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响应面法优化超声波辅助提取
苦杏仁渣中杏仁蛋白工艺
殷振雄1，张 继1，* ，赵保堂2，宋 珅1，蔺彦斌1，张 继1
( 1.西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州 730070;
2.西北师范大学化学化工学院，甘肃兰州 730070)
摘 要:利用超声波辅助碱溶酸沉法研究了从甘肃产苦杏仁渣中提取杏仁蛋白质的工艺。在单因素实验的基础上，利
用响应法优化了三个提取参数( 提取时间、pH、温度) 对蛋白提取率的影响。建立了杏仁蛋白提取率与因素变量的二
次回归模型方程，该回归模型显著。响应面分析结果表明，最佳提取条件为:超声波辅助下温度 48℃，提取时间 1.2h，
pH 11。在此条件下，蛋白质的提取率为 79.74% ±0.60%。
关键词:杏仁蛋白，超声辅助，提取
Study on ultrasonic extraction of almond cake protein from cake waste
YIN Zhen－xiong1，ZHANG Ji1，* ，ZHAO Bao－tang2，SONG Shen1，LIN Yan－bin1，ZHANG Ji1
( 1.College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China;
2.College of Chemical Engineering，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China)
Abstract: Ultrasound － assisted extraction of protein from Prunus armeniaca L var ansu Maxim in Gansu was
studied.The three parameters( extraction time，pH value and extraction temperature) were optimized using the Box
－Behnken design( BBD) with a quadratic regression model built by using response surface methodology( ＲSM) .
The optimal extraction conditions for protein were determined as follows: extraction time 1.2h，pH 11 and extraction
temperature 48℃，the highest yield of protein 79.74% ± 0.60% was achieved.
Key words: almond protein; ultrasonic assisted ; extraction
中图分类号:TS229 文献标识码:B 文 章 编 号:1002－0306(2013)19－0262－05
收稿日期:2013－03－06 * 通讯联系人
作者简介:殷振雄( 1984－ ) ，男，研究生在读，研究方向: 植物资源开发
利用。
基金项目: 国家自然基金( 31200255) ;西南突发性灾害应急与防控技
术集成与示范( 2012BAD20B06) 。
杏仁，蔷薇科植物山杏(Prunus armeniaca L var
ansu Maxim)、西伯利亚杏(Prunussibirica L)、东北杏
(Prunus mandshurica Maxim)或杏(Prunus armeniaca
L)的干燥成熟种子［1］。《本草纲目》记载，杏仁有“润
肺脾、消食积、散滞气”三大好处，其本身含有丰富的
蛋白质，既是高级营养品，又可供药用［2］。杏仁含蛋
白质 22.5%、脂肪 44.8%、糖 23.9%、膳食纤维 8.0%。
杏仁含有丰富矿物质，每 100g杏仁中含钙 234mg、磷
504mg、镁 260mg、钾 773mg、铁 4.7mg、锌 3.11mg，维
生素 B1、维生素 B2、维生素 E 和胡萝卜素，杏仁中特
有的苦杏仁苷达 3%［3］。杏仁蛋白的氨基酸比例平
衡，最优氨基酸组合和其他植物蛋白的质量相当，是
一种良好的植物蛋白资源［4］。目前蛋白质提取大多
利用稀盐和缓冲系统的水溶液提取法，对于不溶于
水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇
等的有机溶剂提取法等。甘肃省平凉、庆阳地处陇
东黄土高原沟壑区，自然条件非常适合杏树生长，杏
产量占全省 70%左右［4］。本研究利用超声波辅助提
取法［5－7］，以甘肃产苦杏仁渣为原料，以杏仁蛋白提
取率为指标，通过单因素和响应面实验［8－12］，研究超
声波辅助条件下碱提酸沉法的不同因素变化对杏仁
蛋白提取率的影响，优化了杏仁蛋白的提取工艺，并
与大豆蛋白、小麦蛋白进行了性能比较，以期为进一
