全 文 ：上海中医药大学学报　第 24卷　第 5期　2010年 9月
三七花总皂苷抑制人乳腺癌细胞
侵袭的体外研究
廖文琴 1　　可　燕 1, 2　　蒋嘉烨 1　　王现珍 1　　卞　卡 2, 3
1.上海中医药大学教学实验中心　(上海　201203)
2.上海高校一氧化氮与炎症医学研究院　(上海　201203)
3.美国德克萨斯大学休斯顿医学院综合生物及药理学系 ,德克萨斯大学分子医学研究所　(休斯顿　TX　77030)
【摘　要】　目的:研究三七花总皂苷对人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231侵袭能力的影响并探讨其相关机制。
方法:MTT实验检测三七花总皂苷对肿瘤细胞增殖的抑制作用;Transwell小室法进行肿瘤细胞侵袭实验;
RT-PCR检测 β 1-integrin、MMP-2、EGFRmRNA表达的变化;Westernbloting检测 β 1-integrin、EGFR蛋白表
达的变化。结果:在浓度为 50 ～ 200 μg/ml时 , 三七花总皂苷对人乳腺癌细胞的增殖具一定的抑制作用。
Transwel小室实验显示 , 三七花总皂苷在浓度为 10、50、 100 μg/ml均表现出侵袭抑制作用 , 浓度为 50 μg/
ml侵袭抑制效果最佳 ,达到 32.0%。三七花总皂苷对各浓度组对 MDA-MB-231细胞 β1-integrin、MMP-2和
EGFR基因表达有下调作用(P<0.01), 一些浓度组对 β 1-integrin和 EGFR蛋白的表达也具下调作用。
结论:三七花总皂苷通过下调 β 1-integrin、EGFRmRNA和蛋白的表达 ,抑制肿瘤细胞与 ECM粘附 ,降低肿
瘤细胞运动能力 ,从而抑制人乳腺癌细胞的侵袭转移。
【关键词】　三七;总皂苷;乳腺癌;侵袭;转移
【中图分类号】　R285.5　　【文献标志码】A　　【文章编号】1008-861X(2010)05-0077-05
[基金项目 ] 　上海市教委科研基金资助项目(05JG05053)
[作者简介 ] 　廖文琴 ,女 , 在读硕士生 , 主要从事中药活性成
分筛选研究。
[通讯作者 ] 　可燕 , 副研究员 ,硕士生导师。
E-mail:keyan111@yahoo.com.cn
　　三七为五加科 (Araliaceae)人参属三七 Panax
notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥块根 ,其味
甘 、微苦 ,性温 ,具有化瘀止血 、活血定痛等功效 。三
七中皂苷成分是其主要有效成分 ,迄今为止 ,已从三
七的不同部位分离得到 70余种单体皂苷成分 [ 1] 。
三七不同药用部位所含皂苷种类及含量有较大差
异 [ 2] ,三七花及果实中主要含 20(S)原人参二醇型
皂苷 ,而三七根中还含有 20(S)原人参三醇型皂苷 ,
因此其药理作用也有所不同[ 3-4] 。
有关三七抗肿瘤活性已有报道 [ 5-8 ] ,主要集中
在三七根粗提物和某些单体成分方面 ,表现在抑制
肿瘤细胞增殖 、促使细胞停止生长 、诱导细胞凋亡
上 。三七花与根中所含皂苷成分不同 ,其是否也具
有抗肿瘤作用 ,抗肿瘤机制等尚缺乏深入的研究 。
本文研究三七花总皂苷干预肿瘤侵袭的过程 ,并对
其抗侵袭的相关机制进行了初步探讨 。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　细胞系　人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231,购
自中国科学院上海细胞所。
1.1.2　实验药物　三七花蕾购于云南文山三七科
技创新中心 ,并经上海中医药大学生药教研室周秀
佳教授鉴定为三七 Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.
