全 文 ：构建基于磁珠微流控芯片的 iFlora遗传信息高效获取系统*
马莉萍1, 伊廷双2, 左显维1, 张摇 彪1, 李云霞1, 韩根亮1**
(1 甘肃省科学院传感技术研究所, 甘肃 兰州摇 730000; 2 中国科学院昆明植物研究所
中国西南野生生物种质资源库, 云南 昆明摇 650201)
摘要: 磁珠以其比表面积大、 易与生物分子耦联、 操控方便等优点, 在生命科学中得到了广泛应用。 随着
微机电系统 (Micro Electro Mechanical Systems, MEMS) 技术的发展, 将磁珠应用到微流控芯片中构建磁珠
微流控分析系统, 为生物样品分离、 检测提供了一种全新方法。 新一代植物志 iFlora 融入现代 DNA 测序
技术, 应用高速发展的信息、 网络技术及云计算分析平台, 收集、 整合和管理植物物种相关信息, 以实现
物种智能鉴定和数据提取, 而包括 DNA条形码在内的遗传信息及其获取技术在 iFlora中的作用至关重要。
本文重点概述了基于纳米磁珠的微流控芯片技术及其在分子生物学领域中的应用, 提出构建基于纳米磁珠
微流控芯片的 iFlora遗传信息采集系统, 在微芯片上完成从 DNA 提取到测序全过程, 实现物种遗传信息
的快速、 高效获取。
关键词: 磁珠; 微流控芯片; DNA条形码; 新一代植物志; 遗传信息
中图分类号: TP 212. 2; Q 948. 2摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2013)06-779-05
A Noval Magnetic Bead鄄based Microchip for iFlora Genetic
Information Efficient Acquisition System*
MA Li鄄Ping1, YI Ting鄄Shuang2, ZUO Xian鄄Wei1, ZHANG Biao1,
LI Yun鄄Xia1, HAN Gen鄄Liang1**
(1 Institute of Sensor Technology, Gansu Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China; 2 Germplasm Bank of Wild Species,
Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China)
Abstract: Magnetic Bead (MB) has been widely applied in life science for its high surface area, coupling capacity
with biomolecules and convenience of being manipulated. With the development of Micro Electro Mechanical systems
(MEMS) technologies, MB鄄based bio鄄microsystem provide a new approach for separation and detection of biological
samples. Integrating modern DNA sequencing technologies and applying high鄄speed computer digitization, network
technology and cloud computing analysis platform for collection and management of species information, the next鄄
generation Flora, or iFlora is an intelligent application system for plant species identification and related information
acquisition. Efficient genetic information acquiring technology is key in building iFlora. This paper briefly introduces
the MB鄄based bio鄄microsystem technology and its application in molecular biology. The authors suggest a new MB鄄
based bio鄄microsystem iFlora genetic information collection system. Combined with MB technology, the total analy鄄
