全 文 ：［收稿日期］ 20151010(017)
［基金项目］ 河北省中医药管理局科研计划项目(2015137)
［通讯作者］ * 张哲，博士，助理研究员，从事老年病研究，Tel:0311-85988007，E-mail:zhe_zhang80@ 126． com
老鹳草素对小鼠骨髓基质干细胞成骨分化相关基因表达的影响
张哲1* ，徐秀娟2，刘欣1，张彦芬3，唐思文3，王海荣3
(1. 河北省人民医院 省老年医学重点实验室，石家庄 050051;2. 河北医科大学 口腔医院，
石家庄 050017;3. 河北以岭医药研究院有限公司，石家庄 050035)
［摘要］ 目的:观察老鹳草素对小鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的影响，并对成骨分化过程中相关基因表
达进行检测。方法:分离、培养小鼠 BMSCs，加入不同浓度老鹳草素(1 × 10 －9，1 × 10 －8，1 × 10 －7 mol·L －1)培养，另设空白组，
分别于成骨诱导第 7，14 天采用碱性磷酸酶(ALP)，骨钙素(OCN)试剂盒测定 ALP活性及 OCN含量，并进行 ALP染色。于成
骨诱导第 21 天时采用茜素红染色检测成骨分化过程中钙结节形成数量，实时荧光定量聚合酶链式反应(Ｒeal-time PCＲ)和蛋
白质免疫印迹(Western blot)检测 BMSCs成骨分化过程中 OCN，ALP，骨涎蛋白(BSP)，Ｒunt相关转录因子 2(Ｒunx2)mＲNA和
蛋白表达的变化。结果:与空白组比较，成骨诱导后第 7，14 天时，老鹳草素各剂量组 ALP活性，OCN含量及 ALP染色强度均
明显升高(P ＜ 0. 05)，成骨诱导第 21 天时，老鹳草素各剂量组矿化结节数量及 OCN，ALP，BSP，Ｒunx2 mＲNA 和蛋白表达均明
显升高(P ＜ 0. 05)。结论:老鹳草素能够明显促进 BMSCs向成骨方向分化，成骨相关基因 OCN，ALP，BSP，Ｒunx2 均参与这一
过程。
［关键词］ 老鹳草素;骨髓基质干细胞;成骨分化
［中图分类号］ Ｒ285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2016)22-0140-05
［doi］ 10. 13422 / j． cnki． syfjx． 2016220140
［网络出版地址］ http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /11． 3495． Ｒ． 20160919． 1336． 034． html
［网络出版时间］ 2016-09-19 13:36
Effect of Geraniin on Osteogenic Gene Expression of Murine Bone
Marrow Mesenchymal Stem Cells During Osteogenic Induction
ZHANG Zhe1* ，XU Xiu-juan2，LIU Xin1，ZHANG Yan-fen3，TANG Si-wen3，WANG Hai-rong3
(1. Key Laboratory of Geriatrics，Hebei General Hospital，Shijiazhuang 050051，China;
2. Stomatological Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China;
3. Hebei Yiling Medicine Institute Co． Ltd．，Shijiazhuang 050035，China)
［Abstract］ Objective:To study the effects of geraniin on the osteogenic gene expression of murine bone
marrow mesenchymal stem cells (BMSCs)during osteogenic induction． Method:BMSCs were isolated from mice
