全 文 ：鹿茸再生干细胞成骨诱导(微粒体)培养体系的
建立
孙红梅 , 杨福合 , 邢秀梅 , 刘琳玲 , 赵海平 , 李春义
中国农业科学院特产研究所 ,吉林 132109
摘　要:针对鹿茸再生活体研究周期长 、耗资大 、对动物损伤大等问题 , 利用在培养液中加入 TGF-β1、地塞米
松 、抗坏血酸 、β-磷酸甘油等对鹿茸再生干细胞进行体外诱导 ,成功建立了一种鹿茸再生干细胞体外诱导成骨
的培养体系 ,模拟了鹿茸软骨内骨化的生长过程 。
关键词:鹿茸再生干细胞;成骨;微粒体培养
中图分类号:S825;Q7　　　文献标识码:A　　　文章编号:1000-5684(2010)06-0680-04
Establishment of Micromass Culture System for Antler Stem Cell Induc-
tion Toward Osteoblast Differentiation in Vitros
SUN Hong-mei , YANG Fu-he , XING Xiu-mei , LIU Lin-ling , ZHAO Hai-ping , LI Chun-yi
Institute of Special Wild Economic Animal and Plant Science , CAAS ., Jilin 132019 , China
Abstract:In vivo experiments involve the problems of long cycle , high cost and great damage to animal.
Therefore , in this experiment , we established a micromass culture system to induce antler regeneration
stem cell differentiation toward osteoblasts in vitro by adding transforming growth factor-β1 (TGF-β1),
ascorbate-2-phosphate , dexamethasone , β-glycerol phosphate to the culture medium.By so doing , we
successfully mimiced the in vivo process of antler endochondral ossification , and laid the fundation for the
research of antler biology , regeneration , ossification .
Key words:antler stem cell;ossification;micromass culture
　　鹿茸作为鹿科动物头盖骨上的骨质性附属器
官 ,具有很高的药用价值 ,而且每年脱落并完全再
生一次 , 再生鹿茸生长极为迅速 , 最快可达
2 cm/d[ 1-2] 。鹿茸的骨质结构分化很细 ,既有成软
骨细胞 、成骨细胞又有前成软骨细胞 、前成骨细
胞 ,因此为医学领域断肢的再生以及长骨骨化机
制的研究提供了很好的模型。但鹿茸再生的周期
较长 ,直接用活体进行试验费用较高 ,对动物损伤
较大。对鹿茸的研究表明 ,鹿茸的发生与再生都
是以干细胞生长为基础的过程 ,这些干细胞位于
鹿角柄的骨膜中 ,因此鹿角柄骨膜细胞被称为鹿
茸再生干细胞[ 3-5] 。
近年来 ,微粒体培养体系作为骨髓间充质干
细胞体外诱导及软骨内成骨研究的重要手段 ,受
到了许多学者的关注[ 6] 。研究表明 ,这套体外培
养系统可用于人类及其他动物的骨髓间充质干细
胞的诱导分化研究[ 6-8] 。许多学者已经进行了脂
肪源干细胞 、骨髓基质细胞等的诱导分化研
究[ 6 ,8] 。Yue Xu等[ 9] 报道 ,使用脂肪源性干细胞
通过微粒体培养体系可观察到软骨内成骨的早期
分化 。本试验建立了鹿茸再生干细胞体外诱导的
微粒体培养体系 ,可以作为鹿茸研究的体外模型 ,
模拟了鹿茸软骨内骨化的生长过程 ,旨在为鹿茸
生物学 、再生医学以及长骨骨化等领域的研究提

通讯作者
