全 文 ：第 28卷　第 2期 西北农业大学学报 Vol. 28 No. 2
2000年 4月 Ac ta Univ . Ag ric. Bo reali-occidentalis Apr. 2000
[文章编号 ]1000-2782( 2000) 02-0008-05
二棱大麦 LEA cDNA的克隆与测序⒇
郭卫东1 ,饶景萍 1 ,李嘉瑞 1 ,郑学勤 2
( 1西北农林科技大学园艺系 ,陕西杨陵 712100)
( 2中国热带农业科学院生物技术国家重点实验室 ,海南儋州 571737)
　　 [摘　要 ]　从二棱大麦 ( Hordeum distichon Linn. )幼苗中提取总 RN A,通过 RT-PCR
获得目的片段 HDCS1,并采用 T-载体进行克隆。 测序结果表明 , HDCS1全长 664 bp,含有 1
个完整的阅读框架。其编码蛋白质全长 202个氨基酸 ,含有 8个由 11个氨基酸残基组成的基
元序列 ,属第 3组 LEA蛋白。HDCS1与大麦 ( Hordeum vulgare L. ) LEA蛋白、 HV A1具有高
度同源性 ,其差异在于 HDCS1比 HV A1缺少一个完整的由 11个氨基酸残基组成的基元序
列。
[关键词 ]　二棱大麦 ; LEA基因 ;克隆
[中图分类号 ]　 S512. 103. 2; Q943. 2　　　 [文献标识码 ]　 A
植物能够通过渗透调节、脱水保护、代谢调整等多种途径适应干旱胁迫。 LEA蛋白是
一种脱水保护剂 ,能够在干旱胁迫条件下保护生物大分子 ,尤其是膜结构的稳定性 ,减轻
干旱造成的伤害。根据其氨基酸序列 , LEA蛋白可划分为若干组 [1 ]。 HVA1是从大麦糊粉
层中克隆的 1个第 3组 LEA基因 [2 ] ,干旱或 ABA均能诱导该基因的表达 [3 ]。 Xu等 [ 4]将
HV A1 cDNA导入水稻 ,获得了耐旱能力较强的转基因水稻 ,从而直接证实了 HVA1是
一个有利用价值的抗旱基因。 本研究拟根据 HVA1 cDNA序列合成 1对引物 ,用 RT-
PCR从经 ABA诱导的二棱大麦 ( Hordeum distichon Linn. )幼苗中克隆 1个与 HVA1高
度同源的第 3组 LEA cDNA,为作物的抗旱基因工程研究奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　材　料
　　二棱大麦 ( Hordeum dist ichon Linn. )种子用清水浸泡约 12 h,播种于铺设 2～ 3层吸
水纸的培养皿中。种子萌芽 3 d时参考文献 [5, 6 ]的方法 ,用 0. 1 mmol /L ABA浇灌幼苗 ,
继续生长 24 h,以诱导 LEA基因表达。
1. 2　方　法
经过诱导的二棱大麦幼苗用 DEPC处理水反复冲洗 ,用灭菌滤纸吸去表面水滴 ,称
取 0. 5～ 1. 0 g茎叶组织 ,加入液氮后研磨成粉末 ,采用异硫氰酸胍法提取总 RNA[7 ]。 取
约 5μg的总 RNA参考文献 [7, 8]的方法反转录合成 cDN A第 1链。 根据 HV A1 cDNA
序 列 [2 ] 合 成 1 对 引 物 ( P1: 5′CGTGAGACGAAGATGGCCTCCAACC 3′; P2: 5′
⒇ [收稿日期 ]　 1999-05-04
　 [基金项目 ]　杨陵农业科技开发基金资助项目 ( 4130202)
　 [作者简介 ]　郭卫东 ( 1968- ) ,男 ,副教授 ,博士
AAACACGACTAAAGGAACGG 3′) ,在 0. 5 mL Eppendo rf管中加入 5μL反转录产
物、 4μL引物 ( P1 , P2各 2μL,约 30 pmo l)、 10μL dN T Ps(各 2. 5 mmo l /L)、 5μL反应缓
