全 文 : *广东省科技厅基金项目(编号:63039);广东省中医药管理局基
金项目(编号:44543004)
乌榄叶对血管平滑肌的作用及机制探讨*
董艳芬 梁燕玲 罗艳 李永亮
广东药学院基础学院(广州 510006)
【摘要】 目的 观察乌榄叶水提物对离体大鼠胸主动脉平滑肌的作用并探讨其机制。方法 采取离体血管
灌流方法 , 在血管内皮完整下 , 观察其对去甲肾上腺素(NE)和 KCl预收缩血管环的作用 , 与肾上腺素能受体作用
的关系 , 对依内钙与外钙收缩反应的影响。同法观察在去除血管内皮后 , 对 NE预收缩的血管环作用。结果 乌
榄叶水提物呈浓度依赖性舒张 NE诱发的血管收缩 , 其作用可被美托洛尔有效抑制(P<0.05);在血管内皮被去
除后 , 其对血管的舒张作用未受影响;经无钙液预处理后 , 其能阻断 NE诱发的外钙收缩反应(P<0.05), 但对依
内钙的收缩率无抑制作用 , 却缩短内钙收缩峰值维持时间(P<0.05),肝素预处理不能阻断该作用;能使不同浓度
氯化钾预收缩的血管环张力升高 ,该作用不受酚妥拉明影响。结论 乌榄叶水提取物可呈非内皮依赖性舒张血
管 , 其机制可能与激活血管平滑肌细胞膜上 β 受体和阻断细胞膜受体操纵性钙通道 , 抑制外钙内流有关。对高钾
诱发血管环收缩的张力具有加强作用 ,该作用与 α受体作用无关。
【关键词】 乌榄叶水提取物 去甲肾上腺素 氯化钾 胸主动脉环
Theeffectofcanariumpimelakoeningleavesonratthoracicaortasmoothmusclecels DONGYan-fen, LIANG
Yan-ling, LUOYan, etal.GuangdongColegeofPharmacy, Guangzhou510006, China
【Abstract】 Objective Toinvestigatetherelaxativecharacteristicsandmechanismoftheaqueoussolublepartof
extractsfromCanariumpimelaKoeningleavesonratthoracicaorticartery.Methods Weperfusedtheisolatedringsand
observedtheresponseofnorepinephrine(NE)orKCl-inducedarterycontractiontotheextracts, itsrelationshipwithad-
renergicreceptorandintracellularandextracelularcalcium-dependentvascularconstriction.Samemethodswereusedto
studytheconstrictionresponseofvascularringtoNE.Results TheextractsfromCanariumpimelaKoeningleavesrelaxed
rataortaringspre-contractedwithNEinadose-dependentmanner.Thisefectwasnotinhibitedbymetoprolol;When
theendotheliumofratthoracicwasremoved, theextractshadnosignificanteffectsonaortaringspre-contractionwith
NE.Theextractshadasuppressiveefectontheaortacontractioninducedbyextracelularcalciumandshortenedthedura-
tionofaortamaximumcontinuouscontractioninducedbyintracellularcalcium, buthadnoefectonitstension.However,
theeffectwasnotatenuatedbyco-incubationwithheparinandCa2+-freemedium.Theextractscouldfurtherelevatea-
ortaringstensioninpre-contractionwithKCl(30 and80 mmol/L).Thiseffectwasnotinhibitedbyphentolamine.
Conclusion Theextractscanrelaxratthoracicaortaringswithoutendothelium.Themechanismisassociatedwithactiva-
tingβ -receptor, openingofCa2+channelbythereceptordependentpathwayaswellasinhibitionofCa2+influxinvascu-
larsmoothmusclecell.Theextractsalsoincreasesaortaringstensioninpre-contractionwithKCl, butisnotassociated
whitα-receptor.