基金项目:国家自然科学基金项目(30971664)
作者简介:孙红梅 ,女 ,在读博士 ,主要从事鹿茸生物学与分子生物学研究。
收稿日期:2009-11-28　　修回日期:2010-02-01
吉林农业大学学报　2010 ,32(6):680 ～ 683 http :// xuebao .jlau .edu .cn
Journal of Jilin Agricultural University E-mail :jlndxb @vip.sina .com
供有效的手段。
1　材料与方法
1.1　试验材料
3岁龄梅花鹿 1 头 ,来源于中国农业科学院
特产研究所实验动物基地茸鹿养殖场。
青霉素 、链霉素 、抗坏血酸 、二甲基亚砜(DM-
SO)购于 Sigma 公司 , 地塞米松购于日本光和纯
药 ,DMEM 培养基 、标准胎牛血清(FBS)、胰蛋白
酶 、胶原酶 Ⅰ(collagenase Ⅰ)、谷氨酰胺 、hepes等
购于 invitrogen公司 ,甘油磷酸钠购于北京经科宏
达公司 , TGF-β1购于 Peprotech 公司 ,其他化学试
剂均为分析纯。
1.2　方法
1.2.1　鹿茸再生干细胞的原代培养　将刚处死
的梅花鹿的头带回实验室 ,刮净鹿茸角柄及其周
围的茸毛 ,用碘酒进行皮肤消毒 ,然后用酒精棉球
脱碘 ,消毒后在无菌室取出角柄骨膜 。将角柄骨
膜剪成 1 mm 的组织块 ,然后用 100 U 胶原酶 Ⅰ
37℃消化 ,当组织块周围出现毛边时 ,离心去除消
化液 ,用 DMEM 清洗一次 ,然后接种到细胞培养
瓶中 , 37℃、5%CO2 及饱和湿度条件下培养 5 ～
7 d ,待细胞生长至 80%融合时用 0.08%胰酶消
化 ,传代 ,备用。
1.2.2　鹿茸再生干细胞的微粒体培养　取生长
至 80%～ 90%的传代细胞 ,用胰酶消化 ,计数。
将含有1 ×107 个单细胞的细胞悬液转移至 50 mL
离心管中 ,1 000 r/min离心 5 min ,完全去除上清
液。加入 100 μL DMEM 培养基重悬细胞。将细
胞悬液加到 6孔细胞培养板的中央 ,在其周围分
散滴加大约200 μL完全培养基 ,细胞培养箱(5%
CO2 、37℃)孵育 3 h。然后 ,缓慢加入 2 mL 软骨诱
导培养基(DMEM 含 10%FBS 、双抗 、10-7 mol/L地
塞米松 、2.5 ×10-4 mol/L 抗坏血酸 、10 ng/mL
TGF-β1),每隔 3 ～ 4 d 换 1 次培养基 。3 周后 ,更
换骨化诱导培养基(DMEM 含 10%FBS 、双抗 、
10-7 mol/L地塞米松 、2.5×10-4 mol/L 抗坏血酸 、
7×10-3 mol/L β-甘油磷酸钠)继续培养 2 ～ 3周 。
1.2.3　双重染色　阿尔氏申蓝可以将软骨染成
蓝色 ,茜素红可以将骨染成红色 ,本试验用二者进
行双重染色 ,以检验培养微粒体的成骨情况。
染色液的配制:0.3%阿尔氏申蓝(Phentex
Corp.USA)70%乙醇溶液 , 0.1%茜素红(Fluka)
95%乙醇溶液 、冰醋酸各 1 份 , 依次溶于 17 份
70%乙醇中 ,混匀。
染色:取出培养约 5 周的微粒体组织块 ,用
95%的乙醇固定约 24 h ,用自来水洗后 ,放入染色
液 ,37℃染色 2 d 。
分色与透明:蒸馏水浸洗 1 min ,0.5%KOH浸
泡30 min ,当组织中的骨呈玫瑰红色时 ,将其依次
浸入不同比例(1∶5 , 2∶3 , 3∶2 , 4∶1)的纯甘油与
0.5%KOH 溶液中 ,标本沉底为止 ,纯甘油中长期
保存 。
1.2.4　切片制作　取出微粒体 , PBS 冲洗 1次 ,
中性福尔马林固定。经过脱水 、透明 、浸蜡 、包埋
后 ,将其切成 4 μm的切片 ,60℃烘干。
1.2.5　甲苯胺蓝染色　用质量分数为 2%的甲
苯胺蓝酒精染液染色 5 min , 并以体积分数为
95%的酒精分化 1 min , 水洗后以体积分数 70%、
80%、90%和 100%的乙醇逐级脱水 , 二甲苯透
明 , 树胶封片 , 显微镜下观察拍照。
1.2.6　茜素红染色　用含 0.1%茜素红的 Tris-
HCl(pH 8.3)37℃染色 30 min 。蒸馏水冲洗 ,干
燥 ,封片。显微镜下观察 。
