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三七叶皂苷酶水解产物的提取分离及结构鉴定



全 文 :【收稿日期】 2004-04-07
【基金项目】 留学归国博士科研启动基金资助项目(教外司留
[ 2001] 498);“辽宁省中药现代化工程技术中心”建设基金资助项
目(No.2002403004)
【*通讯作者】 赵余庆:教授 ,辽宁省中药现代化工程技术中心主
任 , Tel:024-86224725 , E-mai l:Zhaoyuqingtcm@163.com
三七叶皂苷酶水解产物的提取分离及结构鉴定
姜彬慧1 ,赵余庆2* ,韩 凌2 ,胡筱敏1 ,郑龙熙1
1东北大学资源与土木工程学院 ,沈阳 110004;
2辽宁中医学院 ,沈阳 110032
【摘 要】 目的:对三七叶皂苷酶水解产物进行提取分离和结构鉴定。方法:在正交设计优选的酶解条
件下 ,利用 β-葡聚糖苷酶水解三七叶皂苷制备酶水解产物;大孔树脂法提取 、柱层析法分离酶水解产物 、光谱法
确定酶水解产物的化学结构。结果:得到 2 种酶水解产物 ,经鉴定分别为人参皂苷 C-K和人参皂苷-Mc。结论:
利用大孔树脂提取及柱层析分离技术可以实现三七叶皂苷酶水解产物的分离与制备。
【关键词】 三七叶皂苷;酶水解产物;结构鉴定
【中图分类号】 Q556.+4 , R284.2  【文献标识码】 A  【文章编号】 1672-3651(2004)04-0202-03
  三七为五加科植物三七 Panax notoginseng
(Burk.)F.H.CHEN的干燥根 ,为我国传统的名贵
药材 ,具有活血化瘀 、消肿止痛等功效。现已经从
三七中分离出多种皂苷[ 1] 。研究表明:三七茎叶
总皂苷(LSPN)与三七根总皂苷具有相同的药理作
用 ,而且其毒性较低[ 2] 。LSPN以人参二醇组皂苷
为主 ,而人参皂苷 C-K(Ginsenoside compound K ,以
下简称 C-K )则被认为是人参二醇组各皂苷的动
物肠道菌的代谢产物 ,人参皂苷-Mc是 C-K的前体
物之一[ 3 ,4] 。研究表明 C-K具有明显的抗肿瘤作
用 ,尤其是对肿瘤诱导的新血管形成有明显的抑
制作用 ,同时可抑制肿瘤生成及癌细胞转移[ 5-6] 。
以往 ,C-K的制备主要是通过单体人参皂苷的体内
肠道菌代谢或体外的微生物转化来实现 ,转化过
程复杂 ,反应副产物多;而利用商品酶制剂 ,虽然
操作简便 ,但价格昂贵 ,因此应用受到限制 。由于
酶技术的迅猛发展 ,工业酶制剂因其价格低廉 ,操
作过程简单便于工业生产等优点已被广泛地应用
在各个领域。利用工业酶制剂对含量较高的天然
皂苷进行转化从而制备高活性的微量皂苷具有重
大的经济社会意义价值 ,已引起广大学者的高度
重视 。
本文利用工业酶制剂 β-葡聚糖苷酶(β-Glu-
canase)对 LSPN进行水解 ,产物通过 D101大孔树脂
及硅胶柱层析分离纯化 ,得到 2种皂苷 。经理化
常数对照和光谱数据分析 ,鉴定化合物 Ⅰ(280 mg)
为 20(S)-原人参二醇20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷;化
合物Ⅱ(123 mg)为20(S)-原人参二醇 20-O-α-L-呋
喃阿拉伯糖基(1※6)-β-D-吡喃葡萄糖苷 。它们是
首次利用 β-葡聚糖苷酶水解 LSPN得到的人参皂
苷。
1 材料与方法
1.1 试验材料
三七叶皂苷(LSPN)购于云南永昌(含量大于
80%);β-葡聚糖苷酶(β-glucanase NS 44053)由诺唯
信北京分公司提供 。
1.2 试剂和仪器
净品级 D101大孔吸附树脂(天津农药厂 ,以下
简称树脂);硅胶 G和柱层析硅胶(青岛海洋化工
厂);甲醇 、氯仿为化学纯 。TG332A-微量分析天
平;7230紫外分光光度计 , YanacoMP-S3显微熔点
测定仪;Bruker ARX-300型核磁共振光谱仪 。
1.3 酶水解产物的制备
精密称取 LSPN 10 g ,加入到 450 ml pH 为 5.4