【Keywords】 TheextractsoftheCanariumpimelaKoening Norepinephrine KCl Thoracicaorticring
植物乌榄 (CanariumPimelaLeeth)为橄榄科 ,常
绿大乔木 ,生于低海拔山地林中 ,分布于我国南部福
建 、两广 、云南等地 。民间常用于治疗风湿性腰腿
痛 、手足麻木 、感冒 、上呼吸道炎 、肺炎等 [ 1] 。前阶段
的研究发现 ,除民间药用外 ,乌榄叶水提物对应激高
血压大鼠有显著的降压作用 [ 2] ,能减弱离体蛙心收
缩力 ,并可阻断氯化钙加强心肌收缩力的作用 [ 3] 。
提示乌榄叶水提物对心血管系统有调节作用 ,但至
今尚无对离体血管直接作用的实验依据。本项目的
研究目的是探讨乌榄叶水提物对血管平滑肌的作用
及其机制。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂 实验所用乌榄叶采自广东省中山 、
珠海地区。其水煎提取物 (每毫克相当于生药 4.5
mg),由广东药学院物化教研室提供 ,实验时用蒸馏水
溶解 ,调试 pH值至 7.0,再用滤孔直径为 4 ~ 5 nm的
过滤器过滤 ,乌榄叶水提物以下简称为乌叶。乙酰胆
碱(acetylcholine, Ach):上海三爱思试剂有限公司生
产 , 批号:20030620;去甲肾上腺素 (norepinephrine,
NE):上海和丰制药有限公司生产 ,批号:061002;异丙
肾上腺素 (isoprenaline, ISO):上海和丰制药有限公司
生产 ,批号:5E2007;美托洛尔(metoprolol, MET):广州
天心股份有限公司生产 , 批号:050501;酚妥拉明
(phentolamine, PHE),上海复旦复华药业有限公司生
产 ,批号:国药准字 H10890046。
·1780· 广东医学 2008年 11月第 29卷第 11期 GuangdongMedicalJournal Nov.2008, Vol.29, No.11
DOI :10.13820/j.cnki.gdyx.2008.11.008
1.2 实验动物 实验所用动物为 SD成鼠 ,体重 180
~ 220 g,雌雄不拘 ,由广东省实验动物中心提供。
1.3 仪器 MedLab生物信号采集处理系统 (南京美
易公司生产),肌张力换能器。
1.4 方法
1.4.1 血管环的制备与去内皮模型建立和验证 [ 4]
大鼠断头 ,迅速开胸取出胸主动脉 ,置于 95% O2 和
5% CO2混合气预饱和的 Krebs液 ,剪成 2.5 ~ 3 mm的
血管环 ,悬挂于预置 15 mlKrebs液的浴槽内 , 37℃恒
温 ,持续通以混合气体 ,加静息张力 2 g平衡 120 min,
期间每 15 min更换 Krebs液 1次。用棉签磨擦血管环
内表面 ,制备内皮去除的血管环。用 1 ×10-6 mol/L
NE使收缩血管环达峰值 ,加入 10-5 mol/LAch,若使
NE预收缩的血管舒张下降在 25%以上 ,可认为内皮
去除成功 ,否则弃用。
1.4.2 实验分组 每组血管环样本量为 12例 ,随机
分为:100 g/L乌叶高剂量 、10 g/L乌叶低剂量 NE组 ,
去内皮 NE-乌叶 (10 g/L)组;不预加 β受体阻断剂
NE-乌叶组 ,预加 β受体阻断剂 MET-乌叶组 ,阳性
药物 ISO组 , MET-ISO组;30 mmol/LKCl-乌叶组 ,
80 mmol/LKCl-乌叶组 ,预加 α受体阻断剂 PHE-30
mmol/LKCl-乌叶组;无钙液 -乌叶组与无钙液 -肝
素 -乌叶组。各组均设生理盐水作空白对照组。
1.5 统计学方法 血管张力下降百分率(%)为血管