步研究其理化功能等奠定一定的基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
苦杏仁 产于甘肃省平凉市，提取杏仁油后的
苦杏仁渣粉碎后过 40 目筛;考马斯亮蓝 G250 北京
西美杰科技有限公司，分析纯;柠檬酸、NaOH、硫酸
铜、硫酸钾、硫酸、硼酸、甲基红、溴甲酚绿 天津市
福晨化学试剂厂，分析纯;牛血清白蛋白 纯度
98%，分析纯，Bio Basic公司。
JJ－1 精密定时电动搅拌器 金坛市荣华仪器制
造有限公司;KQ－250B 型超声波发生器 昆山市超
声仪器有限公司;pHS－25 数显 pH 计 上海精密科
学仪器有限公司;紫外可见分光光度计 北京莱伯
泰科仪器有限公司;LJG－18S 冷冻干燥机 北京泰
华仪器有限责任公司;TBL5M 台式超大容量冷冻离
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2013.19.050
263
心机 湘仪离心机厂。
1.2 实验方法
1.2.1 杏仁蛋白的提取流程 见图 1。
图 1 杏仁蛋白的提取流程
Fig.1 The flow diagram of extraction
1.2.2 超声辅助提取杏仁蛋白的单因素实验
1.2.2.1 超声时间对杏仁蛋白提取率的影响 准确
称量 2.0g 样品，在料液比 1∶20，pH 9.5，温度 45℃下
用超声波并搅拌浸提 0.5、1、1.5、2、2.5h，然后以
4000r /min 离心 20min。去掉油层和沉淀，取清液
2.5mL稀释 20 倍，利用考马斯亮蓝 G－250 染色法在
595nm 波长下比色。以蛋白质的提取率为指标，绘
制时间与提取率的关系曲线。
1.2.2.2 pH 对杏仁蛋白提取率的影响 准确称量
2.0g已粉碎样品，在温度 45℃，料液比 1∶20，pH为 8、
9、10、11、12 的条件下超声波并搅拌提取 1.5h，其余
同 1.2.2.1。
1.2.2.3 料液比对杏仁蛋白提取率的影响 准确称
量 2.0g 已粉碎样品，在温度 45℃，pH9.5，料液比为
1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1 ∶30、1 ∶35 的条件下超声波并
搅拌下浸提 1.5h，其余同 1.2.2.1。
1.2.2.4 温度对杏仁蛋白提取率的影响 准确称量
2.0g已粉碎样品，在 pH9.5，料液比为 1∶20，温度分别
为 35、40、45、50、55℃的条件下超声波并搅拌提取
1.5h，其余同 1.2.2.1。
1.2.3 Box－Behnken 实验设计 采用 Design－Expert
7.0 软件，应用 Box－Behnken 设计杏仁蛋白提取率为
响应值对主要影响因素进行优化，从中筛选提取杏
仁蛋白提取率的最优提取条件。根据 Box－Benhnken
的中心组合实验设计原理，选定提取时间、pH、提取
温度 3 个对超声提取影响的因素进行单因素实验。
在单因素的基础上，确定响应面实验的因素和水平
(见表 1)。
表 1 Box－Behnken实验设计因素水平
Table 1 Levels of factors of Box－Behnken design
水平
因素
X1 时间(h) X2 pH X3 温度(℃)
1 2.0 11 50
0 1.5 10 45
－ 1 1.0 9 40
1.2.4 杏仁渣中蛋白质含量的测定 采用凯氏定氮
法测定并计算杏仁渣中总蛋白的含量(ω)。通过考
马斯亮蓝 G250 染色法测定提取液中蛋白质含量
(ρ) ，并按下列公式计算蛋白提取率(Y)。
Y(%)= ρ × Vω ×( )m × 100
式中，Y－蛋白提取率(%) ;ρ－提取液蛋白质量
浓度(g /mL) ;V－提取液体积(mL) ;ω－杏仁渣中总蛋
白含量(%) ;m－杏仁渣质量(g)。
1.2.5 数据处理方法 运用 Design－Excerpt 软件对
响应值进行回归分析、方差分析，用 F 检验判定回归
方程中各变量对响应值影响的显著性。
2 结果与讨论
2.1 粗蛋白的测定
经凯氏定氮法测定，杏仁渣中粗蛋白的含量为
45.5%。
2.2 单因素实验
2.2.1 提取时间对杏仁渣中蛋白提取率的影响 在
料液比 1∶20，pH 9.5，温度 45℃下，不同提取时间对杏
仁渣中蛋白提取率的影响如图 2 所示。
图 2 提取时间对蛋白提取率的影响
Fig.2 The influence of time to the extraction yield
由图 2 可知，杏仁蛋白提取率随时间的增加而
增加，当处理时间大于 1.5h时，杏仁蛋白的提取率开
始下降，所以初步确定杏仁渣超声波提取 1.5h。
2.2.2 pH对杏仁渣中蛋白提取率的影响 在料液
比 1∶20，提取时间 1.5h，温度 45℃下，不同 pH对杏仁
渣中蛋白提取率的影响如图 3 所示。
图 3 提取 pH对蛋白提取率的影响
Fig.3 The influence of pH to the extraction yield