ses from cell lysis to DNA sequencing will be achieved on microchip, which will realize the quick and efficient ac鄄
quirement of genetic information.
Key words: Gnetic bead; Microchip; DNA barcodes; iFlora; Genetic information
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2013, 35 (6): 779 ~ 783
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 7677 / ynzwyj201313197
*
**
基金项目: 中国科学院科技创新 “交叉与合作团队冶 (31129001); 科技部国家高技术研究发展计划 (863 计划) 主题项目
(2012AA021801); 中国科学院大科学装置项目 (2009鄄LSFGBOWS鄄01)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: genlhan@ vip. sina. com
收稿日期: 2013-09-30, 2013-10-16 接受发表
作者简介: 马莉萍 (1974-) 女, 副研究员, 主要从事生物传感技术研究。 E鄄mail: malip219@ sina. com
摇 新一代植物志 iFlora的主要目的之一就是实
现物种的准确、 快速鉴定和相关信息的高效获
取, 而微型化、 高效化的获取包括 DNA 条形码
在内的遗传信息的装备是实现这一目的的关键所
在。 现有的遗传信息获取装备包括 DNA 提取系
统、 PCR扩增及纯化系统、 DNA测序仪等, 都存
在遗传信息获取周期长、 实验过程繁琐、 涉及较
多仪器设备、 体积大等缺陷。 研发集成化、 自动
化的便携式遗传信息高效获取装备是 iFlora 研发
在未来的发展方向。
磁珠技术为弥补当前遗传信息获取设备的不
足提供了全新思路。 该技术是 20 世纪 90 年代生
物分析学和磁珠载体技术结合而发展起来的一项
新型技术 (Hornes和 Korsnes, 1990; Pflueger 等,
1990; Liang, 1995)。 磁珠 (Magnetic Beads, MB)
是由磁性纳米颗粒与各种含活性功能基团的材料
复合而成的具有一定磁性及特殊表面结构的粒
子, 其可与含有相应靶物质的生物分子特异性地
结合形成新的复合物, 磁珠以其比表面积大、 易
与生物分子耦联、 操控方便等优点, 在生命科学
中得到了广泛应用。 近年来, 随着微机电系统技
术和生物医学工程领域的发展要求, 出现了利用
微流控芯片技术与磁珠检测技术相结合的芯片级
磁珠操控及反应器件, 着眼于构建一种高效、 快
速、 集成化的基于磁珠的生物样品分离检测微流
控芯片系统, 正成为生命科学研究热点。 本文在
介绍磁珠微流控芯片技术的基础上, 提出构建基
于磁珠微芯片的 iFlora遗传信息采集系统, 实现
从 DNA提取到测序等多个技术步骤的集成和优
化, 获得便携式、 自动化、 高精度的实验装备,
促进 iFlora遗传信息的快速、 高效获取。
1摇 遗传信息获取与 iFlora
在生物资源严重短缺、 生物多样性下降、 生
态环境极其脆弱、 生态安全形势严峻的情况下,
如何实现物种快速准确识别、 进而客观评价和应
用生物资源, 已成为世界性的新挑战。 2003 年,
Hebert等 (2003a, b) 首次以线粒体细胞色素 c
氧化酶亚基 I (COI) 作为动物中通用的物种鉴定
标记, 并提出 DNA条形码的定义, 即通过使用短
的标准 DNA片段, 对物种进行快速、 准确的识别
与鉴定, DNA条形码技术的出现为研究物种的进
化规律、 遗传变异、 系统发育以及生物多样性等
提供了理论依据。 近年来, 随着分子生物学技术
的迅速发展, DNA条形码技术作为传统分类方法
的有效辅助手段被广泛用于物种的鉴定 (Niesters
等, 1993; Brown 等, 1999; Wells 等, 2001; Tautz
等, 2002), 其在许多动物分类中得到了成功应用
(Ward 等, 2005; Yoo 等, 2006; Havermans 等,
2011; Thibaud等, 2013)。 但是由于 COI基因在植
物中的进化速率远慢于在动物中的进化速率, 因
此只适用于对一些藻类进行分类研究 (Saunders,
2005)。 为寻求一种通用的植物条形码, 许多学者
进行了积极的探索, 但至今没有达成明确的共识。
目前, 寻找通用的植物条形码, 实现快速准确的
物种鉴定和相关数据信息的方便快捷获取, 成为
未来发展的必然趋势 (李德铢等, 2012)。