舒张的张力 /NE激发收缩最大张力的比率 (舒张的张
力为 NE激发最大张力与加药后的血管张力之差)。
实验数据以 x±s表示。用 SPSS11.5系统进行统计学
分析 ,组间对照用独立样本的 t检验。
2 结果
2.1 乌叶舒血管作用的药物量效关系及其内皮依赖
性 将内皮完整的血管环在正常 Krebs液中平衡 2 h
后 ,加入 1 ×10-6 mol/LNE至收缩呈最大反应 ,观察低
剂量(10 g/L)、高剂量(100 g/L)乌叶对血管环的舒张
作用 ,对照组加等容量生理盐水。在 NE预收缩的去
内皮血管环组加入 10 g/L乌叶 ,与相同给药剂量内皮
完整组进行比较。从表 1可见 ,各乌叶组对 NE预收缩
的血管环均有明显的舒张作用(P<0.05),与 NS对照
组比较差异有显著性 (P<0.05),高剂量组的作用强
于低剂量组 (P<0.05),但内皮完整组与去内皮组血
管张力下降百分率组间差异无显著性(P>0.05)。
表 1 乌叶舒血管作用的药物量效关系及其内皮依赖性(n=12) x±s
组别 剂量(mg/ml)
给药后血管张力下降百分率(%)
5min 10min 15min 20min 30min
生理盐水组 0.03 0.04±0.14* 0.43±0.49* 3.32±2.88* 5.70±4.57* 12.60±13.71*
10g/L乌叶组 0.033 2.14±1.55■ 21.88±20.29■ 41.45±29.29■ 58.99±23.63■ 79.26±14.69■
100g/L乌叶组 0.33 30.09±18.03 66.11±18.32 76.63±16.20 82.58±13.68 88.47±11.16
10g/L乌叶组(去内皮组) 0.033 1.22±1.49 21.94±15.83 53.60±24.46 74.77±19.16 88.87±14.21
*与乌叶各组对比 P<0.05;■与 100g/L乌叶组比较 P<0.01
2.2 乌叶对血管平滑肌肾上腺素能受体的影响
2.2.1 乌叶对血管平滑肌 β受体的影响 在 NE预收
缩血管环基础上 ,各对应组分别加入 NS, ISO, 100g/L乌
叶和 MET。从实验结果表 2可见 , NS对照组血管环张
力无明显变化;ISO组和 100 g/L乌叶组的血管环收缩
张力明显下降;但在预加 β受体阻断剂的 MET+100 g/L
乌叶组 ,血管环张力无明显下降 ,与不预加阻断剂 100
g/L乌叶组比较 ,血管张力下降百分率具差异有显著
性(P<0.01),其作用与阻断阳性药物对照组 MET+
ISO类同。说明乌叶舒张血管的作用 β与受体有关。
表 2 乌叶对血管平滑肌 β受体的影响(n=12) x±s
组别 剂量(mg/ml)
给药后血管张力下降百分率(%)
1min 2min 3 min 5min 10 min 20min 30min
NS组 0.03 0.00±0.00* 0.04±0.14* 0.04±0.14* 0.04±0.14* 0.43±0.49* 3.32±2.88* 5.7±4.57*
ISO组 0.0033 22.21±15.67■ 49.98±15.77■ 45.98±15.46■ 47.68±14.96■ 49.27±14.79■ 52.49±15.44■ 57.51±16.89■
乌叶组 0.33 3.36±2.04△ 8.14±4.04△ 11.79±6.16△ 27.20±7.20△ 64.89±10.35△ 92.25±3.66△ 98.39±3.56△
MET+乌叶组 0.33 0.00±0.00▲ 0.00±0.00▲ 0.16±0.36▲ 3.17±2.13▲ 40.39±10.78▲ 86.38±5.12▲ 97.78±2.92