由图 3 可知，pH对蛋白质的提取率有明显的影
响，当提取液 pH8～10 时，杏仁蛋白质提取率逐渐增
加;当 pH超过 10 以后，杏仁蛋白的提取率随 pH 的
增大而减小，因此确定提取液的 pH为 10。
2.2.3 料液比对杏仁渣中蛋白提取率的影响 在提
取时间 1.5h，pH 9.5，温度 45℃下，不同料液比对杏仁
渣中蛋白提取率的影响如图 4 所示。
由图 4 可知，随料液比的增大，蛋白质的提取率
也在增大，在料液比大于 1∶30 后，蛋白质提取率提高
264
表 3 方差分析
Table 3 Variance analysis
项目 平方和 自由度 均方 F值 p值 显著性
模型 621.57 9 69.06 7.38 0.0076 *
X1 5.78 1 5.78 0.62 0.4577
X2 212.18 1 212.18 22.68 0.0021 ＊＊
X3 14.58 1 14.58 1.56 0.2521
X1X2 174.24 1 174.24 18.62 0.0035 ＊＊
X1X3 34.81 1 34.81 3.72 0.0951
X2X3 0.25 1 0.25 0.027 0.8748
X1
2 89.09 1 89.09 9.52 0.0177 *
X2
2 12.17 1 12.17 1.30 0.2916
X3
2 62.41 1 62.41 6.67 0.0363 *
残差项 65.50 7 9.36
失拟项 65.50 3 21.83
净误差 0.000 4 0.000
总离差 687.07 16
注:p ＜ 0.05* ;p ＜ 0.01＊＊ 。
图 4 料液比对蛋白提取率的影响
Fig.4 The influence of material to water ratio
to the extraction yield
变得缓慢。在实验范围内虽然料液比为 1∶35 时的蛋
白质提取率最大为 76.8%，而料液比为 1∶30 时，蛋白
质的提取率也达到了 75.6%，但是太高的料液比不
利于后续处理，故选取料液比为 1∶30。
2.2.4 提取温度对杏仁渣中蛋白提取率的影响 在
提取时间 1.5h，pH 9.5，料液比 1 ∶30 下，不同提取温
度对杏仁渣中蛋白提取率的影响如图 5 所示。
图 5 提取温度对蛋白提取率的影响
Fig.5 The influence of temperature to the extraction yield
由图 5 可知，随着温度的增大，杏仁蛋白的提取
率呈现先增大后减小的趋势，这是由于在温度过低
时，蛋白质在水中的溶解性不高，但是温度过高时，
极易造成蛋白质变性，变性后的蛋白质易沉淀，经过
离心，作为沉淀弃除，因此，当杏仁蛋白的提取温度
高于 45℃时，杏仁蛋白极易变性，导致提取率变低，
故确定杏仁蛋白的提取温度为 45℃。
2.3 提取条件优化
通过单因素实验，选择合理的因素水平进行响
应面实验，以确定最佳的提取条件。杏仁蛋白提取
的 Box－Benhnken实验结果见表 2。
表 2 Box－Behnken实验设计结果
Table 2 Ｒesults of data analysis by Box－Behnken design
实验号 X1 X2 X3 提取率(%)
1 － 1 － 1 0 53.4
2 1 － 1 0 73.6
3 － 1 1 0 77.4
4 1 1 0 71.2
5 － 1 0 － 1 63.2
6 1 0 － 1 65.5
7 － 1 0 1 73.9
8 1 0 1 64.4
9 0 － 1 － 1 64.2
10 0 1 － 1 74.5
11 0 － 1 1 65.3
12 0 1 1 74.6
13 0 0 0 75.2
14 0 0 0 75.2
15 0 0 0 75.2
16 0 0 0 75.2
17 0 0 0 75.2
2.4 响应面分析
以 X1(时间)、X2(pH)、X3(温度)为自变量，杏
仁蛋白的提取率 Y为响应值，所得二次回归方程为:
Y = 75.2 + 0.85X1 + 5.15X2 + 1.35X3－ 6.6X1 X2－
2.95X1X3－0.25X2X3－4.6X1
2－1.7X2
2－3.85X3
2
265
运用 Design－Excerpt软件对 17 个实验点的响应
值进行回归分析，方差分析结果如表 3 所示，用 F 检
验判定回归方程中各变量对响应值影响的显著性，
概率越小，则相应变量的显著程度越高。
由表 4 可以看出，模型的决定系数(Ｒ2 =
0.9047) ，变异系数 C.V = 4.34%，表明多项式模型的
精确性、有效性是合理的。
表 4 杏仁蛋白提取率二次项模型的适合度分析
Table 4 Analysis the fitness of
quadratic polynomial model for extraction yield
决定系数
Ｒ2
修订系数
Ｒ2Adj
标准方差 平均值
变异系数
(%)
0.9047 0.7821 3.06 70.42 4.34
2.5 各因素交互作用分析
为了进一步考察 3 个实验因子:超声提取时间
