全 文 ：　 第 19卷　第 1期　2009年 1月
复苏植物牛耳草 BhLEA2 基因启动子的分离和
基因表达模式研究＊
刘　霞　邓　馨＊＊
中国科学院植物研究所发育中心 , 中国科学院光合作用与环境分子生理学重点实验室 , 北京 100093
　2008-06-26 收稿 , 2008-07-25 收修改稿
　 ＊国家自然科学基金(批准号:30400027)及中国科学院院长基金特别支持项目资助
　＊＊通信作者 , E-mail:deng@ibcas.ac.cn
摘要　　为研究干旱诱导的基因表达模式 , 利用 Inverse-PCR和 Tail-PCR的方法从复苏植物牛耳草
(Boea hygrometrica (Bunge)R Br.)中扩增出胚胎发育晚期丰富蛋白编码基因 BhLEA2 的1215 bp启动
子序列 , 命名为 PBhLEA2 .构建了由 PBhLEA2启动子引导 GUS嵌合基因的植物表达载体 pBhLEA2-GUS ,
并经农杆菌介导导入到烟草中 , 得到 4 株转基因烟草植株.GUS检测分析表明 , 该启动子可驱动
GUS报告基因在转基因烟草的种子和刚萌发的小苗的子叶和胚轴中高效表达 , 在 10—20 d苗龄的植
株中不表达 , 表现出一定的发育阶段和组织特异性.干旱 、 高盐胁迫及脱落酸(ABA)、 乙烯和
H2O2 等信号分子可在不同程度上诱导 GUS 报告基因在 20 d苗龄的转基因植株的叶片中表达 , 但
只有 ABA可诱导其在根中表达 , 表明该启动子对 BhLEA2 基因表达的调控受环境信号影响.
关键词　　复苏植物　LEA基因　启动子　干旱　GUS染色
　　干旱是限制作物产量的一个主要环境胁迫 , 在全
球范围内经常发生.提高农作物和重要经济作物的抗
旱性是实现农业可持续发展的重要方面.因此寻找高
效的抗旱植物基因资源受到广泛关注[ 1] .复苏植物如
我国境内生活的苦苣苔科旋蒴苣苔属植物牛耳草(Boea
hygrometrica (Bunge)R Br.)可以忍耐失去95%水分的
极端干旱 , 是一类有价值的资源植物[ 2 , 3] .这类植物
通常生活在干旱频繁发生的特殊生境中 , 在干旱时会
快速失水 , 以一种类似休眠的状态度过干旱期 , 在水
分适宜时迅速吸水并恢复生活状态.复苏植物耐旱机
制尚未阐明.研究表明 , 复苏植物细胞内存在着较高
水平的抗氧化酶 、渗透调节物质 、保护性大分子如胚
胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant
protein , 简称 LEA 蛋白), 并在干旱时通过积累大量
的蔗糖或其他寡糖形成 “玻璃化” 状态来降低代谢速
率 , 可能是其耐旱的主要原因[ 2 , 4 , 5] .
胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA 蛋白)是一组高度
亲水的小分子量蛋白质 , 在植物和动物中广泛分布 ,
大多与细胞脱水过程密切相关[ 6] .很多 LEA 蛋白在
种子干燥过程和成熟的胚中积累 , 在种子萌发后迅速
消失[ 7] .干旱 、盐害 、 冷害等环境胁迫和植物激素脱
落酸(ABA)可诱导一些 LEA 蛋白在植物营养器官中
积累 , 推测通过保护生物膜和蛋白质等大分子物质的
稳定性而提高细胞对渗透胁迫的耐性[ 8—11] .转基因
植物分析表明 , LEA基因能够提高转基因植物的耐
渗透胁迫能力[ 12 , 13] .耐旱的复苏植物和耐盐的小盐
芥研究结果表明 , 抗逆植物中的很多基因与逆境敏感
植物中许多基因的序列和功能都相似(如 LEA基因),
但在转录水平上存在差异 , 表明基因的转录调控在植
物抗逆机制中有重要意义[ 14 , 15] .启动子是精确调控
基因在植物体内表达的 “开关” .转录因子必须与启
动子上所含有的顺式作用元件特异性的结合才可调控
基因表达的强度或特异性.因此研究耐旱植物干旱基
因的启动子对揭示其特有的耐旱机制是十分重要的.
