全 文 ：收稿日期:2013-09-14; 修订日期:2014-04-04
基金项目:国家自然科学基金( No． 81160509; 81360475) ;
江西省教育厅科学技术研究项目( No． GJJ10552) ;
江西省卫生厅中医药科研基金课题( No． 2009A058)
作者简介:相恒云( 1989-) ，女( 汉族) ，山东临沭人，江西中医药大学硕士
研究生，硕士学位，主要从事中药药效物质基础与质量控制工作．
* 通讯作者简介:任 刚( 1976-) ，男( 汉族) ，湖南安乡人，江西中医药大
学副教授，博士学位，主要从事天然药物活性成分的研究工作．
半边风醇提物及不同极性部位
对大鼠中性粒细胞呼吸爆发的抑制作用
相恒云，胡志成，任 刚* ，易文芳，彭加兵，罗仉平，元文君
(江西中医药大学中药资源与民族药研究中心，江西 南昌 330004)
摘要:目的 筛选半边风抑制大鼠中性粒细胞呼吸爆发的有效部位，并探讨可能的机制。方法 采用化学发光法测定乙醇
提取物及各极性部位对大鼠中性粒细胞呼吸爆发的抑制活性;化学模拟机体内 O －2 ·及 H2O2 的产生，采用化学发光法分
别测定各样品对 O －2 ·及 H2O2 清除作用。结果 除石油醚部位( PEP) 和萃余水部位( WAP) 外，乙醇提取物( ACE) 、乙酸
乙酯部位( EAP) 及正丁醇部位( BAP) 对大鼠中性粒细胞呼吸爆发均具有不同程度的抑制作用，其 IC50分别为 41． 4，19． 7，
80． 3 μg·ml －1 ;在活性氧清除实验中，仅 EAP对 O －2 ·和 H2O2 表现了较强的清除效果。结论 半边风对大鼠中性粒细胞
呼吸爆发具有较强的抑制作用，其活性部位为 EAP和 BAP，但二者的抑制机制可能不同。
关键词:半边风; 中性粒细胞呼吸爆发; 活性部位; 活性氧
DOI标识:doi: 10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2014． 08． 008
中图分类号:Ｒ285． 5 文献标识码:A 文章编号:1008-0805( 2014) 08-1817-03
Anti － PMN respiratory burst activity and remove oxygen free radicals activity of Dendro-
panax chevalieri
XIANG Heng － yun，HU Zhi － cheng，ＲEN Gang* ，YI Wen － fang，PENG Jia － bing，LUO Zhang － ping，YUAN Wen
－ jun
( Ｒesearch Center of Natural Ｒesources of Chinese Medicinal Materials and National Medicine，Jiangxi University
of Traditional Chinese Medicine，Nanchang，Jiangxi，330004，China)
Abstract: Objective To observe the effects of ethanol total extract，PE － soluble，EtOAc － soluble，n － BuOH － soluble and water
－ soluble portions of Dendropanax chevalieri on rat neutrophil respiratory burst and explore the potential mechanism of anti － in-
flammatory of D． chevalieri．Methods By using phorbol myristate acetate ( PMA) as the stimulant，luminol － dependent chemilumi-
nescence was used to determine anti － PMN respiratory burst activity of different extracts of D． chevalieri． Similarly，their effects on
free radicals generated by pyrogallol － luminol － carbonic acid buffer system and H2O2 － luminol － carbonic acid buffer system