(X1)、pH(X2)及提取温度(X3)的交互作用以及确定
最优点，对回归模型采用降维法分析，即可得到两因
子的回归模型，并通过 Design－Expert 7.0 软件绘制出
响应面曲线图来进行直观的分析。图 6～图 8 分别显
示了 3 组以提取率为响应值的趋势图，从响应面图
可以直观地反映出两变量交互作用的显著程度。极
值条件出现在等高线的圆心处，等高线图最圆，说明
它们之间相互作用对杏仁蛋白的提取率的影响最
大;而等高线图越扁平，表示因素之间的相互影响
越小。
从图 6 可以看出，随着 pH 的增大，杏仁蛋白的
提取率逐渐增大;而随着温度的升高，杏仁蛋白的提
取率呈先增后平的趋势。
图 6 温度和 pH的交互作用对蛋白提取率的响应曲面
Fig.6 Ｒesponse surface showing the effects
of temperature and pH on extraction yield
从图 7 可以看出，随着温度的升高，超声时间的
延长，杏仁蛋白的提取率呈先增后减的趋势。
从图 8 可以看出，随着 pH 增大，杏仁蛋白的提
取率逐渐增大;而随着时间的延长，杏仁蛋白的提取
率的变化不明显。
2.6 最佳条件的确定及验证实验
从图 3 及 Design－Expert 7.0 软件分析可得，建立
了一个以苦杏仁蛋白质提取率为目标值，以超声温
度、pH和时间为因子的数学模型。方差分析表明其
拟合较好。通过对回归方程的优化计算，得到最佳
提取工艺条件:在温度 47.76℃、提取时间 1.18h，pH
图 7 温度和时间的交互作用对蛋白提取率的响应曲面
Fig.7 Ｒesponse surface showing the effects
of temperature and time on extraction yield
图 8 pH和时间的交互作用对蛋白提取率的响应曲面
Fig.8 Ｒesponse surface showing the effects
of pH and time on extraction yield
10.97，液料比 1 ∶ 35g /mL，蛋白质的提取率可达
80.77%。考虑到实际操作的方便性，将最优条件进
行修订，修订后的参数为温度 48℃、提取时间 1.2h，
pH 11，液料比 1∶30g /mL，并在此条件下做了验证实
验，结果表明在此条件下蛋白质的得率为 79.74% ±
0.60%。
3 结论
在单因素实验基础上，运用响应面分析法对提
取杏仁油后杏仁渣中的蛋白的提取条件进行优化。
在超声功率恒定，料液比为 1∶30g /mL，得出对蛋白提
取率影响大小的因素依次为提取时间、提取温度、
pH，验证实验进一步证明在温度 48℃、提取时间
1.2h、pH 11 时，蛋白质提取率高达 79.74% ± 0.60%，
且外观满足食品加工要求，功能特性优良。本研究
为提取杏仁油后的工业废弃物杏仁渣的有效利用提
供了理论依据。为当地杏仁蛋白的进一步深加工提
供了原料来源。
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( 下转第 280 页)
280
结果(－)－棉酚含量为 2.83～4.09mg /g，(+)－棉酚含量
约为 4.13～5.69mg /g，比例约为 1∶1.45，结果见表 4。
表 3 (－)－和(+)－棉酚回收率实验结果(n = 3)
Table 3 Ｒecoveries of(±)－gossypol at
three spike levels(n = 3)
成分
空白本底
(μg)
加标量
(μg)
测得量
(μg)
平均回
收率
(%)
ＲSD
(%)
(－)－棉酚 137.9
19.3 19.9 103.0 3.86
96.7 97.0 100.3 2.23
290.2 290.1 99.9 1.63
(+)－棉酚 216.8
20.3 19.9 99.4 3.50
101.5 103.3 101.7 1.99
304.5 308.6 101.3 1.27
表 4 样品测定结果(n = 3)
Table 4 Contents of(－)－and(+)－gossypol in
samples determined by the method(n = 3)
成分
样品(mg /g)
Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ
(－)－棉酚 2.92 2.83 3.73 2.99 4.09 3.63
(+)－棉酚 4.46 4.13 5.14 4.29 5.69 5.23
3 结论
本实验采用高效液相－质谱法测定棉籽仁中左
旋和右旋棉酚的含量，在样品前处理方法、质谱条件
和色谱条件等方面进行优化，实验结果表明，新疆地
区的棉籽仁中左旋棉酚的含量低于右旋棉酚，两者
的比例约为 1 ∶1.38～1.54。该方法专属性强，灵敏度
高，样品处理简便易行，适于食品和饲料中(－)和
(+)－棉酚的含量测定。
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