全 文 ：· 648· China Pharm acy 2001 Vol.12 No .11 中国药房 2001年第 12卷第 11期
*基金项目:重庆市中医药管理局科研课题(99032)
·实验研究 ·
三七叶皂苷对气囊滑膜炎大鼠中性粒细胞功能的影响及其机制研究 *
李晓辉 ,李淑慧(第三军医大学药理教研室 ,重庆市 400038)
中图分类号:R286;R965 文献标识码:A 文章编号:1001-0408(2001)11-0648-03
摘要:目的:研究三七叶皂苷(PnGL)对气囊滑膜炎大鼠中性粒细胞功能的影响及其机制 。方法:以角叉菜胶(Car)25mg/kg sc诱导
大鼠气囊滑膜炎 ,分别采用试管稀释法 、体外吞噬金葡菌法 、细胞色素 C还原法和 Fura-2AM 分析法 ,进行气囊灌洗液中白细胞
计数 、中性粒细胞(Neu)吞噬功能 、超氧阴离子(O 2·-)释放及胞内游离钙([ Ca2 +] i)水平的测定 。结果:Car 致炎后 12h ,灌洗液中白
细胞数量明显增多 ,Neu吞噬率和吞噬指数明显增强 、释放 O 2·-也明显增多 ,表明 Neu处于功能活化状态 。与此同时 ,Neu内[Ca 2 +] i
水平明显升高 。PnG L60 ～ 240mg/kg ip能剂量依赖性地降低灌洗液中白细胞数量 、Neu吞噬功能 、O 2·-释放及 Neu-[C a2 +] i水平 ,
且 PnG L降低 Neu-[C a2 +] i水平的作用与其抑制 Neu吞噬率及其释放 O 2·-的能力呈显著正相关 。地塞米松(Dex)虽能减少白细胞
游出并抑制其功能活化 ,但对 Neu-[Ca 2 +] i水平无明显影响 。结论:PnG L抗炎机制与 Dex 不同 ,降低 Neu-[ Ca2 +] i水平 ,从而抑
制 Neu功能是 PnGL 发挥抗炎作用的重要分子机制之一 。
关键词:三七叶皂苷;中性粒细胞;吞噬功能;超氧阴离子;游离钙
Experimental Study on the Ef fects of Panax Notoginsengnoside on Neutrophil Functions in Rats With
Air-vesicle Synovitis and Its Mechanisms
LI Xiaohui , LI Shuhui(Department of Pharmaco logy ,T hird Mili ta ry M edical University ,Chongqing 400038)
ABSTRACT:AIM :To study o f effects o f Panax notoginsengnoside(PnG L)on neutrophil(Neu)func tions in car rageenin(Car)
induced subcutaneous air-vesicle synov itis in rats and its mechanisms.M ETHODS:Rat air-vesicle synovitis m odel w as estab-
lished with sc Car(25mg/kg).Neu count , the phagocy tosis o f Neu , the realease of O 2·-fr om Neu and the level of Neu-[ Ca 2 +] i
w ere m easured w ith test tube diluting method ,staphy lococcus aureus phagocy tosis m ethod , cy tochrome C reduction met hod and
Fura-2 fluo rescence technique respec tively.RESU LTS:At 12h af ter Car used , Neu count of exudates eleva ted , phagocy tosis
rate and index o f Neu and t he release o f O 2·-f rom Neu increased obv iously , suggesting that Neu w as in an ac tivated state.Mea_
nw hile , the level o f Neu-[Ca 2 +] i eleva ted significantly.PnGL 60 ～ 240mg/kg ip , 30min befo re and 6h after Car sc , reduced Neu
coun t o f exuda tes , inhibited phagocy tosis functions and the increase of [Ca 2 +] i level of Neu in a dose-dependent m anner.T here
w as a significant cor relation betw een the reduction o f Neu-[C a2 +] i and the inhibition of Neu phagocy tosis functions and the
release o f O 2
·-
f rom Neu.Dexamethason had similar e ffects on Neu functions to PnGL , but with no effect on the level of Neu-[ Ca2 +] i.CONCLUSION :The reduc tion o f Neu-[Ca 2 +] i level and the subsequen t inhibition of Neu f unc tions is one o f the im-
portantanti-inflamm ato ry mechanism s o f PnGL ,w hich is diffe rent f rom tha t of Dex.