MET+ISO组 0.0033 0.39±0.51 2.41±1.30 3.53±2.04 4.05±2.44 5.17±3.02 5.85±3.41 6.80±3.93
*与 ISO组和乌叶组比较P<0.01;■与 MET+ISO组比较P<0.01;△与 ISO组比较 P<0.05;▲与乌叶组比较P<0.05
2.2.2 乌叶对高钾诱发血管环收缩及其对 α受体的影
响 在 30 mmol/L和 80 mmol/LKCl预收缩血管环基础
上 ,分别加入相同剂量 100 g/L乌叶 ,实验可见在血管环
张力达到最高值时 ,乌叶可使收缩张力进一步加强 ,而且
对 30mmol/LKCl组的作用强于 80mmol/LKCl组。实验
还观察到 ,预加 α受体阻断剂的 PHE+30 mmol/LKCl-
乌叶组与不预加 PHE的 30 mmol/LKCl-乌叶组比较 ,张
力升高差异无显著性(P>0.05),结果见表 3。
·1781·广东医学 2008年 11月 第 29卷第 11期 GuangdongMedicalJournal Nov.2008, Vol.29, No.11
表 3 乌叶对不同浓度 KCl诱发血管收缩的影响(n=12) x±s
组别 剂量(mg/ml)
给药后血管张力上升百分率(%)
1min 2 min 3min 5min 10min 20min
A组 0.03 0.29±0.65 0.70±1.55 0.35±0.87 0.00±0.00 0.39±0.90 0.49±1.17
B组 0.33 1.59±1.31* 4.25±2.60* 5.98±3.02* 8.64±3.94* 9.13±3.28* 6.94±2.78*
C组 0.33 11.07±5.03■ 21.78±7.07■ 27.84±7.78■ 34.33±11.89■ 36.65±17.21■ 27.70±17.27■
D组 0.33 10.92±6.56 19.84±13.42 25.92±21.19 30.43±21.10 29.07±21.25 15.58±13.87
A组:80mmol/LKCl-NS;B组:80mmol/LKCl-乌叶;C组:30mmol/LKCl-乌叶;D组:PHE+30mmol/LKCl-乌叶;*与 A组比较 P<
0.05;■与 B组比较P<0.05
2.3 乌叶对依内钙与外钙收缩反应的影响 [ 5] 将在
Krebs液已平衡 2 h的血管环用无钙 Krebs液换洗平衡
30 min,然后加入 NE,血管平滑肌出现收缩反应 ,此时
引起的收缩为 NE在无钙 Krebs液中促使细胞内钙释
放所致;待收缩幅度稳定后再加入 CaCl2 ,以恢复 Krebs
液中 Ca2+浓度(2.5 mmol/L),此时血管平滑肌进一步
收缩 ,这是 NE作用下促进细胞外钙进入细胞内所致。
待收缩反应达到最大值 (视为 100%),再用无钙 Krebs
液反复冲洗血管环 ,待其收缩张力恢复正常后 ,加入
100 g/L乌叶 ,对照组加入等容量 NS,给药 10 min后重
复上述实验 ,比较给药前后血管平滑肌的收缩率。肝
素 +乌叶组以无钙 Krebs液和 5 ×10-2 g/L肝素共同
孵育 20 min,观察乌叶对血管环的作用。实验可见 ,乌
叶组与肝素 +乌叶组依外钙内流的收缩百分率和内钙
收缩峰值维持时间均明显小于 NS对照组(P<0.01),
但依内钙收缩率差异无显著性(P>0.05);此外 ,肝素
+乌叶组作用结果与乌叶组比较差异无显著性
(P>0.05),见表 4。
表 4 乌叶对 NE诱发的依内钙和依外钙收缩的影响(n=12) x±s
组别 剂量(mg/ml)
无钙孵育
收缩率(%)
内钙收缩峰值