were observed． Ｒesults None but ethanol total extract，EtOAc － soluble portion and n － BuOH － soluble portion of D． chevalieri
could inhibit rat neutrophil respiratory burst． And their IC50 are 41． 4，19． 7，80． 3 μg·ml
－1 respectively． However，only EtOAc －
soluble portion show the activity in scavenging O2
－· and H2O2 ． Conclusion D． chevalieri indicated obvious anti － PMN respira-
tory burst activity
Key words: Dendropanax chevalieri; PMN respiratory burst; Active portion; Ｒeactive oxygen species
畲药半边风为五加科树参属植物树参 Dendropanax chevalieri
(Vig．)Merr． et Chun，又名鸭掌木、鸭掌紫、枫荷梨等，广泛分布
于长江以南各地［1］。半边风的根或茎是我国江西、浙江一带的
畲族人民习用的畲药，主要用于治疗风湿、类风湿炎症等，为畲医
使用频率较高的 30 种畲药之一［2］。现代化学和药理研究表明，
半边风主要含有苯丙素、三萜及黄酮类化学成分，具有抗心律不
齐及抗氧化活性［3 ～ 5］。然而，半边风在畲族医药中主要用作抗炎
药物的药理学基础仍不清楚。众所周知，中性粒细胞(Polymor-
phonuclear neutrophils，PMN)在炎症发生过程中扮演了重要角色:
当中性粒细胞受到病原微生物或其他细异物刺激时，发生呼吸爆
发，生成超氧阴离子(O －2 ·)、过氧化氢(H2O2)和羟自由基(HO
·)等活性氧分子，同时释放溶酶体蛋白酶，协同杀死细菌、清除
异物。但是，当 PMN被过度激发时，大量活性氧积聚于炎症部位
引起组织损伤和炎症反应［6，7］。本文首次采用化学发光法研究
了半边风根 95%乙醇提取物及其各个极性部位对中性粒细胞呼
吸爆发的影响，并评价了各部位对活性氧 O －2 ·和 H2O2 的淬灭
活性。本文旨在筛选半边风作为抗炎畲药的活性部位，并探讨其
可能机制，为畲药半边风的临床应用提供药理学支撑，也为其后
续的开发利用提供科学依据。
1 材料
1． 1 动物 清洁级 Sprague － Dawley (SD)大鼠，雌雄不限，体质
量(350 ± 20)g，由湖南斯莱克景达动物中心提供，许可证号:
SCXK (湘)2009 － 0004。
1． 2 药材 半边风药材于 2009 年 10 月采自浙江省温州市，经本
文作 者 任 刚 副 教 授 鉴 定 为 树 参 的 新 鲜 根，凭 证 标 本
(2009002FH)保存于江西中医药大学标本馆。
1． 3 试剂 肝素钠 (上海浦江应用生物化学研究所) ;葡聚糖
T500 (美国 Pharmacia公司) ;淋巴细胞分离液 (上海华精生物高
科技有限公司) ;佛波豆蔻酸乙酯 (PMA)、鲁米诺(luminol)和
HEPES (美国 Sigma公司) ;Tris试剂 (AMＲESCO 分装) ;三乙胺
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 8 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 8 期
(上海试剂一厂) ;小牛血清 (FCS，杭州四季青生物工程材料有
限公司) ;1，10 －菲啰啉 (纯度 ＞ 99%)和二甲亚砜 (DMSO) (上
海凌峰化学试剂有限公司) ;无水碳酸钠 (AＲ)、碳酸氢钠
(AＲ)、磷酸氢二钠 (AＲ)及磷酸二氢钠(AＲ) (国药集团化学试
剂有限公司) ;EDTA (上海化学试剂总厂，标准纯) ;焦性没食子
酸 (遵义第二化学厂，AＲ) ;维生素 C (中国医药集团上海化学试
剂公司，AＲ) ;H2O2(宁波市三鑫双氧水有限公司，AＲ) ;其它试
剂均为分析纯。
1． 4 仪器 循环水式多用真空泵 (江西鼎技科学仪器有限公
司) ;立式压力蒸汽灭菌器 (上海博迅实业有限公司医疗设备
厂) ;GL － 16G高速冷冻离心机 (上海安亭仪器厂) ;XW － 80A
旋涡混合器 (上海青浦沪西仪器厂) ;BPCL － K微弱发光测量仪