的缓冲液中 ,80 ℃水浴加热 30min后(消除其他酶
的影响),冷却至室温 ,加入 β-glucanase原液 50 ml ,
55 ℃水浴加热 48 h后 ,取出以自来水冷却 ,停止
酶解反应 ,即获得酶水解样品。本试验条件由正
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中国天然药物 2004年 7月 第 2卷 第 4期
交设计试验结果获得 。
1.4 树脂对酶水解产物的富集提取
1.4.1 LSPN含量的测定
1.4.1.1 对照溶液的制备 精密称取人参皂苷-
Rg1标准品适量 , 加甲醇使之溶解后 ,定容 ,摇匀 ,
使其浓度为1 mg/ml ,冰箱中 4 ℃保存备用 。
1.4.1.2 标准曲线的绘制 按文献[ 7]方法 ,确定
人参皂苷 Rg1进样量与吸光度的线性关系 ,其线性
方程为 c(μg)=199.18A +12.087(r =0.9995)。
人参皂苷 Rg1进样量在 50 ~ 300 μg 范围内与吸光
度呈良好线性关系。
1.4.1.3 LSPN含量的测定 称取适量的 LSPN用
蒸馏水溶解 ,配制成浓度为 1.003 mg/ml的溶液 ,
精密吸取 10 ml溶液于分液漏斗中 ,水饱和正丁醇
萃取 5次 ,每次 10ml ,合并萃取液 ,水浴挥干 ,室温
下用甲醇溶解定容 ,精密吸取 50μl按“1.4.1.2”项
的方法测定吸光度 ,通过线性回归方程计算含量。
1.5 酶水解产物的纯化与分离
将“1.3”项中制备的酶水解样品液上到树脂
柱内 , 用蒸馏水冲洗至无色后 , 用 70%的乙醇脱
洗。收集洗脱液 ,浓缩至干 ,称重 ,收率为66%。
将树脂纯化后的样品进行硅胶(300 ~ 400目)
柱层析 ,用氯仿-甲醇-水(40∶10∶1)洗脱 ,收集合并
相同流分 。共获得 8个单体皂甙 ,色谱法鉴定其
中有 2种为酶水解产物 。进一步分离 、纯化后 ,得
到化合物 Ⅰ(280 mg);化合物 Ⅱ(123 mg)。
1.6 酶水解产物的结构鉴定
将“1.5”项中分离得到的2种化合物进行理化
常数测定和光谱数据分析 ,并确定它们的结构 。
2 结果和讨论
2.1 酶水解产物的提取
经“1.3”项制备的酶水解样品液经醇洗脱 、浓
缩后 ,获得酶水解样品 6.6 g ,收率为66%。
大孔吸附树脂对皂苷类成分的富集纯化有较
好的效果[ 7] 。本研究利用 D101大孔吸附树脂对酶
转化产物进行富集提取 ,既有效地去除了水溶性
的糖类 、酶和色素等杂质 ,提高了酶水解产物的分
离效果 ,又省去了传统溶剂萃取法的繁琐工艺 ,减
少了有机溶剂的污染 ,为工业化生产创造了条件。
2.2 酶水解产物的结构鉴定
化合物Ⅰ  白色无定型粉末(EtOH-H2O),mp 177~ 178
℃,易溶于甲醇 、乙醇 、正丁醇 、吡啶等 , 难溶于水。醋酐-
硫酸反应呈红色 , 1HNMR(C5D5N)δ:0.87(3H , s , CH3-19),
0.91(3H , s , CH3-18), 0.93(3H , s , CH3-30), 0.99(3H , s , CH3-
29), 1.58(6H , s , CH3-26 , 27), 1.61(3H , s , CH3-21), 5.19(1H ,
d , J=7.7 Hz ,H-1′-20-Glc)。 13CNMR(C5D5N)化学位移C1※
30:39.4 , 28.3 , 78.3 , 39.6 , 56.4 , 18.8 , 35.2 , 40.1 , 50.3 , 37.4 ,
30.8 , 70.2 , 49.5 , 51.5 , 31.0 , 26.7 , 51.6 , 16.4 , 16.1 , 83.3 ,
22.4 , 36.2 , 23.2 , 125.9 , 130.9 , 25.8 , 17.8 , 28.7 , 16.4 , 17.4。
葡萄糖 C1′※6′:98.3 , 75.2 , 79.4 , 71.7 , 78.1 , 62.9。 与文
献[ 3, 4]报道的人参皂苷 C-K数据相同。因此 , 化合物 Ⅰ被
确定为 20(S)原人参二醇-20-O-β-D-吡喃葡萄糖苷 , 即