ChenexC.Chow。三七花蕾总皂苷为本实验室提
取 ,其总皂苷的含量以紫外分光光度法检测为
86.94 %,高效液相法检测其中人参皂苷 Rb3的含
量为 16.88 %。
1.1.3　主要试剂　RPMI-1640培养基购于吉诺生
物医药技术有限公司;新生牛血清 、胰蛋白酶 、Matri-
gel均购于 Gibco公司;TRIzolRNA提取试剂 、抗体
GAPDH均购于 Invitrogen公司;RT-PCR试剂盒 、
DNAmarker均购于博大泰克公司;PCRMasterMix
购于天根生化公司;琼脂糖 、引物 、MTT均购于上海
生工;RIPA裂解液 、PMSF均购于碧云天公司;BCA
蛋白质定量试剂盒购于普利莱公司;蛋白梯度标准
品购于 Fermentas公司;硝酸纤维素膜购于 Bio-Rad
·77·DOI :10.16306/j.1008-861x.2010.05.027
ACTAUNIVERSITATISTRADITIONISMEDICALISSINENSISPHARMACOLOGIAEQUESHANGHAIVol.24No.5 Sep., 2010
公司;抗体 β1 -integrin、EGFR均购于 Epitomics公
司;ECL试剂盒购于 GEhealthcare公司;24-Wel
Milicel购于 Milipore公司;多功能成像系统 Tanon
2500购于上海天能科技有限公司。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养　人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231使
用含 10%胎牛血清的 RPMI-1640培养液常规培养 。
1.2.2　对肿瘤细胞的生长抑制作用　取 1×105 /ml
MDA-MB-231细胞悬液接种于 96孔板 , 100 μl/孔 ,
培养 24 h后细胞贴壁 ,分别加入不同浓度的三七花
皂苷(400、200、 100、 50、 25、 12.5、6.25 μg/ml)各
100μl,另设不加药物的阴性对照和无细胞的空白
对照 , 48 h后弃上清 , 加入 5 g/L的 MTT溶液 ,
10 μl/孔 ,继续培养 4 h后 ,每孔加入 150 μlDM-
SO,震荡 10 min,用酶标仪测定 570nm处的吸光度
(A)值 ,计算细胞生长抑制率 。
增殖抑制率(IR)=(1-实验组 A值 /空白组 A
值)×100%
1.2.3　Transwel法体外侵袭实验　将 Transwel侵
袭小室置于 24孔板内 ,将人工基底膜 Matrigel按 40
μ1 /孔均匀地铺在 Transwel侵袭小室底部膜上 ,于
37 ℃, 5% CO2孵箱内成胶 30min。取对数生长期
细胞 ,调整浓度为 1×106 /ml的细胞悬液 ,取 100 μl
接种到成胶的 Transwel小室内 ,同时加入 100 μl无
血清培养基配置的药物 ,使药物终浓度分别为 0、
10、50、100μg/ml,每一浓度设 3个平行孔。同时在
24孔板内下室内加入 500μl含有 20 %小牛血清的
RPMI1640,培养 48 h。取出小室用棉头擦掉 Matri-
gel, PBS洗 3次 ,中性福尔马林固定 10min。蒸馏水
洗 2 min,重复洗一次。常规 HE染色 ,染色后直接
在显微镜下观察 ,计数侵入滤膜的细胞数 ,共计数中
央和四周各 5个视野(×400),取平均值。
侵袭力抑制率(InvasionIR)=1-(用药后侵入滤膜
细胞数均值 /用药前侵入滤膜细胞数均值)×100 %。
1.2.4　总 RNA的提取和 RT-PCR扩增　生长至融合
状态的 MDA-MB-231细胞加入 10、50、100、200μg/ml
的三七花总皂苷培养 12h。以 PBS冲洗细胞 ,每皿
加入 1 mlTRIzol溶液 , 收集细胞裂解物至离心管
中 ,静置 5 min。加入 0.2 ml氯仿 ,充分震荡 15 s,
10 000 r/min离心 15 min。取上清液 ,加入等体积
异丙醇充分混合 ,室温孵育 10min。以 12 000r/min
离心 15 min,去上清 。沉淀分别用 75%、100%乙醇
清洗后 ,将其溶解于 20 μlDEPC处理水中 ,用紫外
微量分光光度计 OD260定量。
取 1.5 μg总 RNA反转录为 cNDA。 PCR扩增
反应体系 20 μl,其中 cDNA1 μl,目的基因上 、下游
