全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 11期
微流控芯片分析技术在生化研究中的应用进展
蔡绍皙 郭志刚
(重庆大学生物工程学院,重庆 400044)
摘 要: 综述了微流控芯片分析技术在生物和化学领域中进展, 主要从药物筛选、PCR、细胞研究和微流控芯片电泳 4
个方面总结目前的进展。
关键词: 微流控分析技术 药物筛选 微流控芯片电泳 PCR 细胞研究
The Application Progress ofM icrofluidics Techniques
on Biology and Chem istry
Ca iShaoxi Guo Zhigang
(B ioengineering College of Chongqing University, Chongqing 400044 )
Abstrac:t The application prog ress o fm icro fluid ics techn iques on b io logy and chem istry were rev iewed. Recent research progress
m a inly includ ing drug screen, PCR, ce ll research and m icro flu idic ch ip e lectrophoresis w ere summ er ized.
Key words: M icro flu idic ana lys is techn ique D rug screen M icroflu id ic chip e lectropho resis PCR Ce ll research
收稿日期: 20100413
作者简介:郭志刚,男,研究方向:生物学; Em ai:l zhongshu .i 2008@ yahoo. com. cn
通讯作者:蔡绍皙,男,硕士,教授,博士生导师,主要从事生物力学与组织工程研究; Em ai:l sxca@i cqu. edu. cn
微流控分析芯片在微流道的基础上结合多种微
型器件如微泵、微阀、微储液器、微电极、微检测元件
和连接器等功能元器件, 已经成为分析化学重要的
分析手段和技术。自从 Manz[ 1]于 1990年在微流控
芯片技术发展初期提出 微全化学分析系统!的概
念以来,微流控芯片技术经历了迅速的发展时期,目
前有专门的杂志如 Lab on a chip、Sensors and Actua
tors、Analy tic chem istry、Sensors and Acuators等有专栏
报道相关研究进展。
近年来微流控芯片分析在化学合成 [ 2]、化学分
析检测的基础上发展过渡到生物和药物研究领域,
有许多典型的研究和应用展现。微流控芯片的微尺
度适合于细胞自身的体积维度,同时微流控芯片上
对试剂的低耗和高热传质性质适合于 PCR的小型
化和高通量化应用,结合比较成熟的电泳技术,在药
物筛选方面有着其自身独特的优势。目前已经有多
种分析检测手段用于微流控芯片分析技术, 现主要
从药物筛选、PCR、细胞研究和微流控芯片电泳 4个
方面对这个快速发展的检测领域做一个概述。
1 细胞研究
微流控芯片系统在细胞学研究方面有许多的优
越性。例如, 微流控芯片的通道直径通常在 10 -
100 m,与单个生物细胞在尺度上具有相容性; 微
流控芯片具有网络式二维或三维通道,容易操纵单
细胞,可集成多种操作分析方法; 在微流控系统上可
以将细胞进样、控制和分离检测系统集成在一起。
因此,在微流控芯片上进行细胞研究越来越受到人
们的重视。
11 光学检测
光镜下对微流控上装置的检测可以及时观察芯
片上的变化和反应,便于操作。 Inoue等 [ 3]用相差 /
荧光显微镜对微流控芯片上培养的单细胞进行连续
观察,空间分辨率可达 02 m。
荧光检测非常灵敏,所以在微流控芯片上应用
较多,其中多应用激光诱导荧光检测来进行微流控
上细胞及其裂解物的检测, 也有利用被检测物质自
身的荧光来检测的。美国 W ash ing ton大学的 Y a
ger
[ 4 ]研究组在微流控芯片上对大肠杆菌进行溶膜,
2010年第 11期 蔡绍皙等 :微流控芯片分析技术在生化研究中的应用进展
提取细胞中 半乳糖苷酶,采用荧光素酶对 半乳
糖苷酶进行检测。该技术不仅能用于大肠杆菌分
析,还可用于分析其它许多不同类型细胞。K rger
等 [ 5]用半导体激光器聚焦微流控芯片上微通道的
交叉点处,并由雪崩式光电二极管收集荧光标记的
单细胞荧光信号, 有计算机类分析其信号, 然后控
制微通道内的液压, 从而可以实时控制细胞的流
向, 实现对细胞的筛选。此外由于不同种类、大小
的细胞发出的荧光强度不同, 也可由数据来分析