维持时间(min)
含钙孵育
收缩率(%)
NS组 0.03 29.3±12.7 600.0±0.00 71.7±11.7
乌叶组 0.33 32.1±3.6 213.4±69.1* 0.4±4.3*
肝素 +乌叶组 0.33 27.7±10.4 293.2±119.6* 1.1±2.2*
*与 NS组比较 P<0.01
3 讨论
血管平滑肌舒张机制主要通过以下途经:①通过
血管内皮细胞释放的舒张因子。 ②激活血管平滑肌上
的 β受体或阻断 α受体的作用。 ③抑制依内钙释放或
外钙内流 ,使胞浆内钙离子浓度降低。本实验发现 ,乌
叶对 NE预收缩的血管环具有舒张作用 ,并呈药物量
效关系。在血管内皮去除后 ,该作用不受影响 ,提示其
舒张机制与内皮细胞释放的舒张因子无关 ,为非内皮
依赖性。据文献资料报道 , β受体激动剂通过激活血
管平滑肌细胞上的腺苷酸环化酶 ,引起 cAMP含量增
加引起细胞内 Ca2+浓度下降 ,使血管舒张 [ 6] 。 MET是
β受体阻断剂 ,本实验可见它能有效地抑制乌叶的舒
血管作用 ,提示乌叶可能是通过激活血管平滑肌 β受
体引起血管舒张。 NE诱导的血管收缩是通过激活细
胞膜上 α受体 ,一方面开放受体操纵性钙通道 ,促使细
胞外钙内流 ,另一方面通过信使 IP3 引起细胞内钙释
放 ,使细胞内 Ca2+浓度增加 ,共同促发细胞的收缩反
应 [ 7] 。本研究观察到乌叶对 NE诱发的依外钙内流收
缩反应具有很强的抑制作用 ,提示乌叶的舒血管作用
机制还可能通过阻断细胞膜上的受体操纵性钙通道 ,
抑制细胞外钙内流所致。此外还发现 ,乌叶对依内钙
释放的收缩率无抑制作用 ,但使内钙收缩峰值的持续
时间显著缩短 ,该作用不被肝素预处理阻断。肝素是
IP3(三磷酸肌醇)受体的阻断剂 ,阻断 IP3诱导的肌浆
网内钙释放 ,抑制内钙诱发的收缩。由此推测 ,乌叶对
血管平滑肌细胞肌浆网上 IP3 敏感的钙离子通道无阻
断作用。其显著缩短内钙收缩峰值持续时间的可能机
制是乌叶作用于血管平滑肌 β 受体 ,引起细胞内
cAMP增加 ,促进细胞内钙摄取和贮存 ,使无钙孵育下 ,
依内钙释放的胞浆内钙离子浓度不能维持稳定 ,胞浆
钙浓度下降所致。
另外 ,实验还发现乌叶可进一步加强 30 mmol/L
和 80 mmol/LKCl预收缩血管环张力 ,该作用不被 α
受体阻断剂 PHE阻断。 30 mmol/LKCl收缩血管作用
是由于细胞膜去极化所引起 , 80 mmol/LKCl致血管平
滑肌收缩是通过电位依赖性钙通道的开放 ,引起细胞
内钙离子浓度增加而产生收缩 [ 4] 。实验结果提示 ,乌
叶对电压依赖性钙通道无阻断作用 ,其加强高钾诱发
血管环收缩张力的作用与 α受体作用无关 ,其作用机
制有待进一步研究。
综上所述 ,乌叶具有以下作用:①对血管平滑肌有
舒张作用 ,并有一定的药物量效关系。其机制可能与激
活血管平滑肌细胞膜上 β受体和阻断细胞膜受体操纵
性钙通道 ,抑制外钙内流有关。与血管内皮源性舒张因
子无关。 ②对高钾诱发血管环收缩的张力具有加强作
用 ,该作用与 α受体作用无关。乌榄树为常青植物 ,叶
子常年可采摘 ,在广东省有丰富资源 ,所以进行乌叶新
药效的研究对开发其药用价值具有很好的应用前景。
参考文献
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·1782· 广东医学 2008年 11月第 29卷第 11期 GuangdongMedicalJournal Nov.2008, Vol.29, No.11
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报:医学版 , 2001, 29(3):220-222.