及其数据处理工作站 (中国科学院北京生物物理研究所) ;倒置
显微镜 (江西凤凰光学仪器有限公司) ;细胞计数板 (上海精密
仪器有限公司) ;KQ －300DB型超声波数控清洗器 (昆明市超声
仪器有限公司)。
2 方法
2． 1 样品制备 半边风 3． 2 kg切成块状(2 cm × 1 cm) ，加 95%
乙醇浸渍 3 d，过滤，得鲜根浸提液;药渣风干，粉碎，95%乙醇回
流提取两次，每次 2 h，提取液与鲜根浸提液合并，浓缩，得乙醇提
取物(ACE)213． 3 g。将 ACE 加水混悬，依次用石油醚、乙酸乙
酯、正丁醇萃取，得到石油醚部位(PEP)、乙酸乙酯部位(EAP)、
正丁醇部位(BAP)及萃余水部位(WAP)。
2． 2 样品抗大鼠中性粒细胞呼吸爆发作用
2． 2． 1 样品溶液的配制 按“2． 1”项所得到的 ACE、PEP、EAP、
BAP及 WAP分别用 DMSO配制成浓度为 100 μg·ml －1的母液，
然后将母液用 DMSO稀释成不同浓度的待测样品。
2． 2． 2 中性粒细胞呼吸爆发抑制率的测定［8］ 取 SD 大鼠，雌雄
不限，眼眶取血，1%肝素钠抗凝，葡聚糖 T － 500 沉降红细胞，淋
巴细胞分离液分离，低渗除去残留红细胞，用台盼蓝排斥法检测
大鼠 PMN纯度和活度 (均 ＞ 95%) ，再用细胞稀释液调整细胞浓
度为 2 × 106 个·ml －1。4 ℃保存，在 12 h 内使用，中性粒细胞
活力恒定。中性粒细胞在受到外源性刺激剂 PMA激活后发生呼
吸爆发，产生大量的活性氧自由基，自由基被发光剂鲁米诺捕获
产生化学发光 (Chemiluminesence，CL) ，PMN － CL 强度与 PMN
的细胞数量及 PMN 的呼吸爆发和吞噬功能正相关。取 1 ml
PMN细胞稀释液于发光杯中，向其中加入 200 μl鲁米诺工作液，
置于超微弱发光测量仪中孵育 10 min (参数设定:发光池温度 37
℃，电压 1 000 V，最长检测时间 1 800 s) ，记录自发光过程 (计数
时间间隔 5 s)。然后加入 10 μl 样品溶液(以 10 μl DMSO 为空
白对照)继续测定 5 min，加入 8 μg·ml －1 PMA 刺激剂 10 μl，继
续测定 15 min，记录测定结果。PMN － CL 强度以发光记数峰高
表示。按公式(1)计算 PMN － CL抑制率。
PMN － CL 抑制率(%) =
PMN － CL溶剂对照 － PMN － CL样品
PMN － CL溶剂对照
×
100% (1)
以 PMN － CL抑制率为纵坐标，样品浓度为横坐标，建立量
效关系曲线，通过量效曲线可求算出发光抑制率为 50%时样品
的浓度 (即 IC50值)。根据样品的 IC50值，比较各样品对中性粒
细胞呼吸爆发的抑制作用强弱，IC50越小，活性越强。以维生素 C
(Vc)作为阳性对照。
2． 3 样品对活性氧的直接清除作用
2． 3． 1 对 O －2 ·的清除作用 采用邻苯三酚 －鲁米诺 －碳酸缓冲
液(pH 10． 2)发光体系［9］测定样品对超氧阴离子的清除作用。
在发光杯中加入 10 μl 样品溶液(以相同量的 DMSO 作空白对
照)和 20 μl 邻苯三酚溶液，摇匀，再加入 970 μl鲁米诺 －碳酸缓
冲液混合溶液(混合比例 1∶ 2)启动反应，记录 CL 值(以峰高计
算) ，平行 3 次。按公式(2)计算样品对 O2
－·的清除率。建立
O －2 ·清除率与样品浓度的量效关系曲线，计算 IC50值。以 Vc作
为阳性对照。
O －2 ·清除率 (%)=
CL溶剂对照 － CL样品
CL溶剂对照
× 100% (2)
2． 3． 2 对 H2O2 的清除作用 采用 H2O2 －鲁米诺 －碳酸缓冲液
体系［10］进行测定。在发光杯加入 50 μl 样品溶液(以相同量的
DMSO作空白对照)和 50 μl 0． 5% H2O2 溶液，摇匀，再加入 900
μl鲁米诺 －碳酸缓冲液的混合液(混合比例 2∶ 1)以启动反应，
记录 CL值(以峰高计算) ，平行 3 次。按公式(3)计算样品对
H2O2 的清除率。建立 H2O2 清除率与样品浓度的量效关系曲
线，计算 IC50值。以 Vc作为阳性对照。
H2O2 清除率(%)=
CL溶剂对照 － CL样品
CL溶剂对照
× 100% (3)
3 结果
3． 1 半边风乙醇提取物及各极性部位对大鼠中性粒细胞呼吸爆
发的影响 中性粒细胞自发光稳定后的 CL值为(7 502 ± 210) ，加
入 PMA 后 CL 迅速升高，100 s 后达到最高峰值(98 8779 ±
