全 文 ：第 37 卷　第 4 期
2009 年 7 月
河南师范大学学报(自然科学版)
Journal o f Henan Normal University(Natural Science)
　 Vol.37　No.4
　 July.2009
　　文章编号:1000-2367(2009)04-0125-03
水红花子对小鼠免疫功能及迟发型超敏反应的抑制作用
李　莉 ,陈秋阁 ,王红梅 ,周海珍 ,张顺利
(河南师范大学 生命科学学院 ,河南 新乡 453007)
摘　要:目的 研究水红花子对小鼠的免疫调节作用 ,并探讨其对迟发型超敏反应的影响.方法:用水红花子
水煎剂对小鼠连续灌胃一周 ,采用 M TT 法检测脾淋巴细胞转化率 、a-醋酸萘酯酶法检测 T 淋巴细胞数量 ,利用
碳廓清实验检测吞噬细胞活性 、定量溶血分光光度法检测 IgM 抗体生成量 ,并检测水红花子对 DNCB 诱导的迟发
型超敏反应的影响.结果:与对照组相比 ,水红花子水煎剂可显著降低小鼠脾淋巴细胞的转化率 , T 淋巴细胞的数
量 、巨噬细胞的吞噬指数和 I gM 抗体生成量 ,可显著减轻耳部肿胀度 , 且差异均达到极显著水平.结论:水红花子可
以明显抑制小鼠的细胞免疫和体液免疫功能 ,并能明显缓解由 DNCB诱导的小鼠迟发型超敏反应.
关键词:水红花子;小鼠;免疫功能;迟发型超敏反应
中图分类号:R967 文献标识码:A
水红花子是蓼科蓼属桃叶蓼组植物红蓼(Polygonum orientale L.)的干燥成熟果实 , 别名蓼实子 、水荭草子 ,广泛生长于
我国南北各省.水红花子是重要的药用资源 , 其性微寒 , 具有散血消瘀 ,消积止痛的功能 , 现代药理研究报道其具有抗肿瘤 、抑
菌 、利尿作用[ 1] , 现代临床常用其治疗乙型肝炎及肝硬化 , 近年国内研究表明其水提物 、醇提物可以清除氧自由基发挥抗脂质
过氧化作用[ 2] ,而对其免疫调节功能未见报道也尚未开发.本研究探讨水红花子对小鼠免疫功能的调节作用 , 并观察其对 2 , 4
-二硝基氯苯(DNCB)诱导的小鼠迟发型超敏反应的影响 , 为水红花子作为中药免疫调节剂的开发和利用提供理论依据.
1　材料和方法
1.1　 材料
1.1.1　试验药物　水红花子 , 购自河南省新乡市医药公司.取其适量 , 按常规煎制并浓缩至浓度为 0.3 g/ mL 的水煎剂 ,过滤
后备用.
1.1.2　实验动物与给药方法　昆明种小鼠 , 8周龄 ,体重 18～ 22 g , 雌雄各半 , 由河南师范大学实验动物中心提供.小鼠随机
分为对照组和实验组 ,每组 25 只.每日以灌胃(i.g)方式给药 ,对照组小鼠给予饮用水量为每只 0.5 mL , 实验组小鼠给予水红
花子水煎剂每只 0.5 m L , 连续 7 d.
1.1.3　主要试剂 　RPMI-1640 培养基购自 Gibco公司 , MT T[ 3-(4 , 5)-双甲基-2-噻唑-(2 , 5)-二甲基溴化四氢唑
盐] 和刀豆蛋白 A(ConA)均购自 Sigma公司 ,脂多糖(LPS)购自宝信生物科技有限公司;豚鼠血清 ,购自鼎国生物技术有限公
司;绵羊红细胞(SRBC)由新乡医学院提供;DNCB购自北京化工二厂.
1.2　 方法
1.2.1　淋巴细胞增殖转化能力的测定　对照组和实验组小鼠均于灌胃第 7 d 颈椎脱臼处死 , 无菌取脾脏 ,制成脾细胞悬液 ,
分成 3组 , 第一组加入含 ConA 的 RPMI-1640 培养基 , 第 2 组加入含 LPS 的 RPMI-1640 培养基 , 第 3 组加入不含 ConA 和
LPS 的 RPMI-1640 培养基作为阴性对照 , 调细胞浓度为(1×106)个/ mL , 并使 ConA 和 LPS 的终浓度为 5 μg/m L.将样品添
加在 96 孔培养板上 , 每孔 0.1 m L ,一式三复孔 ,将培养板放入含有 5%CO2 的 37 ℃培养箱中培养 48 h.培养结束前 4 h , 每孔
加入 5 mg/m L的 M TT 10μL ,培养结束后 , 3 000 r/ min 离心 20 min , 弃上清液 ,每孔加入 10%的 DMSO 100μL ,震荡 15 min.
用酶标仪在 420 nm 处测 OD值 , 通过以下公式计算转化率:
转化率=(用药组平均吸光值-阴性对照组平均吸光值)/阴性对照组平均吸光值×100%.