39
我们从牛耳草中克隆得到一个干旱诱导表达的
LEA 蛋白编码基因BhLEA2 [ 16] .这个基因在烟草中过
量表达可显著提高转基因烟草的耐旱性[ 16] .为探索耐
旱复苏植物中的 LEA基因表达调控的分子机制 , 本文
扩增了 BhLEA2 的启动子 , 构建了该启动子引导的
GUS 嵌合基因的植物表达载体 , 并转化烟草.通过对
不同发育阶段的转基因烟草和胁迫处理的转基因烟草
进行 GUS 染色 , 研究 BhLEA2 基因的时空表达特点.
1　材料和方法
1.1　材料
牛耳草成熟植株采自北京植物园 , 温室中盆栽
土培 , 16 h/8 h 光周期 , 每 3天浇一次水.
烟草(Nicotiana tabacum)品种 SR1 来自德国科
隆马普植物育种所 , 作为遗传转化的受体植株 , 用
于构建转基因植株.
1.2　菌种和质粒
大肠杆菌(Escherichia col i)DH5α、 农杆菌
(Agrobacterium tume f aciens)LBA4404 和质粒载
体 pUC18 由本实验室保存.pGEM-Teasy 载体购
于北京全式金公司.pBISN 1 载体由中国科学院植
物研究所华学军惠赠.
1.3　主要的酶及试剂
限制性内切酶 、 T 4DNA 连接酶和 rTaq 酶购自
宝生物公司(Takara).DNA 凝胶回收试剂盒购自
道普生物公司 , 其余生化试剂(除特别标明外)购自
北京北化精细化学品有限责任公司.DNA 分子量
标记(Marker III)购于全式金公司.
1.4　方法
1.4.1　PCR引物设计　根据已知的 BhLEA2 基因
的基 因 组 DNA 序 列 (GenBank Accession No.
EU669184)设计引物 , 序列如下:BhLEA2-inv-f:
5 -CGAATTCAGCCACTCAGATTCCAC-3 ;BhLEA2-
inv-r0:5 -GCTTCTTTCGCCTTCTTCTGT TCC-3 ;
BhLEA2-inv-r:5 -ACCATGGCATCAACACGCTC
CTT-3 ;BhLEA2-inv-r1:5-GTGCGGTGTACTTTC-
CAATGTTG -3 ;AD2:5 -NGTCGASWGA NAW-
GAA-3 ;BhLEA2-pro-f:5 -TCTCGAGTCAATAAT-
CAAACATA -3 ;BhLEA2-pro-r:5 -TT TGTCGAC-
TGCATCTTTTCTTGGTT-3 ;划线序列分别是 XhoI
和 SalI 酶切位点.
1.4.2　牛耳草基因组 DNA 提取 　用 DNeasy ?
Plant M ini Ki t 试剂盒(购自东胜创新公司)并按说
明书指示提取牛耳草叶片的基因组 DNA.
1.4.3　PCR扩增 、克隆 、 植物表达载体的构建及
测序　用 Hind Ⅲ酶切牛耳草基因组 DNA , 自连成
环后用作 PCR 扩增的模板 , 采用 Inverse-PCR 方法
用特异性引物 BhLEA2-inv-f 和 BhLEA2-inv-r0 ,
BhLEA2-inv-r 扩增得到 0.8 kb 的启动子序列 , 反
应体系 10μL , 反应条件:94℃预变性 4 min , 94℃
45 s , 55℃45 s , 72℃3min , 35 个循环 , 最后 72℃
延伸 10min , 12℃结束反应.将得到的片段回收纯
化后克隆到 pUC18 上 , 测序.
分别以 BhLEA2-inv-r0 , BhLEA2-inv-r , BhLEA2-
inv-r1和 AD2primer为引物 , 用 Tail-PCR 的方法继续
扩增 BhLEA2 基因的启动子序列 , 反应体系如表 1 ,
反应程序参照文献[ 17] , 经琼脂糖电泳检测扩增片段
的大小和特异性 , 将其中1 kb的PCR片段回收后克隆
到 pGEM-Teasy 载体上 , PCR及酶切验证后 , 测序.