iFlora正是在这种背景和需求下产生和发展
起来的。 iFlora 具有整合性、 信息化、 便捷性、
开放性和智能化的特点 (李洪涛等, 2012), 是
使用多途径进行植物物种鉴定的智能工具。 实物
库、 遗传信息获取系统、 数字化信息库和计算分
析系统的构建, 以及它们之间的紧密联接是 iFlora
研制的主要内容和工作框架 (曾春霞等, 2012)。
其中, 遗传信息获取体系是实现 iFlora 智能化的
关键核心之一, 该体系应包括一整套的实验技术
和实验装备, 因此, 建立遗传信息高效获取体系
可极大促进 iFlora构建的速度和效率。 目前, iF鄄
lora 遗传信息的获取要经过一系列的分子生物学
实验, 包括样品采集、 提取 DNA、 利用通用引
物 PCR扩增目的片段、 纯化 PCR 产物、 序列测
定与分析以及提交结果到相关数据库。 但现有的
分子生物学实验技术存在遗传信息获取时间长、
依靠大量人力投入、 实验繁琐、 涉及较多仪器设
备和空间、 缺乏标准和规范的实验体系等制约因
素, 较大的限制了该技术领域的发展和运用
(李洪涛等, 2012)。 因此, 研发高效、 自动化、
小型化整合的遗传信息获取体系是发展趋势之一
(Janzen等, 2005), 研制集成化、 微型化和智能
化的 iFlora信息采集系统是目标之一。
2摇 磁珠微流控芯片技术
2. 1摇 磁珠技术原理及特点
磁珠是由磁性微粒与各种含活性功能基团的
087摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
材料复合而成的具有一定磁性及特殊表面结构的
粒子, 其可与含有相应配体集团的的靶物质特异
性地结合, 形成磁珠鄄靶物质的复合物, 当外加
磁场时, 这种复合物因磁场作用而与其他组分分
离, 其原理见图 1。 由于磁珠在磁场中具有超顺
磁性的特点, 当外加磁场时, 磁珠可被磁化并吸
附在磁极上; 撤去外加磁场, 磁珠的磁性消失,
磁珠重新分散在溶液中。 由于磁场操纵是非接触
式的, 即磁场不与微通道中的反应物相接触而对
其进行操作, 因此与电场相比, 有效地避免了操
纵受到反应物 pH 值、 温度、 表面电荷、 离子浓
度等因素的影响。
图 1摇 磁珠技术原理
Fig. 1摇 The principle of magnetic separation
目前, 磁珠以其颗粒小、 比表面积大、 偶联
容量大、 悬浮稳定性好、 有利于偶联反应顺利进
行等优点, 在细胞分离 (Garlie 等, 1999; Yoo
等, 2013)、 DNA 提取 (Legler 等, 2009; Zhang
等, 2009; Witt等, 2012)、 蛋白检测 (Katharine
等, 2007; Yan 等, 2013)、 生物检测 (Min 等,
2003)、 酶联免疫 (Zhao 和 Shippy, 2004) 等生
物技术中表现出良好的研究和应用前景。 随着应
用研究的深入, 磁珠技术已趋于成熟, 一些厂家
推出了针对生物、 医学领域专用的磁珠及其配套
仪器, 如 Dynal, Spheorethc 等, 其磁珠产品功
能涵盖了 DNA 提取、 蛋白分离、 细菌分离、 细
胞捕获等方面。
2. 2摇 基于微机电系统技术的磁珠微流控芯片
虽然常规的磁珠技术比较成熟, 能有效实现
磁场操控, 已被广泛应用于各种生物样品检测,
但也存在着一些技术缺点, 如: 需人为操控每个
实验环节, 操作步骤繁琐、 费时; 使用外置磁
场沉降磁珠, 实验平台较庞大, 难以集成化、
微型化, 无法实现自动控制。 随着微机电系统
(MEMS) 技术及其在生命科学中的应用发展,
磁珠技术也向着微型化和集成化方向发展, 首
先, 利用 MEMS 工艺制作微流路芯片, 采用微
驱动方法控制液流进行各种混合和反应, 可避免
生物实验中繁琐的人为操作; 其次, 在驱动控制
方面, 利用 MEMS 工艺, 在芯片上制作平面线
圈作为电磁控制单元, 利于实现微型化, 克服了
常规磁珠技术存在的缺点。
这种采用 MEMS 工艺制作的微磁控单元和
微流路器件构建的磁珠微系统, 将样品制备、 生
化反应、 分离和检测等基本操作单元高度集成
化, 整个实验过程中, 磁珠无需取出或转移至其
他芯片, 所有步骤在一块芯片上完成, 流程简
单, 避免了复杂的液流控制, 使固液分离更加简
便、 灵敏, 为实现系统的自动化和便携化提供了
技术保障。 磁珠微流控芯片采用巨磁电阻 (GMR)
传感器检测磁场, 自旋阀型的 GMR 材料具有极
高的磁场灵敏度, 以自旋阀功能材料为基础的
GMR传感器可以实现对单个磁珠的精确检测,
进而实现检测单个待测生物分子的研究, 所以磁
珠微系统有望实现单分子级的分析水平 (Edel鄄
stein等, 2000; Graham等, 2003; Li等, 2006)。
2. 3摇 磁珠微芯片在生命科学研究中的应用