bones，and cultured with different concentration of geraniin (1 × 10 －9，1 × 10 －8，1 × 10 －7 mol·L －1)． The blank
group was also set up． After 7，14 days of osteogenic induction，the activity of alkaline phosphatase (ALP)，and
osteocalcin (OCN)content were detected，and ALP staining was performed． Alizarin red staining was adopted to
detect calcium deposits on 21 d． Ｒeal-time PCＲ and Western blot were applied to detect the changes in expressions
of osteoblast differentiation marker genes OCN，ALP，bone sialoprotein (BSP) ，Ｒunx2． Ｒesult:At 7，14 d of
osteogenic induction，geraniin groups showed significant increases in ALP activity，OCN content and ALP staining
intensity，compared with control group (P ＜ 0. 05)． At 21 d of osteogenic induction，geraniin groups showed
significant increases in the number of mineralized nodule，and the mＲNA and protein expressions of OCN，ALP，
BSP and Ｒunx2 (P ＜ 0. 05)． Conclusion:Geraniin could induce osteogenic differentiation of BMSCs． Osteoblast
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differentiation marker genes OCN，ALP，BSP and Ｒunx2 participate in this process．
［Key words］ geraniin;bone marrow mesenchymal stem cell;osteogenic differentiation
骨质疏松症是一种以骨量减少、骨微结构破坏、
骨折风险加大为特征的全身骨代谢疾病，好发于老
年人和绝经后妇女［1］。研究证实，骨髓基质干细胞
(bone marrow stromal stem cells，BMSCs)是多功能干
细胞，在不同诱导因素作用下具有向成骨细胞、软骨
细胞、脂肪细胞、神经细胞等中胚层组织细胞分化的
重要潜能［2-3］。由于其易于获取，体外增殖能力强，
已经成为基因治疗、骨组织工程研究的理想种子细
胞，也是干细胞研究领域的热点［4］。大量研究证
实，传统中药能够诱导 BMSCs增殖及向成骨细胞方
向分化，如淫羊藿苷、肉苁蓉、接骨散等［5-7］。老鹳
草素是从滇产叶下株植物全草中分离提取的一种多
酚类化合物。现代药理学研究发现，老鹳草素具有
镇痛、降压、抗肿瘤等多种药理作用，多用于治疗肝
炎、肠炎、痢疾、肾炎水肿等病症。在骨再生研究领
域，有学者研究发现老鹳草素对维甲酸导致的大鼠
骨质疏松症具有明显的保护作用，体外实验证实老
鹳草素对破骨细胞骨吸收的抑制是其发挥抗骨质疏
松作用的机制之一［8-9］。然而，老鹳草素是否具有
调控骨髓基质干细胞骨向分化的作用目前尚缺乏相
关研究。本研究通过体外分离培养小鼠 BMSCs，探
讨老鹳草素诱导 BMSCs成骨分化的可能性，并采用
实时荧光定量聚合酶链式反应(Ｒeal-time PCＲ)和
蛋白质免疫印迹(Western blot)检测参与此过程的
相关基因表达的变化，为老鹳草素在骨质疏松治疗
领域的应用提供实验依据。
1 材料
1. 1 动物 SPF 级 C57BL /6J 雄性小鼠，6 ～ 8 周