表 1　Tail-PCR反应体系
序号 成分 各成分用量a)/μL
各成分用
量b)/μL
各成分用
量 c)/μL
1 10×PCR buf fer(TaKaRa) 2.0 2.0 2.0
2 2.0mM dN TPs 2.0 2.0 2.0
3 AD2 Primer(20μm ol/ L) 3.0 2.0 2.0
4 Specific Primer(10μmol/ L) 0.4 0.4 0.4
5 rT aq(5u/μL) 0.4 0.3 0.3
6 tem plate DNA 1.5 1.0(diluted
50×)
0.2(di luted
50×)
7 ddH 2O 10.7 12.3 13.1
　　a)第一轮 PCR 反应体系;b)第二轮 PCR 反应体系 ,第一轮的
PCR产物稀释 50 倍后作为模板;c)第三轮 PCR 反应体系 , 第二轮
PCR产物稀释 50 倍后作为模板
用引物 BhLEA2-pro-f 和 BhLEA2-pro-r 从牛
耳草基因组 DNA 中扩增 PBhLEA2序列 , 测序结果表
明该片段与用 Inverse-PCR 和 Tail-PCR 得到的序列
完全一致 , 并将该启动子片段插入植物双元表达载
体 pBISN1 的 GUS 报告基因上游 , 替代该位置上原
有的甘露碱合成酶启动子 , 得到 pBhLEA2-GUS 载
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体.DNA 测序委托北京奥科生物技术公司.
1.4.4　农杆菌介导的烟草转化　将构建好的植物
表达载体电转化农杆菌 LBA4404 , 用叶盘法转化烟
草[ 18] .用 100 mg/ L的卡那霉素筛选转化株 , 在小
苗长至 4—5 cm 高时移栽至温室中土培.
1.4.5　GUS活性检测 　转基因烟草成熟种子 , 1 ,
3 , 6 , 10 , 20 d 苗龄的小苗 , 及干旱(2 , 8 , 48 h)、
ABA(100 μmol/ L), NaCl(200 mmol/ L), 乙烯利
(40%), H2O 2(200μmol/L)处理 2 , 8 , 48 h 的 20 d
苗龄的小苗 , 浸入GUS 染液(8mL GUS histochemical
buffer , 120 μL 50 mg/mL X-Gluc , 2 mL Metha-
nol)[ 19] , 抽真空 10—15min , 37℃染色过夜 , 然后用
95%的乙醇脱色 , 用体视镜和电子显微镜观察并拍照.
2　结果
2.1　PBhLEA2片段的扩增与克隆
以牛耳草基因组 DNA 为模板 , 用 Inverse-PCR和
Tail-PCR的方法分别扩增得到0.8 kb 和1 kb 的特异片
段(图1), 分别包含407和808bp 的BhLEA2 基因的启
动子序列.设计引物直接从牛耳草 DNA中扩增出包含
这两段序列的 1215bp 启动子片段 , 命名为 PBhLEA2 .
图 1　BhLEA2 基因启动子扩增条带电泳结果图
(a)Inverse-PCR 扩增条带电泳图:1.PCR扩增条带;2.DNA 分
子量标准.(b)Tai l-PCR 扩增:1 和 2 分别为 T ail-PCR 第二轮和第
三轮扩增结果;3 , DNA 分子量标准.(c)从基因组 DNA中扩增
1215bp 的 BhLEA2 基因启动子:1.PCR产物;2.DNA 分子量标准
2.2　PBhLEA2片段的序列分析
利用植物顺式作用元件数据库(http://www.
dna.aff rc.go.jp/PLACE[ 20])对扩增到的 PBhLEA2 序列进
行分析 , 搜索可能存在的顺式作用元件.图 2 表明 ,
在 BhLEA2 基因上游启动子序列中除了一般启动子序
列中常见的 TATA -box、 CAAT-box 等元件以外 , 还
包含许多与胁迫诱导相关的顺式元件 , 如 3个 ABREs
图 2　PBhLEA2核苷酸序列及特征
黑框标注的是调控元件 , 黑框上的黑体字标注的是调控元件的种类 , 下划线的序列为起始密码子
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元件[ 21] 、 8 个W-box 元件[ 22] 、 4 个 MYB 元件[ 23] , 6
个MYC蛋白结合位点[ 23] 和1个HDE元件[ 24] , 分别与
bZIP , WRKY , MYB , MYC , HDZIP等转录因子结合
(图 2).另外还发现一个 AuxRE 元件[ 25] 和两种 6个增
强子元件[ 26 , 27] .这些调控元件在BhLEA2 基因转录调
控中的作用有待于进一步的实验证明.