3 694) ，为自发光稳定期的 132 倍。加入刺激剂后呼吸爆发的时
间短暂，且爆发强度高，说明该测定方法灵敏度良好。加入不同
浓度的各个样品后，中性粒细胞的呼吸爆发抑制情况见图 1。图
1 可见，ACE、EAP及 BAP对中性粒细胞呼吸爆发均具有一定的
抑制作用，且在一定浓度范围内呈明显的剂量依赖关系，其抑制
作用的强弱顺序依次为 EAP ＞ VC ＞ ACE ＞ BAP，对应的 IC50值依
次为 19． 7，24． 3，41． 4 和 80． 3 μg·ml －1。PEP和 WAP对中性粒
细胞呼吸爆发没有明显的抑制作用。
图 1 半边风乙醇提取物及其不同极性部位
对大鼠中性粒细胞呼吸爆发的影响
3． 2 半边风乙醇提取物及各极性部位对活性氧的清除作用
3． 2． 1 对 O2
－·的清除作用 ACE、PEP、BAP 和 WAP 对 O －2 ·
均无明显清除效果。而 EAP能强烈清除 O －2 ·，IC50值为 36 μg·
ml －1，其清除活性与阳性对照药 Vc 接近(表 1)。另外，EAP 对
O －2 ·的清除作用表现了明显的浓度依赖性效应(图 2)。
3． 2． 2 对 H2O2 的清除作用 PEP 与 WAP 对 H2O2 没有清除效
果，而 ACE、EAP及 BAP 则能不同程度的清除 H2O2。其中 ACE
和 BAP的清除作用较弱，EAP 的清除作用最强，IC50值为 0． 038
μg·ml －1，活性强于阳性对照药 Vc(表 1)。与对 O －2 ·的清除作
用相似，EAP对 H2O2 的清除作用也具有明显的浓度依赖性特征
(图 2)。
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时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 8 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 8
表 1 半边风乙醇提取物及各极性部位对 O －2 ·和 H2O2 的清除作用
μg·ml －1(珋x ± s)
样品
IC50
O －2 · H2O2
ACE / 0． 277 ± 0． 001
PEP / /
EAP 36． 0 ± 2． 9 0． 038 ± 0． 002
BAP / 0． 535 ± 0． 038
WAP / /
Vc 30． 3 ± 2． 4 0． 111 ± 0． 009
n = 3
(A)加入不同浓度 EAP后，O －2 ·发光体系的动力学曲线，
CL值(以峰高计算)越小，表明对 O －2 ·的清除效果越好。
(B)加入不同浓度 EAP后，H2O2 发光体系的动力学曲线，
CL值(以峰高计算)越小，表明对 H2O2 的清除效果越好。
图 2 不同浓度的 EAP对活性氧的清除效果
4 讨论
当中性粒细胞吞噬病原微生物或其他异物时，发生呼吸爆
发，释放大量 ＲOS与溶酶体蛋白酶，协同杀死细菌和清除异物。
然而，当中性粒细胞过量积聚于炎症部位，过量产生的 ＲOS会对
机体造成损伤，放大炎症反应，成为类风湿性关节炎、哮喘、过敏
性鼻炎等疾病的病因［11，12］。半边风在传统畲医药体系中长期作
为治疗类风湿性关节炎的药物应用，取得了较好的疗效，然而缺
乏实验数据支撑。本研究表明，畲药半边风对中性粒细胞呼吸爆
发具有显著的抑制作用，其活性部位为乙酸乙酯部位及正丁醇部
位。这一结果为半边风的临床应用提供了现代药理学证据，为其
后期开发提供了科学依据。
现有的研究表明，天然产物对中性粒细胞呼吸爆发的抑制主
要有两种作用机制:一是直接清除已经产生的 ＲOS［13］，即抗氧
化;二是抑制呼吸爆发过程中相关酶(如 NADPH 氧化酶)的活
性［14］。为了初步探明半边风的两个活性部位抑制中性粒呼吸爆
发的作用机制，我们进行了 ＲOS清除实验。结果表明，乙酸乙酯
部位可以有效清除 O －2 ·和 H2O2，其清除能力与著名抗氧化剂
Vc相当。这一结果提示清除 ＲOS 可能是乙酸乙酯部位抑制大
鼠中性粒细胞呼吸爆发的机制之一。另一活性部位 －正丁醇部
位仅表现了对 H2O2 较弱的清除效果。而 O
－
2 ·是中性粒细胞呼
吸爆发产生的第一个自由基型活性氧，在没有抗氧化剂存在的情
况下，它会引发一系列的链式反性，产生更多的自由基，如·OH、
H2O2 等
［15］。正丁醇部位缺乏对 O －2 ·的清除作用表明，抗氧化
并不是它抑制中性粒细胞呼吸爆发的原因，其可能机制仍需要进
一步实验的探讨。
参考文献:
［1］ 江苏新医学院． 中药大辞典，上册［M］． 上海:人民卫生出版社，
1977:1261．