KEY WORDS:Panax no toginsengnoside;neutrophil;phagocy tosis;O 2·-;Ca 2 +
三七叶皂苷(Panax no toginsengnoside of the leaves , Pn_
GL)的组成成分与三七根皂苷相类似 ,但来源更广且价廉 。初
步研究表明 , PnGL 具有良好的抗炎活性 [1 ] , 因而进一步探讨其
抗炎作用机理十分必要 。白细胞 (尤其是中性粒细胞 , neu-
t rophil , Neu)游出及活化可导致血管通透性增加及组织损害 ,
在急性炎性疾病发病中具有重要作用 [ 2 ]。细胞内 Ca 2 +升高是
中性粒细胞活化的一条共同信号转导通路 [ 3 ] ,因此本文以大鼠
气囊滑膜炎为模型 ,观察了 PnG L对 Neu功能及Neu-[ Ca 2 +] i
续大幅降价 , 一是缘于政府的限价政策 , 二是由于市场竞争造
成价格下滑 。这样一来 , 药品价格更符合市场经济的客观规
律 。
7 加入世界贸易组织对医药行业的影响
2001年 , 我国将加入WTO , 这有利于我国医药管理体制
与国际接轨 , 有利于医药新产品的研究与开发及知识产权保
护 , 有利于获得医药发展所需的国际资源 , 有利于具有比较优势的化学原料药 、中药 、常规医疗器械产品进一步扩大国际市
场份额 ,也有利于医药企业转换经营机制与体制创新 。总之 ,有
利于提高医药行业的整体素质和国际竞争力 。从近期看 , 对医
药市场必将受到冲击 。我国加入WTO ,与医药相关的承诺有 5
条:一是药品知识产权保护;二是降低药品进口关税;三是取消
对进口大型医疗器械的管制;四是开放药品分销服务;五是开
放医疗服务 。对医药行业影响最大的是“开放药品分销服务” 。
“开放药品分销服务” 意味着封闭多年的医药商业将受到国外
企业的冲击 。我国的医药商业企业多为小企业 ,且市场开发能
力弱 。在纳入统计的 5 800多家商业批发企业中 ,年销售额在
5 000万元及以上的企业仅占 7%左右 , 因此绝大多数企业将
面临严峻的考验 。尽管WTO 冲击波有一个缓冲期(2003年以
后逐步开放),但为适应新形势的要求 ,医药行业特别是医药商
业将会采取积极措施 , 通过资产重组 、工商联合等方式组建新
的大型企业集团 ,争创新的竞争优势。加上招标购药、医院分类
管理带来的利润下降 , 必将使医药商业一批小企业在竞争中步
履艰难 。
综合以上因素 , 并根据 2001年上半年的经济运行情况预
测 , 我国医药经济将继续保持总体稳定发展的局面 , 完成年初
制定的 2001年医药行业宏观经济运行调控目标:工业总产值
比上年增长 15%;工业增加值比上年增长 16%;工业企业利润
比上年增长 16%;商业销售额比上年增长 8%;商业企业利润
比上年增长 15%;产品出口比上年增长 15%。
(收稿日期:2001-10-27)
中国药房 2001年第 12卷第 11期 China Pharmacy 2001 Vol.12 No.11 · 649·
表 1 PnGL对灌洗液白细胞数量及其吞噬功能的影响
(x ±s , n=8)
组别 剂量(mg/kg)
白细胞总数(1×109 /L)
吞噬功能
吞噬率(%) 吞噬指数
正常组 — 2.95±0.54 20.5±5.10 0.25±0.11
致炎组 — 47.87±15.34 29.8±4.94 0.41±0.09
Car+PnG L 60 40.65±13.21 27.7±4.12 0.40±0.07
Car+PnG L 120 32.36±9.80 25.3±2.17 0.32±0.06 *
Car+PnG L 240 25.18±9.17 23.5±3.19 0.30±0.05
Car+Dex 1 16.85±6.99 19.7±2.41 0.24±0.04