2.3　PBhLEA2驱动的 GUS 报告基因在转基因烟草中
的表达检测
2.3.1　BhLEA2 基因的表达具有发育阶段性 　将
1215 bp 的 PBhLEA2 启动子插入到植物双元表达载体
pBISN1 的 GUS 报告基因上游(插入的同时删除了原
有启动子), 得到重组质粒 pBhLEA2-GUS.测序结
果表明 , 该片段与前述两段序列一致 , 证明扩增到的
序列是 BhLEA2 基因的启动子.用含有 pBhLEA2-
GUS 质粒的农杆菌转化烟草后 , 经卡那霉素筛选后
得到4 株转基因烟草植株.对这 4个株系烟草的未成
熟种子 、成熟种子 、和萌发不同时间的小苗染色观察
均发现:未成熟种子没有着色(图未列出);成熟种子
及萌发 1d 和 3 d的小苗有很强的 GUS 活性 , 并且着
色部位主要是在子叶和胚轴部分 , 胚根没有着色;萌
发6d 的小苗GUS 活性开始减弱 , 并且只在子叶部分
和胚轴的上部检测到 GUS 活性;萌发 10 d 和 20 d 的
小苗几乎检测不到GUS 活性(图 3(a)—(f)).
2.3.2　BhLEA2 基因的表达受干旱和 ABA等胁迫
诱导　将 20 d 苗龄的转基因烟草小苗分别经干旱 、
胁迫处理不同时间后染色 , 结果发现干旱处理 2 h
后在烟草子叶的叶脉(主脉除外)可以观察到明显的
蓝色(图 3(g), (v)), 随着干旱时间的延长 , 在部
分真叶的叶边缘 、 叶柄及根中也检测到蓝色 , 但子
叶中不再能观察到蓝色(图 3(g)—(i)).与干旱胁
迫不同 , ABA 处理后 GUS 信号最早虽然也是在子
叶上检测到 , 但是主要集中于主脉和附近的大叶
脉 , 8 h 后在子叶 、 真叶 、 根中均检测到较强的信
号;在子叶中 GUS 的活性较强 , 在叶脉和叶肉细胞
中均有表达;真叶的主脉基本没有检测到蓝色 , 在叶
肉及侧脉部分有蓝色;新叶着色浅于老叶(图 3(j)—
(l), (w), (x)).盐胁迫下 GUS 信号与 ABA 处理
相似 , 但在胁迫早期主脉染色不明显 , 而且根中一
直检测不到信号(图 3(m)—(o)).乙烯利处理后
图 3　不同发育阶段和处理下转基因植物中 GUS信号检测
(a)—(f)不同发育阶段G US 信号;(g)—(x)20 d 苗龄的转基因植
物在不同处理条件下 G US 信号检测;(f)未处理对照.(a)成熟
的种子(×32);(b)萌发 1 d 的小苗(×32);(c)萌发 3 d 的小苗
(×16);(d)6d 的小苗(×6.3);(e)10d 的小苗(×6.3);(f)20 d
的小苗(×6.3);(g)—(i)干旱 2 , 8 , 48 h(×6.3);(j)—(l)ABA
(100 μmol/ L)分 别 处 理 2, 8 , 48 h(× 6.3);(m)—(o) NaCl
(200mmol/ L)处理 2 , 8, 48h(×6.3);(p)—(r)乙烯利(40%)分别
处理 2, 8, 48h(×6.3);(s)—(u)H2O 2(200μmol/ L)分别处理 2, 8 ,
48h(×6.3);(v)干旱 2h 的子叶(×25);(w)—(x)ABA 处理 8h 的
真叶(×25)和子叶(×100)
42 　第 19卷　第 1期　2009年 1月
GUS 信号可在 2 h 检测到 , 但只在子叶的主脉 , 而
且很弱;随着处理时间延长 , 主脉附近的大叶脉及
邻近的叶肉细胞信号增强 , 第一对真叶的相应部位
也检测到信号 , 但主脉没有信号(图 3(p)—(r)).
H 2O2 处理 2 h 后即可在所有叶片中检测到微弱的信
号 , 但随着处理时间延长信号仅有微弱的增加 , 基
本局限在主脉和附近的大叶脉(图 3(s)—(u)).乙
烯利和H 2O 2 处理的小苗的根中均未检测到GUS 信
号(图 3(p)—(u)).我们用 RT-PCR 和 Nor thern 方
法对内源 BhLEA2 基因表达情况进行了研究 , 发现
其受干旱 、 ABA 、 NaCl 、乙烯利和 H2O 2 等信号分
子诱导表达的变化趋势与 GUS 染色结果一致[ 16] .