2　结　果
2.1　鹿茸再生干细胞的原代培养
用组织块消化法培养鹿茸再生干细胞 ,消化
后的组织块均匀飘浮于培养基中 , 2 ～ 3 d后组织
块逐渐粘附于细胞培养瓶底部;5 ～ 7 d 后观察细
胞的生长情况 ,培养基颜色略黄 ,组织块四周发散
状爬出细胞 ,在靠近组织块的中央区细胞排列极
其紧密 ,紧密程度依次向四周递减 ,细胞呈梭状 ,
胞体较大 。传代培养后 , 12 ～ 24 h 即可完全贴
壁 , 细胞呈较均一的长梭形 , 约 3 d 细胞可铺满
整个培养瓶底面 ,可继续传代扩增。传代后的细
胞形态无明显变化 , 性质稳定(图 1)。
2.2　鹿茸再生干细胞微粒体培养
高浓度细胞重悬液孵育 3 h 后 ,形成一肉眼
可见的白色圆形沉淀圈 ,在添加诱导培养液后沉
淀圈并不浮起或漂移。72 h后沉淀圈消失 ,培养
基中出现一肉眼可见的白色微球 ,继续培养 3 ～ 5
周后直径可达 3 ～ 4 mm(图 2)。在光学显微镜下
该微球表现为黑色的不透明椭圆形沉淀物 ,原沉
淀圈区域细胞消失 ,仅在其边缘有一环形的残余
细胞带。
681孙红梅等:鹿茸再生干细胞成骨诱导(微粒体)培养体系的建立
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University
图 1　传代培养的鹿茸再生干细胞
Fig.1.Subcultured antler stem cells(200×)
图 2　培养 3周后鹿茸干细胞的微粒体
Fig.2.Cell pellet formed 3 weeks after culture(50×)
2.3　染色鉴定结果
双重染色将培养 5周的组织块染成红色 ,没
有蓝色(图 3)。
图 3　双重染色的组织块
Fig.3.Double staining tissue(50×)
　　说明鹿茸角柄骨膜干细胞经过微粒体培养 、
成骨诱导后形成了骨组织 。甲苯胺蓝是软骨的标
志性染剂 ,培养 21 d的组织切片甲苯胺蓝染色呈
蓝色 ,说明该组织有软骨存在(图 4)。经过 2周
成骨诱导后茜素红染色呈玫瑰红色 ,说明经过成
骨诱导后 ,有骨组织存在(图 5)。
图 4　甲苯胺蓝染色
Fig.4.Toluidine blue staining(100×)
图 5　茜素红染色
Fig.5.Alizarin Bordeaux staining(200×)
3　讨　论
本试验以鹿茸角柄骨膜细胞即鹿茸再生干细
胞为研究对象 ,参考前人的方法并针对该细胞的
特性进行改动 ,建立了鹿茸再生干细胞成骨诱导
的培养体系。在培养体系中添加各种因子 ,对干
细胞进行诱导 ,使其向成骨细胞方向转化 。维生
素C 为合成胶原所必需 ,还可调节 ATP 酶与碱性
磷酸酶(ALP)活性及非胶原基质蛋白质的合成。
β-甘油磷酸钠可为成骨细胞功能活动提供磷离
子;地塞米松可诱导骨髓基质干细胞向成骨细胞
方向转化 ,对成骨细胞的增殖与分化有明显促进
作用[ 10-14] 。试验表明 ,鹿茸再生干细胞在特定培
养液中培养 72 h后 ,在培养皿中形成了肉眼可见
的白色微球 ,直径可达 3 ～ 4 mm ,继续培养 3 ～ 5
周后 ,对组织进行固定 、切片 、染色等处理后 ,鹿茸
角柄骨膜干细胞成功诱导为软骨细胞和成骨细
胞。本试验表明使用鹿茸再生干细胞作为种子细
682　　　吉林农业大学学报　2010年 12月
Journal of J ilin Agricultural University 2010 , December
胞 ,进行体外诱导成骨分化的微粒体培养体系 ,模
拟鹿茸软骨内骨化的生长过程是可行的 。
参考文献:
[ 1] 　Li C , Sut tie J M , Clark D E.Histological examination of antler re-
generation in red deer(Cervus elaphus)[ J] .Anat Rec A Discov
Mol Cell Evol Biol , 2005 , 282:163-174.
[ 2] 　Li C, Harris A J , Suttie J M.Tissue interactions and antlerogene-