1.2.2　淋巴细胞 a-醋酸萘酯酶的检验　对照组和实验组小鼠均于灌胃第 7 d剪尾 , 取小鼠新鲜血液一滴 , 制作血涂片后进
收稿日期:2008-10-15;修回日期:2009-04-20
基金项目:河南省科技攻关项目(0524420040);河南省动物学省级重点学科基金;新乡市科技发展计划项目(07029)
作者简介:李　莉(1979-), 女 ,河南信阳人 , 河南师范大学讲师 ,研究方向为生物免疫调控.
DOI :10.16366/j.cnki.1000-2367.2009.04.044
行淋巴细胞 a-醋酸萘酯酶的检验[ 3] .在油镜下观察 ,每只小鼠计数 200 个淋巴细胞 , 求出a-醋酸萘酯酶阳性细胞百分数.
1.2.3　定量溶血分光光度测定 在灌胃开始后的第 2 d 分别给对照组和实验组小鼠腹腔注射 0.2 m L 20%的 SRBC 悬液;在
灌胃开始后的第 7 d ,将小鼠摘除眼球放血 ,颈椎脱臼法处死 , 消毒腹壁 ,摘取脾脏 , 在盛有少许 4 ℃的 PBS 培养皿内刮脾脏 ,
制成细胞悬液 ,并用 200 目滤网过滤到离心管中 , 2 000 r/min 离心5 min , 沉淀用 1 mL 4 ℃的 PBS 悬浮 , 调整细胞浓度为
(1×106)个/m L.取脾细胞悬液进行定量溶血分光光度测定[ 3] ,对比结果.
1.2.4　巨噬细胞吞噬活性测定　对照组和实验组小鼠于末次灌胃后 1 h 称量体重 , 按碳廓清试验方法[ 1] .由小鼠尾静脉注射
墨汁 ,分别于注射墨汁 2 min , 10 min 后从眼眶后静脉丛取血 20 μL ,加入事先盛有2 m L 0.1% NaCO3 溶液的试管中 ,摇匀.用
752 型分光光度计以 2 mL 0.1%的 NaCO 3 溶液作为对照在 600 nm 处测其光密度值.颈椎脱臼法处死小鼠 ,取肝脏和脾脏 , 用
滤纸吸干其表面血液后称重.按以下公式计算未矫正的吞噬指数 k 和矫正吞噬指数α, α反映了每单位组织重量的吞噬活性.
k=log(OD1/ OD2)/(t2-t1)α=体重/(肝重+脾重)×k 13
1.2.5 　迟发型超敏反应[ 5] 　对照组和实验组小鼠于第1 d和第2 d灌胃后在右耳背面均匀涂以1%的 DNCB丙
酮混合液 80 μL ,末次灌胃后再次在右耳背面均匀涂抹 40μL ,5 h后处死 ,用打孔器在左右耳部相同位置打下相同
大小的两片称量 ,计算同一小鼠左右耳重量之差 ,然后比较实验组和对照组小鼠的左右耳重量差.
1.2.6　统计方法　所得实验数据均以 x ±s表示 ,两组间数据采用SPSS13.0统计学软件进行单因素方差分析.
2　结　果
2.1　对 T , B 淋巴细胞增殖转化能力
的影响
由附表可见实验组小鼠由 ConA
刺激引起的 T 淋巴细胞转化率和
LPS 刺激引起的 B 淋巴细胞转化率
与对照组相比均明显降低 , 且差异均
达到极显著水平 , 说明水红花子水煎
剂可以显著降低小鼠由 ConA 刺激
引起的 T 淋巴细胞转化率和 LPS 刺
激引起的 B 淋巴细胞转化率.
附表　水红花子对小鼠免疫功能及迟发型超敏反应的抑制作用(n=25)
组　　别 实 验组 对照 组
T 淋巴细胞转化率 29.13±0.012 3＊＊ 39.30±0.012 7
B淋巴细胞转化率 14.38±0.006 8＊＊ 21.31±0.010 9
T 淋巴细胞数量百分数 34.93±0.044 6＊＊ 40.50±0.037 4
IgM 抗体生成量(OD 值) 0.283 0±0.007 7＊＊ 0.305 2±0.010 3
吞噬指数(α值) 4.125 9±0.416 4＊＊ 5.100 1±0.559 9
双耳重量差 0.011 7±0.006 2＊＊ 0.050 1±0.008 4
注:与对照组相比 , ＊＊表示 P﹤ 0.01
2.2　对外周血 T 淋巴细胞数量的影响
由附表可见实验组小鼠外周血中 T 淋巴细胞数目与对照组相比明显减少 , 且差异达到极显著水平 , 说明水红花子水煎剂
可以显著降低小鼠外周血中 T 淋巴细胞数目.
2.3　对 IgM 抗体量的影响
从附表可以看出实验组小鼠 IgM 抗体生成量含量与对照组相比明显降低 ,两者差异达到极显著水平 , 说明水红花子水煎
剂可以显著降低小鼠的 IgM 抗体生成量.
2.4　对巨噬细胞吞噬功能的影响
由附表可见实验组小鼠和对照组小树相比 , 其吞噬指数差异达到极显著水平 , 说明水红花子水煎剂可以显著降低小鼠单
核-巨噬细胞的吞噬活性.