3　讨论
LEA 蛋白最早是在植物的胚胎发育后期被发现
的[ 28] .后来研究表明 , 很多 LEA 基因受干旱 、 低
温 、盐和 ABA 的诱导而在植物的营养组织中表达[ 6] .
很多 LEA基因的启动子序列中含有以 ACGT 为核心
序列的 ABRE , DRE(drought responsive element)[ 29]
和MYC , MYB , HDZIP 等转录因子的结合元件 , 这
些元件在 ABA 依赖型的信号传导途径中起作
用[ 30—32] .在BhLEA2 基因的启动子中发现了这些种
类的作用元件 , 但未发现干旱响应元件 , 因此推测该
基因在干旱胁迫下诱导表达可能主要是通过 ABA 信
号途径调控的.另外在 BhLEA2 基因的启动子中还
发现了能与WRKY 转录因子特异性结合的W-box 顺
式作用元件 , 表明WRKY 转录因子可能也参与了该
基因的转录调控[ 22] .很多WRKY 转录因子参与植物
抗病防卫反应 , 但最近研究发现部分 WRKY 转录因
子也参与干旱和盐害等胁迫的信号转导途径[ 33] .进
一步明确这些元件在该启动子调控基因转录中的作用
还需要利用启动子缺失等方法进行更详细的研究.
组织化学分析结果表明 , BhLEA2 启动子驱动的
GUS 报告基因表达受发育阶段的调控 , 在未成熟的种
子中没有表达 , 但在干燥的种子及萌发的幼苗中有很
强的 GUS 活性 , 随着幼苗的发育 , GUS 活性逐渐变
弱(图 3).烟草种子在成熟后期要经历一个脱水阶段 ,
而萌发时随着种子吸水和幼苗发育 , 植物组织中的水
分含量上升 , 这与 BhLEA2 启动子活性的涨落一致 ,
表明这种发育调控与水分变化相关.BhLEA2 基因在
正常供水的 20 d苗龄转基因小苗中检测不到表达信号 ,
但干旱 、盐 、乙烯利 、 ABA 和 H2O2 处理均可诱导表
达.我们利用 RT-PCR和 Northern杂交方法检测发现
BhLEA2 基因在牛耳草中受干旱 、盐 、 ABA 、乙烯利
和 H2O2诱导[ 16] , 这与本文中用GUS 报告基因方法检
测到的结果一致 , 证实了 BhLEA2 基因对环境胁迫和
信号分子的响应.这些结果表明 BhLEA2 基因可能参
与了牛耳草耐旱保护反应.
很多 LEA基因被发现在种子成熟期特异表达 ,
只有少数基因既在种子脱水成熟期表达 , 又在营养
组织中参与胁迫诱导表达 , 而我们的结果表明
BhLEA2 基因属于后一类.ABA 处理转基因烟草
小苗在子叶和维管束部位表达明显 , 与从另一个复
苏植物中发现的 LEA 基因 pcCC2 启动子转化的拟
南芥染色结果相似[ 34] , 说明它们的调控具有一定的
相似性.ABA 等信号分子诱导的 GUS 信号可以在
烟草子叶中检测到 , 但在真叶尤其是幼叶中检测不
到 , 表明 BhLEA2 的转录调控同时受到发育时间 、
组织部位和内外源信号的综合调控.
随着转基因技术的广泛应用 , 人们逐渐认识到了
解抗逆植物中的特异启动子对抗逆基因调控的重要作
用 , 启动子分析已经成为植物基因工程研究关注的热
点问题[ 35] .本研究揭示了干旱诱导的复苏植物牛耳
草 PBhLEA2在不同发育阶段 、不同组织和不同胁迫及
激素等信号分子诱导下驱动基因表达的时空特点 , 为
了解 BhLEA2 基因在复苏植物耐旱反应中的功能及
其在抗旱植物育种中的应用提供了理论基础和一个有
效的环境胁迫和信号分子诱导型的启动子资源.
致谢　中国科学院植物研究所华学军研究员惠
赠 pBISN1质粒 , 特此致谢.
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