龄，体重(20. 15 ± 2. 21)g，购于北京华阜康生物公
司，动物合格证号 SCXK(京)2009-0004。
1. 2 药物及试剂 老鹳草素(纯度 99. 0%，由中国
科学院昆明植物研究所提供)。DMEM/F12 培养
基，Ⅰ型胶原酶，胎牛血清及青 /链霉素(美国 Gibco
公司，批号分别为 1324365，1214233，1376128，
1241525);碱性磷酸酶(ALP)，骨钙素(OCN)试剂
盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为
20140214，20140527);茜素红(美国 Sigma 公司，批
号 130223);兔抗 OCN，ALP，骨涎蛋白(BSP)，Ｒunt
相关转录因子 2(Ｒunx2)，β-肌动蛋白(β-actin)多克
隆抗体(美国 Santa Cruz 公司，批号分别为 sc-6823，
sc-7145，sc-6951，sc-5875，sc-7724);细胞裂解液，辣
根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG 抗体，BCA 蛋白浓
度测定试剂盒及高灵敏度化学发光检测试剂盒(北
京康为世纪生物科技有限公司，批号分别为
20130462，20130835，20130821，20130673);反转录
试剂盒(日本 Takara公司，批号 DＲＲ047S)，Trizol及
Ｒeal-time PCＲ试剂盒(美国 Promega 公司，批号分
别为 AS1050，AS1867)。
1. 3 仪器 960 型酶标仪(美国 Sigma 公司)，
Chemi DocTM XＲS +型化学发光凝胶成像系统(美国
Bio-Ｒad公司)，7300 型 Ｒeal-time PCＲ扩增仪(美国
ABI公司)。
2 方法
2. 1 细胞培养 参照 Hsiao等［10］报道的方法，小鼠
断颈处死，用 70%乙醇浸泡 10 min，无菌条件下取
出股骨、胫骨，剪去两侧骨骺。用 1 mL 注射器抽取
含 20%胎牛血清，1%青 /链霉素，1%谷氨酰胺的
DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，收集骨髓细胞，70
目筛网过滤，以 25 × 106 个 / cm2 密度接种。每 3 d
换液 1 次，待细胞生长至 80% ～ 90%融合，0. 25%
胰酶消化，按 1∶ 3 比例传代培养。选取第 3 ～ 4 代的
细胞用于实验。
2. 2 成骨诱导分化 细胞以 3 × 105 个 /孔密度接
种于 6 孔板，待细胞生长至 80% ～ 90%融合时分别
加入含 1 × 10 －9，1 × 10 －8，1 × 10 －7 mol·L －1老鹳草
素的成骨诱导分化培养基(DMEM-高糖中含有 10%
FBS，1%双抗，100 nmol·L －1地塞米松，10 mmol·L －1
β-磷酸甘油，50 μmol·L －1维生素 C)，另设完全培养
基组作为空白组，每 3 d换液 1 次。
2. 3 ALP 活性测定 给药 7，14 d 后吸弃培养液，
Triton X-100 裂解细胞，12 000 r·min －1离心 15 min
提取蛋白，依次加入 50 μL 碱性磷酸酶底物反应液
和显色剂，酶标仪 405 nm波长处测定吸光度 A405。
2. 4 OCN含量测定 细胞裂解后 3 500 r·min －1离
心 10 min，取上清 100 μL，按照 OCN 放免试剂盒说
明书检测 OCN含量。
2. 5 ALP 染色 给药 7，14 d 后吸弃培养液，乙醇
固定 10 min，PBS 冲洗 3 次，加入 ALP 染色液 100
μL，37 ℃孵育 2 h，依次加入 70 g·L －1硝酸钙和 20
g·L －1硝酸钴，各浸泡 2 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲
洗 3 次，10 g·L －1硫化铵显色后拍照。
2. 6 茜素红染色 各组细胞诱导培养 21 d，多聚甲
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醛固定 30 min，去离子水洗 3 次，室温下 0. 5%茜素