(收稿日期:2008-06-18 编辑:祝华)
*国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目 (编号:
2005AA219010)
银杏内酯 B诱导骨髓间充质干细胞分化为
神经样细胞的功能*
苏平 1 黄建华 2 雒晓东1 黄培新 1 黄燕 1 裴雪涛 3
1广东省中医院神经一科(广州 510120);2中国人民解放军第 157医院内一科(广州 510510);3军事医学科学院野
战输血研究所(北京 100850)
【摘要】 目的 探讨银杏内酯 B诱导的大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的生理功能。 方法 取扩增 5 ~ 10
代的大鼠骨髓 MSCs, 40 mg/L银杏内酯 B诱导 1周后 , 用膜片钳全细胞记录方式检测细胞内外的离子通道电流 ,
步阶刺激从 -70 mV到 +60mV,步阶 10mV。结果 6例银杏内酯 B诱导后的神经元样 MSCs的全细胞电流 , 除
可见钾电流 IK外 , 还可见外向整流 IA,类似于神经元对照。结论 银杏内酯 B诱导的 MSCs, 不仅具有神经细胞的
外形和免疫学特征 , 而且具有神经元的基本电生理功能。
【关键词】 银杏内酯 B 间充质干细胞 诱导 功能 膜片钳
骨髓中的骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstem
cels, MSCs)是一类多能成祖细胞 ,拥有巨大的分化潜
能 ,在体外能产生包括神经外胚层在内三个胚层来源
的细胞 [ 1] 。银杏作为我国的原产树种 ,在我国分布很
广 ,作为药用植物已经有很长的历史。银杏叶提取物
主要药效成分为黄酮糖类和烯内酯类 ,有研究证实其
中的银杏内酯 B(ginkgolideB)在体外实验中能诱导神
经干细胞分化为神经元 [ 2] ,前期实验证实银杏内酯 B能
诱导骨髓间充质干细胞分化为神经样细胞 [ 3] ,为进一步
的临床神经退行性疾病提供种子细胞。本实验利用膜
片钳技术检测诱导后的神经样细胞的电生理功能 ,研究
由 MSCs分化而成的神经样细胞的全细胞电流。
1 材料与方法
1.1 实验材料 膜片钳装置 (Tektronix-5111A,日
本),记录液 ,自制玻璃微电极。
1.2 实验方法 取扩增 5 ~ 10代的大鼠骨髓 MSCs,
40 mg/L银杏内酯 B诱导 1周后的细胞爬片 [ 3] ,显微
镜下观察选取表面光滑 ,胞体呈锥形 ,具有长突起的神
经元样细胞 ,用膜片钳全细胞记录方式检测细胞内外
的离子通道电流 ,步阶刺激从 -70 mV到 +60 mV,步
阶每 10 mV记录 1次。记录液主要是电极内液和细胞
外液。电极内液的组成为(mmol/L):KCl140, HEPES
10, EGTA10,调 pH至 7.2 ~ 7.4。细胞外液的成分是
(mmol/L):NaCl140, KCl5, MgCl2 1, HEPES10, Glu-
cose10, CaCl2 3, 调 pH为 7.2 ~ 7.4。如需要阻断钠
电流 ,可在细胞外液中加入河豚毒素(TTX)1 μmol/L。
2 结果
结果见图 1 ~ 3。图 1(a)~ (f)分别为 6例神经元
样细胞的全细胞电流记录图 ,从 -70 mV到 +60
mV,除可见钾电流 IK外 ,图 1(e)K+电流 IK并不完
全呈直线上升 ,而是向纵轴方向有弯曲 ,形成外向整
流 IA。图 1(g)是全细胞记录的模式分析图。图 2为
标准对照 ,为培养的新生大鼠神经元用步阶刺激记
录的 全细胞 电流 , 可见 IK , IA, INa., 步阶 刺激 从
-70 mV到 +30 mV, 步阶 10 mV。证明银杏内酯 B
诱导后的 MSCs记录的电流类似于神经元。图 3为
诱导后细胞的钾电流的 I-V曲线 ,由图可见钾电流
缓慢激活。
3 讨论
膜片钳技术是在电压钳技术的基础上发展起来
的 ,首先出现于 20世纪 80年代 ,为细胞水平和分子水
平研究离子通道的功能开辟了新的途径 [ 4-5] 。具有
1pA的电流灵敏度 、1 μm的空间分辨率和 10 μs的时
间分辨率。膜片钳技术记录细胞膜的电活动有 4种基
本方式:细胞贴附式 ,外膜向外式 ,内膜向外式和全细
·1783·广东医学 2008年 11月 第 29卷第 11期 GuangdongMedicalJournal Nov.2008, Vol.29, No.11