［2］ 雷后兴，李水福．中国畲族医药学［M］．北京:中国中医药出版社，
2008:233．
［3］ 郑莉萍．树参化学成分的提取分离及抗氧化活性的研究［D］． 福建
中医药大学硕士学位论文，2010．
［4］ 黄敬耀，刘春梅，齐丕驺，等．树参叶抗心律失常作用的研究［J］．中
国中药杂志，1989，14 (6) :47．
［5］ 方乍满，周迎新． 枫荷梨化学成分的研究［J］． 中草药，1989，20
(1) :9．
［6］ Woodman Ｒ C，Ｒuedi J M，Jesaitis A J，et al． Ｒespiratory burst oxidase
and three of four oxidase － related polypeptides are associated with the
cytoskeleton of human neutrophils［J］． J Clin Invest，1991，87 (4) :
1345．
［7］ Moon B C，Girotti M J，Dawson Ｒ，et al． PMN superoxide radical pro-
duction following a metabolic － endocrine simulation of trauma［J］． Ann
Surg，1986，203 (3) :246．
［8］ 刘荣华，余伯阳，陈兰英，等．山里红叶多元酚酸类成分对大鼠中性
粒细胞呼吸爆发的抑制作用［J］． 中国药科大学学报，2008，39
(5) :428．
［9］ Guo A G，Wang Z Y． Autoxidation of pyrogallol － chemiluminescence
assay for superoxide dismutase activity［J］． Plant Physiol Commun，
1989，3:54．
［10］ 胡天喜，陈 妃，陈克明，等．荧光分析与医学［M］．上海:华东师范
大学出版社，1990:48．
［11］ Casbon A J，Allen L A，Dunn K W，et al． Macrophage NADPH oxidase
flavocytochrome B localizes to the plasma membrane and Ｒab11 － posi-
tive recycling endosomes［J］． J Immunol，2009，182 (4) :2325．
［12］ Hajkova V，Svobodova A，Krejcova D，et al． Soluble glucomannan isola-
ted from Candida utilis primes blood phagocytes［J］． Carbohydr Ｒes，
2009，344 (15) :2036．
［13］ Ciz M，Denev P，Kratchanova M，et al． Flavonoids inhibit the respiratory
burst of neutrophils in mammals［J］． Oxi Med and Cell Longev，2012．
［14］ Lee J P，Li Y C，Chen H Y，et al． Protective effects of luteolin against li-
popolysaccharide － induced acute lung injury involves inhibition of
MEK /EＲK and PI3K /Akt pathways in neutrophils［J］． Acta Pharmacol
Sin，2010，31 (7) :831．
［15］ Britigan B E，Ｒosen G M，Chai Y，et al． Do human neutrophils make hy-
droxyl radical ?Determination of free radicals generated by human neu-
trophils activated with a soluble or particulate stimulus using electron
paramagnetic resonance spectrometry［J］． J Biol Chem，1986，261
(10) :4426．
·9181·
LISHIZHEN MEDICINE AND MATEＲIA MEDICA ＲESEAＲCH 2014 VOL． 25 NO． 8 时珍国医国药 2014 年第 25 卷第 8 期