细胞。
此外,韩国的 Yoo等 [ 6]利用微流控芯片上固定
的生物发光细菌而检测有毒物质。避免了激发光源
的使用。利用光蚀刻技术及聚合物聚乙烯乙醇 苯
乙烯吡啶 ( PVASbQ)在微流控芯片上固定细胞,生
物发光的强度随着细胞中氧化损伤程度增加而加
强, 088 mmo l/L过氧化氢的注射浓度使得生物发光
强度增加 10倍。日本 Juntendo大学的 K imura等 [ 7]
设计了细胞培养型芯片, 该系统便于微空间内流体
控制, 并且由扫描热透镜显微镜作为检测系统,能在
无标记物的情况下, 高灵敏检测非荧光生物物质。
他们检测了单个细胞中细胞色素 C从线粒体到细
胞质中的释放过程, 对于实时观察细胞内的代谢变
化非常有帮助。
12 电化学检测 ( E lectrochem ical detection, ED )
武汉大学程介克研究组 [ 8]用低噪声碳纤维微
电极实时监测了微通道上单个鼠嗜铬神经癌细胞
( PC12)中神经递质多巴胺量子在刺激剂的释放 (图
1)。山东大学的 X ia等 [ 9 ]用安培计来检测微流控芯
片上细胞内的物质, 在碳纤维磁盘捆绑电极 ( CFD
BE )的作用下得到了 500 ∀ 10- 5 mol/L抗坏血酸和
两张单个原生质体的电泳图,整个细胞分析过程如
进样、定位溶解等由电力操纵, 可以检测多种细胞中
具有电活性的物质。巴西的 Danie l等 [ 10]组装了一
种由交错金电极组成的微流控细胞芯片, 在用循环
伏安法对 K4 Fe( CN ) 6为模式的芯片进行电化学性
能研究后用电流测定法、双安培测定法及电化学常
用的流式注入分析法 ( F IA )微流控上流动细胞的电
化学特征的影响,得到的数据与理论非常吻合,显示
了用电极阵列分析细胞的应用潜力。美国 Motoro la
实验室的 L iu等 [ 11]设计了一个微流控 DNA微阵列
传感器, 包括有一种微芯片、微流控混合机、瓣膜、
泵、通道、腔室、加热器和 DNA微阵列传感器。DNA
微阵列由电化学检测分析。
图 A是 50 mm ol /L尼古丁刺激释放多巴胺的结果。该
细胞受刺激释放多巴胺约 50 s,随后由于连续释放导致
胞内可释放囊泡耗尽,再没有电流尖峰出现。图 B是尼
古丁刺激另一个细胞得到的结果,与图 A结果相比,尖
峰电流变化不明显, 只是胞吐释放的频率降低, 表明刺
激剂浓度对胞吐释放没有明显影响。
图 1 应用不同浓度的尼古丁刺激释放多巴胺的结果
2 微流控芯片电泳
微流控芯片电泳主要由毛细管电泳发展应用而
来 [ 12]。利用电泳主要是可以将微流控芯片中的复
杂组分分离并可以记录下相关的电泳图谱用于分
析。由于微流控芯片几何尺寸较小, 可以用小的电
压获得大的电场强度, 电泳分离时间显著加快。分
离的情况从其分离的电场强度、检测长度、频率大小
及迁移率等来评定,电泳图谱则可以是由电流、激光
诱导荧光强度等来得到。Tabuch i等 [ 13]开发了在一
种微流控芯片,在芯片上培养了 Jurkat T淋巴细胞,
并且从培养的细胞中提取蛋白质进行电泳分离, 研
究了该种细胞在应力诱导编程性细胞死亡过程中的
蛋白表达。Munce等 [ 14 ]用微流控中的平行微通道
进行单细胞毛细管电泳,从而分离细胞组分,而被标
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记的组分经过激光诱导荧光来检测。
芯片电泳最佳的检测器是 CCD, CCD是 Charge
Coupled Device的缩写,中文名为电子耦合器件,数
码相机和扫描仪中可以把光学影像转化为数字信号
的半导体装置,利用 CCD的检测器和整个检测装置
简易, 有效。新加坡生物传感器兴趣聚焦研究组
( BFIG )的 Hui等 [ 15]用微流控系统来提取血液中的
基因组 DNA和病毒 RNA,这个系统集合了微流控
芯片、加样控制系统、显微镜 CCD采集和即时显示
系统 (图 2) ,从而可以实现样品的精确加样和控制
系统, 用常规 PCR和电泳分析验证了其良好的提取
效果。
图 2 用于 DNA和病毒 RNA提取的检测试验装置平台
介电电泳 (双向电泳 ) ,可以利用颗粒的不同电
解特性而在不均一 AC电场 (有电压梯度 )中将颗粒
分开。美国普渡大学的 L i等 [ 16 ]用介电电泳在微流
控芯片上有效地分离活的和热处理的 (死的 )无害
李斯特细菌,可以区别 90%的活细胞和死细胞。在
双向电泳力和电流体力的作用下, 由活细胞和死细
胞在不同频率作用下所表现的不同的吸附特性而实
现分离。A ra i等 [ 17]通过集成微流控装置上的光镊
和介电电泳力, 实现了目标细胞的高纯度筛选。当
大批细胞进入注入孔内, 目标细胞即被激光遥感操