**
****
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ΔΔ**
ΔΔ**
ΔΔ**
ΔΔ
ΔΔ ΔΔ
ΔΔ
ΔΔ
ΔΔ
Δ*
注:与正常组比较:ΔP<0.05 ,ΔΔP<0.01;与致炎组比较:*P<
0.05 , **P<0.01
表 2 PnGL对灌洗液 Neu释放O2·-及其胞内[ Ca2+] i水平的
影响(x ±s , n=8)
组别 剂量(mg/ kg) O(nmol/(106 cell×15m in)) [ Ca
2+] i(nmol)
正常组 — 34.58±6.29 216±48
致炎组 — 116.77±11.07 485±126
Car+PnG L 60 111.21±11.32 457±128
Car+PnG L 120 98.46±16.22 348±111
Car+PnG L 240 75.19±9.28 305±111
Car+Dex 1 67.74±8.38 480±106
2
·-
ΔΔ**
ΔΔ**
ΔΔ**
ΔΔ
ΔΔ
ΔΔ
ΔΔ
ΔΔ
*ΔΔ
**Δ
水平的影响 , 旨在进一步探讨 PnGL 的抗炎作用机理 , 为三七
叶资源的合理开发应用提供实验依据 。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
PnGL(纯度 99%, 中国科学院昆明植物研究所提供);地
塞米松(Dex ,中国药品生物制品检定所);角叉菜胶(Car ,辽宁
药物研究所);细胞色素 C(Ⅲ型 ,美国 Sigm a);Fura -2和 Fu-
ra-2/AM(中国科学院上海药物研究所);其它试剂均为国产
分析纯 。
1.2 实验动物处理
Wistar 大鼠 , ♂, 体重(185±34)g ,第三军医大学医学动
物实验中心提供 (医动字第 24301050号)。随机将大鼠分为6
组:正常组 、致炎组 、Car+Dex 1mg/kg 组和 Car+PnGL 60 、
120 、240mg/kg 3个组 。药物处理组于 Car 致炎前 30min及致
炎后 6h分别 ip相应药物 , 对照组给予等容量溶媒 , 各组大鼠
于 Car 致炎后 12h脱颈椎处死 , 用无钙镁 Hanks液灌洗 , 收
集灌洗液进行有关指标测定 。
1.3 大鼠气囊滑膜炎模型复制 [4 ]
气囊内注射 C ar 25mg/kg 致炎 ,各组动物处死后 ,用无钙
镁 Hanks液灌洗气囊 , 收集灌洗液 , 少许行白细胞计数及分
类计数 , 其余离心 , 分别收集上清液和白细胞(Typan blue检
查白细胞活力大于 97%,Neu占约 95%),供各项指标测定 。
1.4 白细胞计数及分类计数
按常规法进行 [ 5 ]白细胞计数及分类计数 。
1.5 灭活金葡菌的制备与 Neu吞噬功能的测定
取金黄色葡萄球菌菌落 ,置于 pH 7.4 PBS液中 ,经 100℃
水浴 30min灭活 ,离心除去上清液 ,用 PBS配成菌悬液 ,用72-
1型分光光度计 ,波长为 600μm ,D=0.2比浊 ,分装备用 。用前再用 PBS稀释 5倍 。取一定量的 Neu ,加入灭活金葡菌和小牛
血清各 0.1ml , 置于 37℃孵育 30min后 ,推片 、瑞氏染色 ,计数
细胞吞噬率和吞噬指数。
1.6 Neu释放O 2·-的测定 [6]
取已制备好的细胞悬液用 HBSS 调整成 5×105/ml , 各取
悬液 0.2ml ,加入 HBSS 0.3m l , 置 37℃振荡孵育 15min ,立即
置于冰浴中 , 加HBSS 1.5ml , 离心(4℃, 3 000g/5min), 弃沉
淀 , 上清液于 550nm 处测定 OD 值 。对照管不加刺激剂 , 余与
测定管相同 。按下列公式计算细胞色素 C(Cy tC)减少量 ,以代
表 O 2·-生成量 。
CytC减少量=对照管OD —测定管OD消光系数ε×时间T