Compound-K(C-K), 也有学者另称其为 H901或 M1。
化合物Ⅱ 白色无定型粉末 ,mp 181 ~ 183 ℃,醋酐-硫
酸反应呈红色。 1HNMR(C5D5N)δ:0.87(3H , s , CH3-19), 0.92
(3H , s , CH3-18), 0.98(3H , s , CH3-30), 1.02(3H , s , CH3-29),
1.21(3H , s , CH3-28), 1.60(3H , s , CH3-26), 1.62(3H , s , CH3-
27), 1.65(3H , s , CH3-21), 5.12(1H , d , J =7.7Hz , H-1′-20-
Glc), 5.65(1H , J =1.7Hz , H-1′′-6′-Araf)。 13CNMR(C5D5N)
化学位移 C1※30:39.4 , 28.3 , 78.1 , 39.6 , 56.4 , 18.8 , 35.2 ,
40.1 , 50.3 , 37.4 , 30.9 , 70.3 , 49.5 , 51.4 , 30.9 , 26.7 , 51.7 ,
16.3 , 16.1 , 83.4 , 22.4 , 36.2 , 23.2 , 126.1 , 131.0 , 25.8 , 17.9 ,
28.7 , 16.4 , 17.5;葡萄糖 C1′※6′:98.1 , 75.1 79.3 , 72.2 ,
76.6 , 68.6;阿拉伯糖 C1′′※ 5′′:110.2 , 83.4 , 78.9 , 86.1 ,
62.7。与文献[ 4]报道的人参皂苷-Mc 数据一致。因此 , 化
合物Ⅱ被确定为 20(S)原人参二醇-20-O-α-L-呋喃阿拉伯
糖基(1※6)-β-D-吡喃葡萄糖苷。
2.3 β-glucanase水解的机制及酶的专属性
C-K可以通过多种途径产生[ 8 ,9] ,但本研究的
结果表明:β-glucanase 水解 LSPN 产生 C-K 主要是
通过以下途径实现的。即分别以人参皂苷 Rc 和
三七皂苷 Fe(在 LSPN 中含量较高)为起始物 ,在
pH 5.4 ,55 ℃水浴加热 48 h ,经 10%β-glucanase 的
水解作用 ,最终生成人参皂苷 Mc和 C-K 。
Fig 1 Chemical structure of protopanaxadiol-type ginsenoside
Ginsenoside-Rc(R:O-Glc6-1Glc , R1:O-Glc6-1Araf) Notoginsenoside-
Fe(R:O-Glc , R1:O-Glc6-1Araf) Ginsenoside-Mc(R:OH , R1:O-Glc6-1
Araf) C-K(R:OH , R1:O-Glc)
本研究结果证明 , β-glucanase 除能使三七皂苷
Fe转化成人参皂苷Mc和 C-K外 ,还能将人参皂苷
Rc转化为三七皂苷 Fe ,进而生成人参皂苷Mc 和
C-K。另外 β-glucanase 还能将人参皂苷 Rb1 、Rb3转
化为人参皂苷 Rd;但对人参皂苷 Rd 、-Rg2 、Rg3 、Rh2
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及C-K则无转化作用 ,说明 β-glucanase 只对具有 β-
D-吡喃-葡萄糖苷键和α-L-呋喃阿拉伯糖苷键构
型的二糖和三糖起作用 ,对其他类型的糖苷键不
起作用。
3 结 论
天然产物活性成分中的苷类活性常与糖基的
类型和数量相关 ,糖基的改变可引起活性的变化 。
国内外学者对人参皂苷单体与抗肿瘤活性的构效
关系研究表明 ,低糖链的皂苷及苷元具有较强的
抗肿瘤作用 ,其规律如下:原人参二醇型>原人参
三醇型;苷元>单糖苷>二糖苷>三糖苷>四糖
苷;20(R)-人参皂苷>20(S)-人参皂苷[ 10] 。因此 ,
利用合适的酶制剂将含量较高的多糖皂苷转化为
具有活性较大的次级皂苷 ,并使其含量提高 ,为进
一步开发 、研制新药奠定了基础。
参 考 文 献