引物各 2 μl(5 μmol/L), dNTP200 μmol/L, Taq酶
0.8 U。 β1 -integrin引物为 5 -AATGAAGGGCGTGT-
TGGTAG-3 (上 游 )和 5 -CTGCCAGTGTAGTT-
GGGGTT-3 (下游 )、EGFR引物为 5 -CTTCTTG-
CAGCGATACAGCTC-3 (上 游 )和 5 -ATGCTC-
CAATAAATTCACTGC-3 (下游)、MMP-2引物为 5 -
CCAACTGCAAAAAAAGCCTCC-3 (上游 )和 5 -
GTTTCTCGCTCCCATTTCT-3 (下游)。 PCR扩增结
果经 1.2%琼脂糖凝胶电泳后 ,紫外光下自动凝胶成
像分析系统定量分析特异性扩增条带的荧光强度值。
同时扩增 β-actin,以 β -actin扩增产物校正作光密度
相对分析。实验重复 4次。
1.2.5　Westernblot法检测蛋白表达　待肿瘤细胞
生长至融合状态 ,以上述不同浓度三七花总皂苷 12
h后 ,用细胞裂解液提取细胞的总蛋白。蛋白以
10%的 SDS-PAGE电泳 ,再将蛋白转到硝酸纤维素
膜上 。常规封闭洗膜后 ,加一抗 4℃孵育过夜后洗
膜 ,分别加入抗兔二抗室温孵育 1 h。 ECL显色 , X
光胶片曝光 ,洗片 。用凝胶成像分析系统检测蛋白
表达灰度值。
1.3　统计学方法　采用 SPSS16.0软件分析数据 ,
结果用 x±s表示 ,应用 One-wayANOVA方法进行
两组及多组样本均数的比较分析 ,以 P<0.05为差
异有统计学意义。
2　结果
2.1　对 MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用　在浓
度为 50 ～ 200 μg/ml时 ,三七花总皂苷对肿瘤细胞
具有一定的生长抑制作用 ,但作用效果不强 ,其最高
抑制率仅达 22.84%。见图 1。
注:与空白组比较 , ＊＊P< 0.01。
图 1　各组对 MDA-MB-231细胞增殖的抑制作用
·78·
上海中医药大学学报　第 24卷　第 5期　2010年 9月
2.2　对 MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响　体外
侵袭力以侵入滤膜的细胞数来判定 ,各浓度用药组
与空白组细胞的侵袭力比较均有下降(P<0.01);
三七花总皂苷 10 μg/ml、50 μg/ml、100 μg/ml组使
肿瘤细胞侵袭能力分别降低了 23.6%、 32.0%、
17.1%。见表 1,图 2。
2.3　对肿瘤细胞 β 1-integrin、EGFR、MMP-2 mRNA
表达的影响 　三七花总皂苷 10 μg/ml、 50 μg/ml、
100 μg/ml组与空白组相比均可下调 β 1-integrin、
EGFR和 MMP-2mRNA的表达 ,其中 50μg/ml组作
用较其他两组明显。而 200 μg/ml组对 β 1 -integrin、
EGFR、MMP-2 mRNA的表达均无降低作用。见表
2,图 3。
表 1　各组对 MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响
(x±s)
组　别 n 侵袭细胞数 /视野 侵袭能力降低(%)
空白组 6 112.7±4.0 -
10μg/ml 6 86.1±2.9＊＊ 23.6
50μg/ml 6 76.6±3.1＊＊ 32.0
100μg/ml 6 93.4±3.4＊＊ 17.1
　注:与空白组比较 , ＊＊P< 0.01。
A:空白组;B:10μg/ml;C:50μg/ml;D:100μg/ml
图 2　各组对 MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响
表 2 　各组肿瘤细胞 mRNA表达的比较 (x±s)
组　别 n β 1 -intergrin EGFR MMP-2
空白组 6 0.96±0.02 0.81±0.08 0.99±0.01
10μg/ml 6 0.73±0.05＊＊ 0.49±0.05＊＊ 0.98±0.01
50μg/ml 6 0.40±0.09＊＊ 0.45±0.04＊＊ 0.75±0.00＊＊
100μg/ml 6 0.57±0.03＊＊ 0.34±0.03＊＊ 0.94±0.01＊＊
200μg/ml 6 0.97±0.01　 0.88±0.04 1.00±0.01
　注:与空白组比较 , ＊＊P< 0.01。