2.5　对小鼠双耳重量差的影响　
如附表所示实验组小鼠双耳的重量差明显小于对照组小鼠双耳的重量差 ,两者相比差异达到极显著水平.这表明水红花
子水煎剂可以抑制 DNCB诱导的迟发型超敏反应中局部淋巴细胞的浸润 ,减轻小鼠耳部的肿胀程度.
3　结　论
免疫应答过程有多种细胞参与 , 其中在特异性免疫反应中起核心作用的是 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞.T 淋巴细胞和 B 淋
巴细胞被活化后增殖分化成效应细胞 ,分泌一系列细胞因子和抗体 ,参与免疫应答.巨噬细胞也是重要的免疫细胞 , 能吞噬多
种病原微生物 、处理衰老损伤的细胞 , 是细胞免疫的主要效应细胞 , 同时还具有处理递呈抗原和分泌生物活性物质的作用[ 6] .
我们的研究结果证实 ,水红花子水煎剂可以明显抑制小鼠由 ConA 和 LPS 这些有丝分裂原刺激所导致的淋巴细胞的母细胞
化 ,使其无法转化为效应细胞发挥效应 , 并且显著降低了小鼠巨噬细胞的吞噬活性.T 淋巴细胞数量的变化可以在一定程度上
反映机体细胞免疫状态 ,而 IgM 是在体液免疫中发生初次免疫应答产生的抗体种类 , 试验证实水红花子水煎剂显著降低了 T
淋巴细胞数量和 IgM 抗体生成量.这些结果表明水红花子在多层次和不同的水平上对小鼠的免疫功能造成了影响 , 对小鼠的
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细胞免疫和体液免疫都起到了一定的抑制作用.
DNCB 诱导的迟发型超敏反应是机体接触小分子半抗原 DNCB 后 ,被诱导产生特异性的致敏淋巴细胞 ,当有相应的过敏
原进入皮肤时引起的致敏淋巴细胞释放出多种因子引发以单个核细胞浸润为主要特征的炎症反应.本试验结果显示水红花
子水煎剂可显著减轻 DNCB致敏的小鼠耳部炎症反应的发生.因为迟发型超敏反应的发生与抗体和补体无关 ,而与效应 T 细
胞和巨噬细胞及其产生的细胞因子或细胞毒性介质有关 , 所以水红花子可能通过抑制 T 细胞向效应细胞转化及抑制巨噬细
胞的活性来发挥对 DNCB诱导的迟发型超敏反应的拮抗作用 ,这种推断也与前几项实验的结论相互吻合.
免疫反应是机体对异物的一种防御机制 ,它能增强机体的防御能力.但免疫反应过强时 ,就会导致机体损伤 , 从而导致免
疫性疾病.西药免疫抑制剂会无法避免地对神经系统 、肝 、肾造成不可忽视的毒副作用 , 因而使用受到了一定局限 , 而中药低
毒副作用的优势使其作为免疫抑制剂的开发日益受到研究者的重视.本研究结果表明水红花子可抑制小鼠的免疫功能 ,为水
红花子作为中药免疫抑制剂的开发提供了理论依据 , 从而使其有望在器官移植排斥反应及自身免疫病的治疗中发挥新
的作用.
参 考 文 献
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Inhibitory Effects of Fructus Polygoni Orentalis on the Immune
Function and the Delayed Type Hypersensitivity in Mice
LI Li ,CHEN Qiu-ge ,WANG Hong-mei ,ZHOU Hai-zhen ,ZHANG Shun-li
(C ollege of Li fe S ciences , Henan Normal University , Xinxiang 453007 , China)
Abstract:Objectiv e:The research is to study the immune regulate function of F ructus Poly g oni O renta lis and explor e its
influence to the delayed type hyper sensitivity(DT H)in mice.Methods:The water decoction of F ructus Po ly goni O rentalis is
consecutively g iven to mice by means o f intrag astric pe rfusion fo r 7 days.Then M TT assay and acid naphthalene o f α-ace tic es-
te rase of lymphocyte is used separ ately to test the lymphocy te t ransfo rmation r ate and the quantity o f T cell.And the phagocy t-
ic function of mac rophage is ober se rved by carbon clearing te st , the levels o f IgM antibody a re a ssessed through and the quanti-
ta tive hemoly sis spectr opho tomet rically.Then the effect of Fructus Po ly goni O rentalis on DNCB-induced de layed type hyper-
sensitivity is inve stigated.Results:Compared w ith control g roup , F ructus Polyg oni Orentalis decoction could ma rkedly decrease
the lymphocy te transfo rmation rate , the quantity of T cell , phagocy tic index of macrophage and the lev els of IgM antibody.I t
also could markedly attenuate ear-sw elling.Conclusion:F ructus Po ly goni O rentalis can significantly inhibit cellular and humo r-
al immune function and attenua te DNCB-induced de layed type hypersensitivity in mice.
Key words:Fructus Polyg oni O rentalis;mouse;immune function;DTH
127第 4 期　　　　　　　　　　　　　　李　莉等:水红花子对小鼠免疫功能及迟发型超敏反应的抑制作用