ε=21.0mmol/L ×cm
最后结果以 CytC减少的多少(nmol/(106 cells×15m in))
间接代表 O 2·-释放量 。
1.7 Neu-[ Ca2+] i水平的测定 [7]
取细胞悬液 (1×109/L), 用含有 0.2%牛血清白蛋白的
HEPES-Krebs Rins缓冲液(HKR , 含:NaCl 116 , KCl 5.4 ,
M gCl2 1.0 ,HEPES 20 ,葡萄糖 10mmol/L ;pH 7.4)洗涤 1次 ,
加入用 DM SO 配制的 Fura-2 AM 贮存液(2mmol/L)使其终
浓度为 4μmol/L , 37℃孵育 40min , 使 Fura-2 AM 负载到细胞内 。用 HKR 洗涤 2次 ,测定荧光强度 。测定条件:以 500nm
波长为发射波 ,激发光光栅和发射光光栅均固定为 10nm ,扫描
激发光光谱 ,若最大荧光峰在 345nm ,即说明负载成功 。固定激
发发射光波长于 345nm ,测定无 Ca 2 +及 1mmol/L Ca 2 +时的荧
光强度 , 继之加入 T ritonX -100(终浓度为 0.09%)破细胞膜
测定最大荧光强度(Fma x), 再加入 9mmol/L EDTA 络合全部
钙 ,以测定最小荧光强度(Fm in),依下述公式计算[ Ca2 +] i浓度:
[C a2 +] i=K d(F —Fm in)/(Fm ax —F)
K d为 Fura-2与 Ca2 +的解离常数 ,37℃时为 225nmol/L 。
1.8 数据处理
将各组数据在电子计算机上进行 t 检验和相关显著性检
验 ,结果用均数±标准差(x ±s)表示 。
2 结果
2.1 PnGL对灌洗液白细胞数量及其吞噬功能的影响
PnGL 对灌洗液白细胞数量及其吞噬功能的影响见表 1。
由表 1可见 , Car致炎后 12h , 灌洗液中白细胞数明显升
高 ,Neu吞噬功能增强 ,而 PnGL 60 、120 、240mg/kg 剂量依赖
性地降低灌洗液中白细胞数量 ,阻止 Neu吞噬功能的增强 。
2.2 对灌洗液中 Neu释放O2·-的影响
对灌洗液中 Neu释放 O 2·-的影响见表 2 。
注:与正常组比较:ΔP<0.05 , ΔΔP<0.01;与致炎组比较:*P<
0.05 , **P<0.01
由表 2可见 , C ar 致炎后 ,灌洗液 Neu 释放 O 2·-显著增加 ,
而 PnGL 3个剂量组均能抑制 Neu释放O 2·-,且呈剂量依赖性 ,
其抑制率分别为 4.76%、15.68%、35.55%。
2.3 对灌洗液 Neu内[ Ca2 +] i水平的影响
由表 2可见 , Car 致炎后 12h , 气囊灌洗液 Neu-[ Ca 2 +] i
水平含量明显升高(P <0.01), 而 PnGL 3个剂量组均能一定
程度地降低 Neu-[ Ca 2 +] i水平 ,且呈剂量依赖关系 。
2.4 相关分析结果
将单纯致炎组及 PnG L 3个剂量组相应指标分别进行相
关分析及相关显著性检验 , 结果 PnGL 降低 Neu-[ Ca 2 +] i水
平与其抑制 Neu吞噬率及其释放 O 2·-的相关系数(r)分别等于
0.980和 0.974 , P 均<0.01。
3 讨论
三七为多年生草本 ,传统多以根 、花入药 。现代药理研究证
明 ,三七根皂苷为其主要活性成分[ 8 ]。三七叶资源十分丰富 ,近
年亦从中分离出了叶皂苷(PnG L), 且成分与根皂苷类似 。因
此 ,进一步深入开展 PnGL 的药理作用及机制的研究对于合理
开发利用三七叶资源具有重要意义 。本文在既往观察到 PnGL
具有良好抗炎作用的基础上 , 进一步对其细胞 、分子机制进行
了初步探索 。
结果发现 ,Car致炎后 12h ,气囊灌洗液中的炎细胞数量显
著增多 , 表明白细胞向气囊滑膜炎区的游出活性增强 , 这与白
