCl so lution .CONCLUS ION :The w ate r and acetone volume
w as more im por tant t han o ther fac to rs , the yield o f pheophrobide w as raised 3.6 tim es a fter optimiza tion.
KEY WORDS:chlo rophy ll;pheophrobide ;ex traction technic;or thogonal design
比例较少 ,药物在载体中没有形成分散状态 。
PEG -6000 、PVP 是常用的固体分散体载体 ,它们基本上
没有干扰主药的测定 。笔者按固体分散体中 PEG -6000 、PVP
最高的一种比例配成适宜的浓度 , 经紫外扫描 , 在药物最大吸
收波长处吸收值小于 0.01 。
5 结论
综上所述 , 卡维地洛经固体分散技术处理后 , 能显著提高
体外溶出速率 , 进而提高体内生物利用度 。本实验为卡维地洛
制成高效制剂提供了一有效途径 。
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147.
(收稿日期:2000-11-15 修回日期:2001-01-04)
中国药房 2001年第 12卷第 3期 China Pharm acy 2001 Vol.12 No.3 · 149·
试验号 A B A ×B C A ×C B×C D 叶绿素提取率(%)1 2 3 4 5 6 7
1 1 1 1 1 1 1 1 0.3 054
2 1 1 1 2 2 2 2 0.3 284
3 1 2 2 1 1 2 2 0.2 872
4 1 2 2 2 2 1 1 0.1 864
5 2 1 2 1 2 1 2 0.2 965
6 2 1 2 2 1 2 1 0.3 826
7 2 2 1 1 2 2 1 0.5 725
8 2 2 1 2 1 1 2 0.7 640
K Ⅰ j 1.1 074 1.3 129 1.9 703 1.4 616 1.7 392 1.5 523 1.4 469
K Ⅱ j 2.0 156 1.8 101 1.1 527 1.6 614 1.3 838 1.5 707 1.6 761
K Ⅰ j 2.0 156 0.3 282 0.4 926 0.3 654 0.4 348 0.3 881 0.3 617
K Ⅱ j 0.5 039 0.4 525 0.2 882 0.4 154 0.3 460 0.3 927 0.4 190
|R| 0.2 270 0.1 243 0.2 044 0.0 500 0.0 889 0.0 046 0.0 573
用 95%乙醇 150ml , 10%NaOH调 pH12 ～ 13 , 70℃水浴提取
1h ,抽滤 , 收取滤液 , 浓缩至一定程度 , 加水稀释浓缩液 , 振摇 ,
用石油醚萃取不皂化物至石油醚无色 , 取下层皂化液 , 加 30%
HCl调 pH至 3左右 ,离心 , 沉淀即为脱镁叶绿酸 , 离心液过滤后用 EDTA 滴定 ,测得提取率为 0.0 726%。
以上结果表明 , 丙酮法制备脱镁叶绿酸的叶绿素提取率高
于乙醇法 。
2.3 丙酮法制备条件的优化
根据该制备方法及蚕砂本身的性质特点 , 以叶绿素提取率
为指标 , 选定工艺中提取温度 、提取次数 、提取时间、软化时间
作为考察因素 ,选用 L8(27)正交表进行实验 ,因素 、水平安排见表 1 ,正交试验数据分析 、方差分析结果见表 2 、表 3。
表 1 L8(27)正交实验因素 、水平表
水平 因素提取次数(A) 提取温度(B) 提取时间(C) 软化时间(D)
1 1次 65℃ 45min 1h
2 2次 75℃ 90min 5h以上
表 2 L8(27)正交试验数据分析表
表 3 L8(27)正交实验方差分析表
方差来源 SSe r M s F 显著性
A SS 1=0.1 031 1 0.1 031 3.1 054 /
B SS 2=0.0 309 1 0.0 309 0.9 307 /
C SS 4=0.0 050 1 0.0 050 0.151 /
D SS 7=0.0 066 1 0.0 066 0.384 /误差=S 3+S 5+S 6 0.0 994 3 0.0 332