纵系统捕获进入主通道, 在进样泵作用下到达提取
孔,而其它非目标细胞会在电极作用下极化,在介电
电泳作用下远离目标细胞,随后被泵到排出孔,从而
实现单个目标细胞的提取。整个分离时间不超过
20 s。
斯坦福大学的 Wu等 [ 18]组装了一种新颖的微
流控芯片,可以对进样、融胞、化学反应等精确控制,
并且有着多种检测方式, 可以在体视显微镜下观察
颜色反应、也可融胞并进行芯片电泳,细胞中 5种标
记的氨基酸的电泳图谱与毛细管电泳图谱相比, 峰
的变化都一样,但是在芯片的电泳图谱显得更宽些,
也多一条细胞碎片所成的峰。但是芯片上整个单细
胞分析过程 # 1 h,而且以后芯片上探针的应用及与
质谱的联用等都显示出此微流控芯片的潜在应
用价值。
浙江大学的 Y in等 [ 19 ]用一种新颖的多层微流
控芯片上分析人体癌细胞中 (H epG2 cellline)成骨
肉瘤 ( ROS)以及肾小球刺激激素 ( GSH ) ,利用芯片
电泳将细胞中 ROS和 GSH分离出来, 并用激光诱
导荧光来检测并得到了相应组分的电泳图 (图 3)。
H ellm ich等 [ 20]用激光诱导荧光来检测基于 PDMS
的微流控芯片上的单细胞裂解组分, 用单个 Sf 9昆
虫细胞 (Spodop tera f rugip erda )在特定的微流控设备
中所做的分析试验展示了一个绿色荧光的蛋白质清
晰的电泳图。他们在改进的 PDMS微流控设备上用
无标记天然激光诱导荧光检测的分离效率和检测敏
感度,并测出了在微流控芯片上用天然无标记 UV
L IF(紫外 激光诱导荧光 )对单个草地贪夜蛾 ( Spo
dop tera f rug ip erda) Sf 9细胞的第一个电泳图 [ 21]。
电场强度为 400 V /cm, 检测长度为 2 cm; a.未刺激的;
b.经百草枯刺激;图谱上的峰与毛细管电泳分离的电泳
图的起始点相符合
图 3 10个 H epG2细胞中 ROS和 GSH的电泳图谱
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3 PCR
微流控芯片的流道体积和尺度特别适合于模板
样本少, 试剂耗费少的 PCR检测, 同时由于微流控
系统的传质、传热特别迅速, 使得芯片上的 PCR耗
时更短,检测更加灵敏。
PCR的检测方式主要用来检测用微流控芯片
分离的核酸样品。中国科学院的 Chen等 [ 22]利用一
种可以连续从血液样本中分离裂解白细胞并能纯化
其中 DNA的微流芯片来提取细胞基因组 DNA并用
PCR检测所提取的 DNA,证明用此方法可以提取到
比试剂盒多 1 000多倍的 DNA,为生物样品的前处
理提供有力的工具。
B laze等 [ 23]在微流控芯片的基础上制作了 生
物处理序列工厂 !, 可以对 250 nL 的样液进行
PCR,并且整合 Sanger测序的步骤, 仅仅用 1 fm ol
的 DNA模板就可以完成对连续 550个碱基的测
序,精确率达到 99% , 显示了芯片上大规模低耗测
序的可能性。
4 药物筛选
微流控芯片在集成化和与生物细胞良好的相容
性的基础上,也为大规模高通量药物筛选提供了绝
佳的检测平台。
大连物理化学研究所林秉承课题组在这方面多
有建树,他们在 2007年设计了非常紧致的微流控药
物高通量筛选芯片, 芯片由 8个对称的细胞培养和
药物梯度形成区域组成, 可以在芯片上一次完成对
多种药物和药物浓度梯度的高通量药效试验 [ 24 ]。
最近他们用基于细胞的微流控芯片研究药物代
谢 [ 25]。他们研究设计制备了一种多层集成化微流
控芯片,将肝微粒体固定在芯片上,药物通过芯片固
定化的肝微粒体进行代谢, 并与下游的芯片电泳和
细胞培养单元相集成。利用该芯片可同时完成对药
物的代谢物检测和代谢物的细胞毒性评价, 显示了
微流控芯片研究药物代谢等复杂过程的能力, 为新
药发现、药理学和毒理学研究, 以及细胞水平药物筛
选提供了一个重要的技术平台。
5 总结与展望
综上,微流控芯片由于自身特点在生物化学
方面的研究有良好的优异性。微流控 PCR、电泳
和微流控细胞培养的研究也为微流控药物筛选提
供了非常优良的检测集成基础。而且微流控芯片
的检测方法很多样, 一个芯片上往往可以集成多
种检测手段,比如在镜下及 CCD实时采集可视化
操作及观察, 电极对微流控芯片上的细胞的控制
及电泳, 紫外诱导荧光对细胞的显色观察及相关
荧光电泳图谱等。整体上显示了微流控芯片的检
测方法的多样化和集成化, 正逐渐向着芯片实验
室的方向发展。
微流控芯片测序和药物筛选将是未来重点发
展的领域,需要更多的细胞研究模型、药效作用模
型的建立和支持。
参 考 文 献
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