细胞向炎症部位的游走是急性炎症发病的重要机制的报道相
一致 [2 ,9 ] 。PnGL 3个剂量均能一定程度地降低气囊灌洗液中的
白细胞数 , 且呈剂量依赖性变化 , 提示 PnG L 能抑制白细胞向
炎症部位的游走。本实验进一步观察到 Car致炎后 12h Neu吞
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诺氟沙星锌抗大鼠实验性胃溃疡作用研究
王胜浩 ,张信岳 ,郑高利 ,林 芳 ,陈 珏(浙江省医学科学院药物研究所 ,杭州市 310013)
中图分类号:R965;R978.1 文献标识码:A 文章编号:1001-0408(2001)11-0650-03
摘要:目的:研究诺氟沙星锌(NF-Zn)的抗胃溃疡作用 。方法:采用大鼠的多种急 、慢性胃溃疡模型 ,体外中和盐酸实验和抗幽门
螺旋杆菌(Hp)实验 ,评价药物的抗胃溃疡作用 。结果:NF -Zn能明显防止乙醇 、水杨酸和应激所致的急性胃溃疡 ,明显促进醋酸
浸渍所致慢性胃溃疡的愈合 , 降低胃酸的分泌 , 提高胃液的 pH 值。体外实验表明 , NF -Zn具有明显的制酸作用 , 并能明显抑制
Hp的生长 ,其 MIC50为 0.5μg/ml 。结论:NF -Zn 具有制酸 、保护胃粘膜和抑制 Hp的作用 。关键词:诺氟沙星锌;胃溃疡;幽门螺旋杆菌
Study on the Action of Norfloxac in Zinc Against Experimental Gastric Ulcer in Rats
WANG Shenghao , ZHANG Xinyue ,ZHENG Gaoli , LIN Fang , CHEN Jue(Inst itute of M ateria M edica ,Zhe-
jiang Academy of M edical Sciences ,Hangzhou 310013)
ABSTRACT:OBJECTIVE:T o study the antiulce r ac tion of norfloxacin zinc(N F-Zn).M ETHODS:Acute and chronic gastric
ulce r m odels w ere established in ra ts and the in v itro ac tion of neutralizing hydrochlor ic acid and the M IC fo r Hp of NF-Zn
w ere de termined.RESULTS:NF-Zn could inhibit the fo rm ation of acute gastric ulcer induced by ethano l , stress and salicy lic
acid in rats , accelerate the healing o f chronic gastric ulce r produced by ace tic acid , inhibit the secre tion of gastric acid and in-
crease the pH in gastric juice.In v itro , NF-Zn could neutralize HCl and inhibit H p w ith M IC 50 o f 0.5μg/ml.CONCLUSION :
The results suggest that the antiulcer action of NF-Zn may be related w ith its pro tection of the gastric mucosal barr ie r , neu-
t raliza tion o f acid and inhibition of Hp.