F0.05(1 , 3)=10.1;F0.01(1, 3)=34.1由表 2 、表 3可知 , RA 、RB 较大 , RC 、RD 较小 ,可确定影响大小为 A >B>D>C ,再结合各因子 K 值越大越好分析 ,提取
的最佳条件是 A2B2C2D2 ,方差分析 4个因素影响均不显著 。另
选定软化用量 、溶媒量 、pH 值 、粉碎度作为考察因素 ,固定已选
择的 A2B2C2D2 ,以叶绿素提取率为指标 ,选用 L9(34)正交表进
行实验 , 因素 、水平安排见表 4 , 正交试验数据分析 、方差分析结果见表 5 、表 6 。
表 4 L9(34)正交实验因素 、水平表
水平 因素软化水用量(E) 丙酮量(F) 调pH(G) 粉碎度(H)
1 1/ 5倍 3倍 2.5 60目
2 2/ 5倍 4倍 4.5 80目
3 1/ 10倍 5倍 3.5 100目
由表 5、表 6中 R值可知 ,RE >RF >RG >RH ,以最小的 RH 作误差估计 , 方差分析知 E有极显著性 , F 有较显著性 , 再结合各
因子 K 值越大越好 ,即E:KⅠ j >KⅢ j >KⅡ j ;F:KⅠ j >KⅡ j >KⅢ j ;
G :KⅠ j >KⅢ j >KⅡ j ;H:KⅠ j >KⅢ j >KⅡ j ,因此选择最佳提取条件为EⅠFⅠHⅠGⅠ , 结合表 2 、 表 3的结果 , 确定最佳条件为
A2B2C2D2EⅠFⅠHⅠGⅠ ,即提取次数 2次 ,提取温度 70℃,软化时
间 5h以上 ,提取时间 1h ,软化用量 1/10倍于药材量 ,溶媒用量
3倍于药材量 ,酸化时调 pH至 2.5 ,粉碎度为 60目 。在此条件 ,叶绿素提取率提高 3.6倍 。
表 5 L9(34)正交试验数据分析表
试验号 E F G H 叶绿素提取率(%)
1 2 3 4
1 1 1 1 1 1.4 779
2 1 2 2 2 1.0 004
3 1 3 3 3 0.9 734
4 2 1 2 3 0.7 886
5 2 2 3 1 0.5 668
6 2 3 1 2 0.6 392
7 3 1 3 2 0.8 090
8 3 2 1 3 0.8 211
9 3 3 2 1 0.5 570
K Ⅰ j 3.4 517 3.0 755 2.9 382 2.6 017
K Ⅱ j 1.9 946 2.3 883 2.346 2.4 486
K Ⅲ j 2.1 871 2.1 696 2.3 492 2.5 831
K Ⅰ j 1.1 506 1.0 252 0.9 794 0.8 672
K Ⅱ j 0.6 649 0.7 961 0.782 0.8 162
K Ⅲ j 0.7 290 0.7 232 0.7 831 0.8 610|R| 0.4 857 0.3 020 0.1 974 0.051
表 6 L9(34)正交实验方差分析表
方差来源 SSe r M s F 显著性
E SS 1=0.4 177 2 0.2 089 44.45 **
F SS 2=0.1 480 2 0.0 745 15.85 *
G SS 3=0.0 775 2 0.0 388 8.25 /
H SS 4=0.0 047 2 0.0 024 0.5 /
F0.05(2 , 2)=19.00;F0.1(2 , 2)=9
3 讨论
在强酸性条件下 ,Mg 2 +被 H +取代而游离于水溶液中 ,同
时形成的脱镁叶绿酸因带正电性溶于水中 , 故通过测定取代的M g2 +量可间接反映脱镁叶绿酸的产率(或叶绿素提取率),此法尚未见报道 。丙酮法与乙醇法所得产物均为脱镁叶绿酸 ,
但丙酮法所得脱镁叶绿酸保留了甲醇基 , 而乙醇法两酯基均
已水解 。由于两者均由叶绿素脱镁水解制备而来 ,故以叶绿素
提取率为间接指标 ,可反映脱镁叶绿酸的产出率 。实验结果亦
表明 , 通过测定Mg 2 +浓度 , 以叶绿素提取率为指标进行工艺
条件优化是可行的 。L 8(27)、L 9(34)正交试验表明 , 不同的提取因素和水平对脱镁叶绿酸提取率影响不同 。最佳工艺为
A2B2C2D2EⅠFⅠGⅠHⅠ ,方差分析显示 ,软化水用量及丙酮量对收率影响较大 。
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(收稿日期:2000-10-17 修回日期:2001-02-13)