si s:new findings revealed by a enograft approach [ J] .J Exp Zool ,
2001, 290:18-30.
[ 3] 　Li C, Sutt ie J M , Clark D E.Clark morphological observation of
antler regeneration in red deer(Cervus elaphus)[ J] .J Morphol ,
2004, 262:731-740.
[ 4] 　Li C.Development of deer antler model for biomedical research
[ J] .Recent Adv &Res Updates , 2003 , 4:255-274.
[ 5] 　Li C, Yang F , Allan S.Adult stem cells and mammalian epimor-
phic regeneration-insights from studying annual renewal of deer
antlers [ J] .Current Stem Cell Research &Therapy , 2009, 4:
237-251.
[ 6] 　Johnstone B, Hering T M , CaplanA I , et al.In vitro chondrogene-
si s of bone marrow derived mesenchymal rogenitor cell [ J] .Exp
Cell Res ,1995 , 238:265-272.
[ 7] 　欧阳钧 ,王前 ,王国黄 ,等.人骨膜成骨细胞培养及初步观察
[ J] .中华骨科杂志 , 1995 , 15(11):123-126.
[ 8] 　Ichiro Sekiya , Jussi T V , Benjamin L , et al.Vitro cartilage forma-
tion by human adult stem cells f rom bone marrow stroma defines the
sequence of cellular and molecular events during chondrogenesis
[ J] .Proc Natl Acad S ci USA , 2002, 99(7):4397-4402.
[ 9] 　Yue X , BaloochG , ChiouM , et al.Analysi s of the material proper-
ties of early chondrogenic differentiated adipose derived stromal cell
using an in vitro three dimensional micromass culture system[ J] .
Biochemical and Biophysical Research Communications , 2007 , 359
(2):311-316.
[ 10] 　Mastrogiacomo M , Cancedda R , Quarto R.Effect of ifferent
growth factors on the chondrogenic potential of human bone marroe
stromal cells[ J] .Osteoarthritis Cartilage , 2001 , 9:36-40.
[ 11] 　Eri Otsuka , Akira Yamaguchi , Shigehisa Hirose , et al.Characteri-
zation of osteoblastic diff erentiation of stromal cell line ST2 that is
induced by ascorbic acid[ J] .Am Jphysiol , 1999, 277(46):132-
138.
[ 12] 　赵丽红 ,岳占碰 ,张学明 ,等.鹿茸的软骨内骨化及其调控
机理的研究进展[ J] .经济动物学报, 2006 , 10(4):238-241.