现有的微全分析系统大多都是基于光学原理
检测的, 其分析步骤复杂, 且需要训练有素的专
业人员才能进行; 且光学生物芯片的检测过程依
附于昂贵的生化及光学检测设备, 不仅成本高,
也使其应用总依赖于庞大的中心实验室。 磁珠微
芯片是基于磁性测量原理的第二代生物芯片, 与
第一代基于光学原理的生物芯片相比, 以磁标记
取代了传统的荧光标记, 具有性价比高、 价格
低、 更高的精确度、 分辨率、 稳定性、 集成度、
可重复使用和能够定量测量生物分子的数量等特
点。 近年来, 磁珠微流控芯片在生命科学研究中
得到了应用, 从而出现了 DNA提取芯片 (Taylor
等, 2005; Yeung 和 Hsing, 2006 )、 PCR 芯片
(Hua 等, 2010)、 测序芯片 (Liu 等, 1999; Xu
等, 2003) 等。
1876 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 马莉萍等: 构建基于磁珠微流控芯片的 iFlora遗传信息高效获取系统摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
由于继承了毛细管电泳的特性, 磁珠微流控
芯片技术在 DNA测序领域具有独特的应用优势。
随着微流控芯片技术上的不断完善和发展, 微流
控分析技术能分离的 DNA 片段长度也在逐步扩
大, 出现了可同时平行分析的多通道微流控芯
片, Liu等 (1999) 采用 7. 5 cm 长的分离通道,
在 20 min 内完成了对 500 bp DNA 的序列测定,
准确度达 99. 4% 。
3摇 构建基于磁珠微芯片技术的 iFlora 遗
传信息采集系统
快速准确获取和增加植物物种遗传信息是实
现 iFlora的关键所在, 目前尚无专门用于植物分
子鉴定的系统、 规范的实验技术及其实验装备体
系。 磁珠微流控芯片技术正好可以满足 iFlora研发
的需要, 使遗传信息高效获取体系的集成化、 便携
化和自动化成为可能。 根据 iFlora对所获得对遗传
信息的要求, 研究工作应以磁珠技术为切入点, 以
微流控芯片技术为依托, 将生物反应、 磁珠技术和
微流控技术相结合, 研制基于磁珠微流控芯片的
iFlora信息采集系统, 从而实现在微流体芯片上实
现 DNA提取到测序等全过程, 提高目前遗传信息
的获取效率。 研究内容包括以下几方面:
(1) 制备功能化的磁珠, 实现对植物基因
组 DNA提取, 这种方法在微量材料 DNA提取中
独具优势。
(2) 某些特异 DNA 片段的富集, 可制备表
面探针化的磁珠, 如利用表面包被通用引物的磁
珠直接富集目标 DNA, 通过这种富集得到的产
物具有很高的纯度, 无需经过 PCR 及后续的纯
化过程, 可直接对其进行测序。
(3) 针对某些植物的 DNA 条码鉴定, 可以
制备特异的磁珠, 如: 直接、 快速提取叶绿体细胞
器, 获得叶绿体总 DNA, 从而减轻测序工作量。
(4) 针对不同碱基, 研制 4 种不同的磁标记
纳米组装体, 结合磁场诱导和 GMR传感器精确检
测, 实现芯片上的单分子测序, 理论上可以实现至
少对 1 400 bp的单链特征 DNA片段进行准确测序。
(5) 根据生物反应的需求, 利用 MEMS 工
艺, 设计、 制作模块化的 iFlore 磁珠微流控系
统, 如 DNA提取模块、 PCR 扩增及产物纯化模
块、 测序模块等, 根据实际需求选择单个模块或
模块间的任意组合, 利用各类特异的纳米磁珠进
行 DNA 的分离、 富集、 定位、 和测序, 实现系
统的集成化和自动化。
上述工作的技术难点是如何能准确地从复杂
背景信号中捕捉和测量目标信号, 实现对磁标记
组装体的单分子测定, 这需要从事微机电技术、
集成电路技术、 纳米技术和生物技术的研究者共
同努力, 最终获得高精度、 自动化和便携的 iF鄄
lora遗传信息获取集成装备, 摆脱目前对实验室
和操作人员的过度依赖, 随时随地快速、 高效获
取 iFlora遗传信息, 本技术的开发将为 iFlora 建
设提供技术保障。
4摇 结语
随着生物、 材料、 微电子、 微加工、 计算机
等学科的发展, 微流控芯片技术得到了迅速发
展, 系统的集成化和微型化程度也越来越高, 微
流控芯片技术在生命科学研究中取得了较好的成
绩。 从细胞分析、 蛋白质分析、 再到 DNA测序,
已经发展到可以完成许多分子生物学实验过程的
水平, 其应用几乎涉及到整个生物学领域。 相信
在不久的将来, 以微流控分析芯片为核心的检测
技术将逐渐取代现行的 iFlora 遗传信息获取设
备, 实现高通量、 高精度获取植物遗传信息, 从
而真正实现设备的小型化、 自动化。
也参摇 考摇 文摇 献页
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