红染色 30 min，去离子水冲洗干净，观察矿化结节形
成情况并计数单位视野内矿化结节数量。
2. 7 Ｒeal-time PCＲ 检测 Trizol 提取细胞总 ＲNA，
按照试剂盒说明书加样进行逆转录反应，Ｒeal-time
PCＲ仪扩增。引物序列见表 1，由上海生工生物工程
技术服务有限公司合成。用仪器自带的分析软件得
到各样本、各基因扩增的循环阈值(Ct)值，以 β-actin
为内参照基因，目的基因表达相对值 ＲQ =2 － ΔΔCt。
表 1 PCＲ引物序列
Table 1 Specific primers for PCＲ
基因名称 引物序列 /5-3
OCN 上游 GCCCTGACTGCATTCTGCCTCT
下游 TCACCACCTTACTGCCCTCCTG
ALP 上游 TATGTCTGGAACCGCACTGAAC
下游 CACTAGCAAGAAGAAGCCTTTGG
BSP 上游 AAACGAAGAAAGCGAAGCAGAA
下游 GCTGCCGTTGCCGTTTT
Ｒunx2 上游 ATCCAGCCACCTTCACTTACACC
下游 GGGACCATTGGGAACTGATAGG
β-actin 上游 GGGTCAGAAGGATTCCTATG
下游 GGTCTCAAACATGATCTGGG
2. 8 Western blot检测 提取细胞总蛋白，半干法电
泳转移至 PVDF 膜，10%脱脂奶粉封闭 2 h。依次加
入特异性一抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG，
化学发光法显色、定影。用 UVP 软件扫描测定蛋白
条带 IA值，β-actin作为内参照，以目的蛋白与β-actin
吸光度值的比值表示目的蛋白相对表达水平。
2. 9 统计学方法 采用 SPSS 13. 0 软件包处理数
据，计量资料采用 珋x ± s 表示，组间比较采用 Dunnett
检验，以 P ＜ 0. 05 为差异有统计学意义。
3 结果
3. 1 BMSCs 的培养和鉴定 BSMCs 接种于培养瓶
后散在分布，呈较小的圆形。24 h 后细胞贴壁良
好。72 h后首次换液去除未贴壁的细胞，3 ～ 4 d 后
细胞呈梭形、星形或三角形，6 ～ 7 d 后细胞快速增
殖呈“漩涡状”。7 ～ 9 d后集落数目继续增加，呈均
一的梭形。细胞传代后生长均匀，胞体明显增加，呈
梭形或纤维样形态。流式细胞仪分析 BMSCs 表面
抗原表达，与同型对照相比第 3 ～ 4 代小鼠 BMSCs
高表达 CD44，阳性率为 26. 2%，低表达 CD45，阳性
率为 2. 56%，提示实验所培养的细胞具有 BMSCs干
细胞特征。
3. 2 对 BMSCs ALP 活性和 OCN 含量的影响 小
鼠 BMSCs 经成骨诱导 7 d 后，老鹳草素各剂量组
ALP 活性和 OCN 含量均较空白组明显增加(P ＜
0. 05)，诱导 14 d时，老鹳草素各剂量组 ALP活性和
OCN含量均较 7 d 时明显升高(P ＜ 0. 05)，呈显著
剂量依赖性。见表 2。
表 2 老鹳草素对 BMSCs ALP活性和 OCN含量的影响(珋x ± s，n = 6)
Table 2 Effect of geraniin on ALP activity and OCN content of BMSCs(珋x ± s，n = 6)
组别 剂量 /mol·L －1
ALP /U·L －1
7 d 14 d
OCN /g·L －1
7 d 14 d
空白 － 1. 17 ± 0. 16 1. 19 ± 0. 19 4. 68 ± 0. 62 4. 70 ± 0. 68
老鹳草素 1 × 10 －9 1. 40 ± 0. 221) 1. 59 ± 0. 261) 6. 05 ± 0. 791) 7. 11 ± 0. 101)
1 × 10 －8 1. 61 ± 0. 271，2) 1. 80 ± 0. 301，2) 7. 82 ± 0. 981，2) 9. 05 ± 1. 421，2)
1 × 10 －7 1. 94 ± 0. 281，3) 2. 18 ± 0. 341，3) 10. 01 ± 1. 651，3) 12. 66 ± 1. 971，3)