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Isolation and Structural Determination of Enzymatic Hy-
drolysates of the Leaves Saponins of Panax notoginseng
(Burk.)F.H.CHEN
JIANG Bin-Hui1 ,ZHAO Yu-Qing2 ,HAN Ling2 ,HU Xiao-Min1 ,ZHENG Long-Xi1
1
School of Resources and Civil Engineering , Northeast University ,Shenyang 110004 ;
2Liaoning College of Traditional Chinese Medicine , Shenyang 110032 , China
【ABSTRACT】 AIM:To extract and isolate the enzymatic optimized hydroly sates of the leaves saponins of Panax notoginseng(Burk.)
F.H.CHEN and to elucidate their structures.MEHTOD:Under the condition , the leaves saponins of Panax notoginseng were hydrolyzed
by β-glucanase.The products of enzymatic hydrolysis were extracted and isolated by macroreticular resin , separated by column chromatogra-
phy on silica gel.Their structures were elucidated based on 1HNMR and 13CNMR.RESULT:Two enzymatic hydrolysates were obtained
and elucidated as ginsenoside Compound K(compoundⅠ)[ 20(S)-protopanaxadiol 20-O-β-D-glucopyranoside] and ginsenoside-Mc(com-
poundⅡ)[ 20(S)-protopanaxadiol 20-O-α-L-arabinofuranosyl(1※6)-β-D-glucopyranoside] .CONCLUSION:Using the technology of
macroreticular resin and column chromatography on silica gel , two enzymatic hydrolysates can be separated and prepared.
【KEY WORDS】 The leaves saponins of Panax notoginseng;Enzymatic hydrolysis;Isolation and structural determination
【Foundation Item】 This project was supported by the Education Department Scientific Research Starting Foundation of Doctor Return
from Abroad(No.[ 2001] 498)] ;Modernization of Chinese Traditional Medicine Technology Center(No.2002403004)
204  Chin J Nat Med July.2004 Vol.2 No.4
CJNM
中国天然药物 2004年 7月 第 2卷 第 4期
 CHINESE JOURNAL OF NATURAL MEDICINES  GRAPHIC ABSTRACT   July.2004 Vol.2 No.4