图 3　RT-PCR法检测三七花总皂苷
对肿瘤细胞 mRNA表达的影响
2.4　对肿瘤细胞 β 1-integrin、EGFR蛋白表达的影响　由
结果可见 ,三七花总皂苷 100μg/ml组与空白组相比 , β 1-
integrin蛋白表达下调了 15.13%, 10μg/ml组使 EGFR
蛋白下调了 34.96 %(P<0.05)。见表 3,图 4。
表 3　各组对肿瘤细胞蛋白表达的影响 (x±s)
组　别 n β 1-intergrin EGFR
空白组 6 0.86±0.03 0.93±0.02
10μg/ml 6 0.79±0.05 0.61±0.01＊
50μg/ml 6 0.74±0.03 0.77±0.02
100μg/ml 6 0.71±0.09＊ 0.81±0.01
200μg/ml 6 0.82±0.05 0.87±0.03
　注:与空白组比较 , ＊P< 0.05。
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图 4各组对肿瘤细胞蛋白表达的影响
3　讨论
肿瘤的侵袭和转移是肿瘤发生和演变过程中最
危险的阶段 ,而如何预防癌细胞的侵袭和转移是控
制肿瘤患者术后复发和降低患者病死率的关键。肿
瘤转移是一个复杂多步骤的癌细胞与宿主细胞相互
作用的过程 ,其中包括肿瘤细胞脱离原发部位 、血管
或淋巴管侵入 、免疫逃逸 、细胞黏附 、细胞侵袭 、细胞
增殖和血管新生等多个环节[ 9] 。进入循环系统的肿
瘤细胞首先与内皮细胞发生较弱而短暂的粘附;然
后 ,在整合素家族(Integrin)成员调控和相关粘附因
子的刺激和激活下 , 肿瘤细胞最终与细胞外基质
(ECM)发生稳定而牢固的粘附 [ 10] 。 Shain等 [ 11] 研
究表明 ,在微环境中 , β 1-integrin的粘附能够增强白
细胞间素-6(IL-6)介导的转录激活子 -3(STAT3)的
信号转导 ,与 gp130共同作用 ,促进骨髓瘤细胞的生
长和增殖。我们前期的研究的发现 [ 12] ,三七根和花
总皂苷可以抑制肿瘤细胞与内皮细胞黏附 ,减轻血
管内皮细胞炎症及氧化应激状态 ,三七花总皂苷还
具有抗肿瘤细胞诱导的血小板聚集能力 ,显示三七
在肿瘤细胞转移过程的一些环节起到抑制作用。本
实验在此基础上考察了三七花总皂苷抗肿瘤侵袭作
用 , Transwel小室侵袭实验显示其在体外可显著抑
制乳腺癌细胞的侵袭力 ,在浓度为 50 μg/ml时 ,抑
制率最高。同时 ,我们研究发现 ,三七花总皂苷能够
抑制肿瘤细胞 β 1 -integrin的 mRNA和蛋白的表达 ,
通过下调 β 1 -integrin的表达 ,抑制肿瘤细胞与 ECM
发生粘附。
基质降解是肿瘤侵袭的另一个重要步骤。基质
金属蛋白酶(MMP)通过参与降解 ECM和基质 ,肿
瘤浸润在肿瘤侵袭中起重要作用 [ 13-14] 。 HegedǜsL
等 [ 15]发现 MDA-MB-231乳腺癌细胞中存在多种
MMPs基因表达 ,可促进 MDA-MB-231细胞的侵袭。
本实验显示三七花皂苷可下调肿瘤细胞 MMP-2的
基因表达从而抑制 ECM和基质的降解。
肿瘤细胞的积极活动是肿瘤细胞进入或移出血
管的前提 ,具有高度侵袭能力的肿瘤细胞往往同时
具有活跃的细胞运动能力 。在肿瘤细胞的运动过程
中移动因子起着重要作用 。表皮生长因子(EGF)和
转化生长因子(TGF)是促进肿瘤细胞运动的移动因
子之一 。在乳腺癌细胞中存在着 EGF的自分泌环 ,
分泌 EGF并表达其相应的受体 -EGFR,当 EGFR与
配体结合后 ,促进受体酪氨酸激活 ,使自身磷酸化 ,
提供持续分裂信号到细胞内膜 ,引起细胞过度增殖;
活化的 EGFR可与 TGF-beta1协调作用 ,影响蛋白酶
及蛋白酶抑制剂之间的平衡 [ 16] 。三七花总皂苷能
够通过抑制肿瘤细胞 EGFRmRNA的表达和蛋白表
达 ,降低肿瘤细胞的运动能力 ,从而抑制肿瘤细胞的
侵袭。
三七花中主要含 20(S)原人参二醇型皂苷 ,如
人参皂苷 Rb3 等 , 其总皂苷含量较高 , 较容易富
集 [ 17] 。本实验首次显示三七花总皂苷可通过抑制
肿瘤细胞与 ECM黏附 ,抑制 ECM降解 ,降低肿瘤细
胞运动能力从而抑制人乳腺癌细胞株 MDA-MB-231
的侵袭力。值得注意的是 ,三七花皂苷的细胞毒性
很低 ,其抗侵袭作用并不呈现剂量依赖性 ,综合来看
50 μg/ml剂量作用效果较佳 ,但高剂量则出现作用
下降甚至相反作用 ,是否是由于不同单体皂苷成分