注:与空白组比较1)P ＜ 0. 05;与老鹳草素 1 × 10 －9 mol·L －1组比较2)P ＜ 0. 05;与老鹳草素 1 × 10 －8 mol·L －1组比较3)P ＜ 0. 05(表 3 ～ 5
同)。
3. 3 对 BMSCs成骨相诱导及 ALP染色的影响 老
鹳草素各剂量组 ALP 染色较空白组明显加深(P ＜
0. 05);诱导 14 d 时，老鹳草素各剂量组染色均较 7
d时明显加深(P ＜ 0. 05)，呈显著剂量依赖性。
3. 4 对 BMSCs矿化结节形成的影响 成骨诱导培
养 21 d时，老鹳草素各剂量组矿化结节数量较空白
组明显增加(P ＜ 0. 05)，呈显著剂量依赖性。见
表 3。
表 3 老鹳草素对 BMSCs矿化结节形成的影响(珋x ± s，n = 6)
Table 3 Effect of geraniin on mineralized nodules of BMSCs(珋x ± s，
n = 6)
组别 剂量 /mol·L －1 矿化结节数量 /个
空白 － 6. 47 ± 0. 81
老鹳草素 1 × 10 －9 12. 68 ± 1. 761)
1 × 10 －8 20. 22 ± 3. 541，2)
1 × 10 －7 33. 24 ± 4. 621，3)
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3. 5 对 BMSCs成骨分化相关基因表达的影响 老
鹳草素各剂量组 OCN，ALP，BSP，Ｒunx2 mＲNA和蛋
白表达均较空白组明显增加(P ＜ 0. 05)，呈显著剂
量依赖性。见表 4，5，图 1。
表 4 老鹳草素对 BMSCs成骨分化中 OCN，ALP，BSP，Ｒunx2 mＲNA表达的影响(珋x ± s，n = 6)
Table 4 Effect of geraniin on OCN，ALP，BSP，Ｒunx2 mＲNA expression of BMSCs(珋x ± s，n = 6)
组别 剂量 /mol·L －1 OCN /β-actin ALP /β-actin BSP /β-actin Ｒunx2 /β-actin
空白 － 0. 58 ± 0. 08 0. 77 ± 0. 12 0. 64 ± 0. 09 0. 60 ± 0. 07
老鹳草素 1 × 10 －9 0. 72 ± 0. 111) 0. 95 ± 0. 151) 0. 91 ± 0. 151) 0. 87 ± 0. 121)
1 × 10 －8 0. 98 ± 0. 141，2) 1. 21 ± 0. 201，2) 1. 25 ± 0. 201，2) 1. 17 ± 0. 141，2)
1 × 10 －7 1. 20 ± 0. 181，3) 1. 46 ± 0. 241，3) 1. 42 ± 0. 211，3) 1. 37 ± 0. 191，3)
表 5 老鹳草素对 BMSCs成骨分化中 OCN，ALP，BSP，Ｒunx2 蛋白表达的影响(珋x ± s，n = 6)
Table 5 Effect of geraniin on OCN，ALP，BSP，Ｒunx2 protein expression of BMSCs(珋x ± s，n = 6)
组别 剂量 /mol·L －1 OCN /β-actin ALP /β-actin BSP /β-actin Ｒunx2 /β-actin
空白 － 0. 48 ± 0. 07 0. 66 ± 0. 11 0. 57 ± 0. 08 0. 51 ± 0. 08
老鹳草素 1 × 10 －9 0. 62 ± 0. 091) 0. 80 ± 0. 131) 0. 78 ± 0. 131) 0. 69 ± 0. 111)
1 × 10 －8 0. 84 ± 0. 121，2) 1. 06 ± 0. 151，2) 1. 12 ± 0. 181，2) 0. 93 ± 0. 151，2)
1 × 10 －7 1. 13 ± 0. 151，3) 1. 39 ± 0. 211，3) 1. 32 ± 0. 201，3) 1. 26 ± 0. 211，3)
1. 空白组;2. 老鹳草素 1 × 10 －9 mol·L －1组;3. 老鹳草素 1 × 10 －8