[ 13] 　孙红梅,刑秀梅 ,丛波 ,等.鹿茸干细胞体外培养的研究[ J]
.经济动物学报 , 2007 , 11(1):7-9.
[ 14] 　郝林琳 ,刘松财 ,夏青娟 ,等.鹿茸多肽的生物学活性研究
[ J].吉林农业大学学报 ,2006 , 28(3):285-288.
(上接第 665页)
3　结　论
典型相关分析可以有效地筛选出农田栽参土
壤中起主要作用的养分含量变量指标和土壤酶活
性变量指标 ,为科学地评价农田栽参土壤肥力提
供可靠的分析方法。
农田栽参土壤中磷酸酶 、蔗糖酶及过氧化氢
酶活性直接影响土壤中有机质 、氮 、磷的转化 ,与
磷 、钾的有效含量密切相关。土壤中锌的含量对
上述几种酶有促进作用。土壤脲酶活性与碱解氮
的含量有关 ,并受到铁和铜的抑制 。
土壤微量元素与土壤酶活性的研究将有助于
探讨农田栽参土壤供肥能力及是否会造成农田栽
参连作障碍 ,结合农田栽参微量元素动态变化 ,对
土壤酶的研究有待于进一步深入。
本试验仅对 4种土壤酶和主要养分指标进行
分析探讨 ,还不能全面覆盖农田栽参土壤所有特
征。因此 ,在土壤酶种类与土壤养分指标的选择
上 ,需视具体情况做出合理选择 ,这也是有待于继
续探讨的一个问题 。另外 ,运用综合土壤酶因子
作为农田栽参肥力的评价指标 ,必须结合生物的
生长特征等因子进行综合分析 ,这样分析结果将
更准确可靠。
参考文献:
[ 1] 　赵英 , 王秀全 , 郑毅男 , 等.施肥对人参产量性状的影响
[ J] .吉林农业大学学报 , 2001 , 4 (23):56-59.
[ 2] 　白容霖 , 张慧丽 , 曲力涛.参地施用有机粪肥对人参锈病
和参根质量的影响[ J] .特产研究 , 2000 , 2:34-36.
[ 3] 　孟立君 , 吴凤芝.土壤酶研究进展[ J] .东北农业大学学报 ,
2004 , 5(35):622-626.
[ 4] 　Robert E H , Alleman B C , Hoeppel R E , et al.Hydrocarbon
Bioremediation[ M] .Boca Raton:Lewis , 1994.
[ 5] 　Doelman P , Haanstra L.Short and long term effect s of heavy met-
als on urease activity in soils[ J] .Biol Ferti l Soils , 1986 , 2:213-
21.
[ 6] 　Haanstra L , Doelman P , Oude Voshaar J H.The use of sigmoidal
dose response curves in soi l ecotoxicological research[ J] .Plant and
Soil , 1985 , 84:293-297.
[ 7] 　 Ra ic S S , Dogo S M , Slavkovic L J.Multivariate characteri zation
of herbal drugs and rhizosphere soil samples according to their
metal li c content[ J] .Microchemical Journal , 2006 , 1-2(84):93-
101.
[ 8] 　林大义.土壤学实验指导[M] .北京:中国林业出版社 ,
2004:42-123.
[ 9] 　朱平 , 孙宏德 , 李军.参地土壤酶的活性[ J] .土壤通报 ,
1991 , 22(2):33-34.
[ 10] 　李跃林, 李志辉 , 彭少麟 , 等.典型相关分析在桉树人工
林地土壤酶活性与营养元素关系研究中的应用[ J] .应用
与环境学报 , 2002, 5(8):544-549.
[ 11] 　TabatabaiM A.Ef fects of trace elements on urease activity in soils
[ J] .Soil Biology and Biochemistry , 1977 , 1(9):9-13.
683孙红梅等:鹿茸再生干细胞成骨诱导(微粒体)培养体系的建立
吉林农业大学学报 Journal of Jilin Agricultural University