具有不同作用 ,多种成分叠加造成其总体效果的差
异 ,值得进一步研究。
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编辑:季春来
收稿日期:2010-04-26
InhibitoryEffectsofPanaxNotoginsengFlowerSaponinsonInvasion
ofHumanBreastCancerCelinVitro
LIAOWen-qin1　KEYan1, 2　JIANGJia-ye1　WANGXian-zhen1　BIANKa2, 3
1.ExperimentCenterforTeachingandLearning,
ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine
2.E-InstituteofShanghaiUniversities, DivisionofNitricOxideandInflammatoryMedicine
3.DeptofIntegrativeBiologyandPharmacology, InstituteofMolecular
Medicine, UniversityofTexasMedicalSchool
ABSTRACT　Objective:　TostudytheeffectsofPanaxnotoginsengflowersaponinsoninvasionofhumanbreastcancercelline
MDA-MB-231andexplorethepossiblemechanisms.Methods:　TheinhibitoryefectsofPanaxnotoginsengflowersaponinson
cancercelproliferationweredetectedbyMTT;theabilityofinvasionofcancercelwasevaluatedbytranswelassay;theexpres-
sionsofβ 1-integrin, MMP-2andEGFRmRNAandtheexpresionsofβ 1-integrin、EGFRproteinweretestedbyRT-PCRandwest-
ernblotingrespectively.Results:　Panaxnotoginsengflowersaponinsinhibittheproliferationofhumanbreastcancercelatthe
concentrationof50to200μg/ml.TranswelassayshowedthatPanaxnotoginsengflowersaponinsmanifestedinhibitoryefectson
theproliferationofhumanbreastcancercelattheconcentrationsof10, 50, 100μg/mlandtheinhibitoryeffectswerethebestat
theconcentrationof50μg/mlreachingto32.0%.Thegeneexpressionsofβ 1-integrin, MMP-2andEGFRinMDA-MB-231cel
weredecreasedtreatedbyPanaxnotoginsengflowersaponinsatalkindsofconcentrationsandtheproteinexpressionsofβ 1-integrin
andEGFRwerealsodecreasedatsomeconcentrations.Conclusion:　Panaxnotoginsengflowersaponinspreventtheadheringof
tumorcellandECM, decreasethemobilityoftumorcelandinhibittheinvasionandmetastasisofhumanbreastcancercelthrough
depressingmRNAandproteinexpressionsofβ 1-integrinandEGFR.
KEYWORDS　Panaxnotoginseng;saponins;breastcancer;invasion;metastasis
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