mol·L －1组;4. 老鹳草素 1 × 10 －7 mol·L －1组
图 1 Western blot 检测老鹳草素对 BMSCs 成骨分化中 OCN，
ALP，BSP，Ｒunx2 蛋白表达的影响
Fig． 1 Effect of geraniin on OCN，ALP，BSP，Ｒunx2 protein
expression of BMSCs with Western blot
4 讨论
向成骨细胞分化是 BMSCs 的重要潜能，也是
BMSCs用于骨再生的基础。如何能有效的刺激
BMSCs向成骨细胞分化和(或)抑制其向其他方向
分化，在骨组织工程学和骨质疏松治疗学方面具有
重要价值。研究发现，BMSCs 在成骨细胞分化诱导
剂作用下能够向成骨细胞方向分化，并且表达多种
特异性表型基因，如 OCN，ALP，BSP，Ｒunx2 等，同时
特异性成骨细胞产物分泌增多，如 ALP 活性，OCN
含量及矿化结节形成增加等［11-12］。其中，ALP 是细
胞膜上的一种钙结合转运蛋白，可作为成骨细胞分
化的早期标志物，其活性高低可以反应成骨细胞的
成熟状态［13］。OCN 是骨基质中含量最多的非胶原
蛋白，也是成骨细胞分化的晚期标志物，其含量高低
可作为判断药物干预下 BMSCs 成骨分化能力的参
考指标［14-15］。细胞外基质的矿化是成骨细胞特异
性生物学行为，茜素红染色则能够直接观察矿化结
节形成数量。本实验采用 ALP，OCN 及矿化结节形
成作为判断 BMSCs 向成骨细胞分化的指标。结果
显示，老鹳草素各剂量组 BMSCs 经成骨诱导培养 7
d后，小鼠 BMSCs 培养液中 ALP 活性和 OCN 含量
明显增加，ALP染色明显加深，并随着培养时间延长
逐渐增加，且 1 × 10 －7 mol·L －1老鹳草素作用最强;
在成骨诱导培养 21 d 时，矿化结节数量明显增加，
且 1 × 10 －7 mol·L －1老鹳草素作用最强。以上结果
表明，老鹳草素能够明显促进 BMSCs 向成骨细胞方
向分化。
为了进一步验证以上结果，笔者分别从 mＲNA
和蛋白表达水平对不同剂量老鹳草素干预后小鼠
BMSCs中成骨相关基因表达进行了检测。Ｒunx2，
又称核心结合因子，是成骨细胞分化的早期标志物，
具有增加不成熟成骨细胞数量并促进前体细胞向成
骨细胞分化的作用，被作为成骨细胞特异性转录因
子和成骨细胞分化的关键因子，其表达水平降低必
然导致成骨细胞分化能力减弱［16］。BSP 是骨基质
中主要的非胶原蛋白之一，主要表达于成熟成骨细
胞，是成骨分化的晚期标志物。本研究结果显示，老
鹳草素各剂量组 BMSCs经成骨诱导培养 21 d 时能
够明显上调成骨分化早期基因 ALP，Ｒunx2 和晚期
基因 OCN，BSP mＲNA和蛋白表达，从基因水平反映
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出 BMSCs成骨分化能力增强。茜素红染色结果亦
表明，老鹳草素各剂量组均有不同程度的矿化结节
形成，进一步证实老鹳草素能够促进 BMSCs 向成骨
细胞方向分化，形成矿化结节，且老鹳草素促进小鼠
BMSCs成骨分化的作用机制可能与从转录和翻译
后多水平调控 ALP，Ｒunx2，OCN，BSP 基因表达有
关。因此调控 ALP，Ｒunx2，OCN，BSP基因表达是老
鹳草素诱导 BMSCs 向成骨细胞分化的重要分子
靶点。
综上所述，本研究结果表明老鹳草素能够在细
胞水平和基因水平诱导 BMSCs向成骨方向分化，老
鹳草素可调控 BMSCs 的定向分化平衡而对抗骨质
疏松症的发生发展，这对于将老鹳草素应用于骨再
生研究具有重要指导意义。但老鹳草素诱导
BMSCs定向成骨分化的具体信号转导通路尚不清
楚，有待进一步研究。
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［责任编辑 周冰冰］
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第 22 卷第 22 期
2016 年 11 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 22，No． 22
Nov．，2016