KEY WORDS:nor floxacin zinc;gastric ulcer ;Hp
锌与胃肠道疾病关系密切 , 它是胃粘膜的重要保护因子之
一 , 在消化性溃疡的治疗中起着重要作用 [1 ] 。门子荣等研究表
明 , 消化性溃疡患者的胃液、胃粘膜组织中 Zn2 +的含量均明显
低于正常人 , Hp感染者比非感染者更低 [2 ] 。近年来人们发现
Hp感染与消化性溃疡的发生 , 特别是溃疡的顽固不愈和早期
复发有密切的联系 , 并发现氟喹诺酮类药物等对 Hp有抑制作
用 [3 ] 。NF -Zn为诺氟沙星与锌所形成的盐 , 具有促进烧伤创
面愈合及抗感染作用 [4 ] , 但对消化性溃疡的研究尚无文献报
道 。本研究目的在于观察 NF-Zn对大鼠实验性胃溃疡的保护
作用和体外抗 Hp作用 ,并探讨其可能的作用机理 。
1 材料
1.1 试药
N F -Zn(浙江省医学科学院药物研究所自制 , 批号 :
990517 ,含量:99.08%);雷尼替丁(胶囊), 150mg/粒 ,民生药厂生产 。硫酸锌 , 含 7分子结晶水 ,分析纯 , 临用时均用 0.5%
CMC-Na 配成所需浓度的混悬液 。
噬功能明显增强 、释放 O 2·-明显增多 ,表明 Neu处于功能活化
状态 , 这与炎细胞功能活化是炎症发病的重要机制之一的结果
相吻合 [2 ,10 ] 。PnGL 能剂量依赖性地降低 Neu吞噬率和吞噬指
数 ,并抑制其释放 O 2·- ,表明抑制活化的 Neu功能可能是PnG L
发挥抗炎作用的另一重要方面 。鉴于 Ca 2 +在介导炎细胞活化的
信息传导过程中具有重要作用 [3 ] ,本实验继之对 Neu-[ Ca 2 +] i
水平进行了研究 , 结果 Car 致炎后 Neu-[Ca 2 +] i水平明显升
高 , PnGL 3个剂量能不同程度地降低 Neu-[ Ca 2 +] i水平 。相
关分析结果显示 , PnGL 降低 Neu- [ Ca 2 +] i水平与其抑制
Neu 吞噬率及释放 O 2·-呈显著正相关 。这表明 , 降低 Neu-
[ Ca2 +] i水平可能是 PnG L 抑制 Neu功能的一个重要分子机
制 。
此外 , 本研究还观察到 Dex 虽能明显降低渗出液中炎细
胞数量 、抑制 Neu 活化 , 但对 Neu-[ Ca 2 +] i水平无明显影响 ,
提示 PnGL 的抗炎机理与 Dex 有所不同 , 这可能是 PnGL 不
具有 Dex某些严重不良反应(如免疫抑制)的重要原因 , 其更深
入的分子机制有待进一步研究 。
参考文献:
[ 1] 李淑慧 ,楚 延.三七叶皂苷抗炎作用的实验研究[ J] .四
川生理科学杂志 , 1999 , 21(4):22.
[ 2] 李晓辉 ,唐汝愚.丹参酮抑制嗜中性白细胞功能与其防治
心肌梗塞作用的关系[ J] .中国药理学报 , 1991 , 12(3):
269.
[ 3] Rose S , Lllerhaus M ,Wiercinski A ,e t al.Alte red calci_
um regulation and function o f hum an neut rophil during
m utiple traum a[ J] .Shock ,2000 , 13(2):92.
[ 4] Kido H ,Murakami N ,Ho A ,et al.Anti-inflamm ato ry ,
ana lygesic and anti-pyre tic e ffects of d-2-[4-(3-met_
hyl-2-thieny l)pheny l] propionic acid(M -5011), a new
non-ste roidal anti-inflamm tory drug , in rats and guin_
ea pigs[ J] .Jpn J Pharm acol , 1998 , 76(1):75.
[ 5] 樊锦秀 ,李素珍 ,梅丽萍.血液分析仪在浆膜腔积液计数
及分类中的应用[ J] .实用医技杂志 , 1998 , 5(7):449.
[ 6] 李淑慧 ,李晓辉 ,楚 延.三七总皂苷抗炎作用机制的实
验研究[ J] .中草药 ,2000 , 31(9):676.
[ 7] 李晓辉 ,李淑慧 .三七总皂苷对 T NF 、NO 含量的影响及
其机制研究[ J] .中草药 , 1999 ,30(7):514.
[ 8] 王永发.三七总皂苷片 、冲剂临床疗效概述[ J].云南中医
中药杂志 , 1996 , 17(3):25.
[ 9] Terui T ,Ozawa M , Tagami H.Role of neutrophils in in_
duction of acute inf lammation in T-cell-mediated imm_
une dermatosis ,psoriases:a neutrophil-associa ted infla_
mmation-boosting loop[ J] .Exp Dermato l ,2000 , 9(1):1.
[10] Lentsch AB ,Ward PA.Regulation o f inf lammato ry va_
scula r damage[ J] .J Pat ho l , 2000 ,190(3):343.
(收稿日期:2001-03-12)