冲液 ( 500 mmol /L KCl, 100 mmol /L Tris-HCl , pH9. 0, 10 g /L Tri ton X-100, 15 mmo l /L
MgCl2 )、 3. 5μL二甲基亚砜 ( DM SO)、 21. 5μL H2O,覆盖 50μL石蜡油 , 95℃变性 10
min,然后 ,加入 1μL Taq DN A聚合酶 ( 5 mol / ( L· min) ) ,按以下条件进行循环反应:
94℃ 1 min, 55℃ 1 min, 72℃ 2 min,共进行 30次循环。 PCR产物的回收、连接反应、感受
态细胞制备、大肠杆菌转化、质粒的小量或大量提取、酶切反应等均参考文献 [6]的方法进
行。参照文献 [9]的方法 ,采用 ABI 377型 DNA自动测序仪进行序列测定。
2　结果与分析
2. 1　通过 RT-PCR获得目的片段
　　 ABA诱导能提高二棱大麦幼苗总 RNA中 LEA mRNA的丰度 [ 5]。紫外扫描分光光
度计测定分析和甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析表明 ,提取的总 RNA纯度较高且比较完
整 ,未发生严重的降解。以二棱大麦总 RNA为反应底物 ,反转录合成 cDN A第 1链 ,其中
含有从 LEA mRNA反转录得到的 LEA cDNA第 1链。采用根据 HVA1 cDNA序列 [2 ]合
成的 1对引物 ,以 cDN A第 1链为模板进行 PCR,扩增得到长约 700 bp的 DNA片段 (图
1) ,此片段长度与 HVA1相似。在 PCR反应体系中加入 70 mL /L的 DMSO提高引物与
模板结合的特异性 ,使目的片段条带清晰 ,反应副产物减少 (图 1)。
图 1　 PCR产物琼脂糖凝胶 ( 10 g /L )电泳结果
A:未加 DM SO的 PCR; B:加 DMSO的 PCR
1.购自 SABC的 PCR Mark ers; 2～ 5. PCR产物
2. 2　目的片段的克隆
回收长约 700 bp的 PCR扩增片段 ,利用 T-载体进行克隆。采用 PE公司生产的
ABI377型 DNA自动测序仪对目的片段分别进行了正向和反向序列分析 ,将 2个方向的
测定结果核对、合并后得到目的片段 HDCS1的核苷酸序列 (图 2)。 HDCS1全长 664 bp,
有 1个完整阅读框架 ,编码蛋白质全长 202个氨基酸 ,存在 8个由 11个氨基酸残基构成
的基元序列 ,这是第 3组 LEA蛋白的结构特征 ,表明 HDCS1属于第 3组 LEA cDNA。
9第 2期 郭卫东等: 二棱大麦 LEA cDNA的克隆与测序
图 2　 HDCS1 cDNA核苷酸序列及其编码蛋白的氨基酸序列
2. 3　 HDCS1与 HV A1同源性分析
利用计算机软件 PCGEN E对 HDCS1与 HV A1的核苷酸序列及其所编码的蛋白质
氨基酸序列进行了同源性分析。结果表明 , HDCS1的 664个核苷酸残基均与 HVA1相
同 ,但是 ,与 HVA1相比 , HDCS1缺少了 C399～ C431的 33个核苷酸。 HDCS1编码的 202个
氨基酸也均与 HVA1相同 ,同样也缺少相应的 Thr122～ Ala132的 11个氨基酸残基 ,这 11
个氨基酸是一个完整的基元序列 ,即 HDCS1比 HVA1缺少 1个基元序列 (图 3) ,除此之
外 ,其他部分则完全相同。
10 西北农业大学学报 第 28卷
图 3　 HDCS1与 HVA1所编码的蛋白质氨基酸序列同源性分析
3　讨　论
抗旱基因工程具有巨大的应用潜力 ,因此 ,抗旱基因的克隆引起了人们的极大兴趣。
目前 ,已克隆了许多与抗旱相关的基因 ,例如催化脯氨酸生物合成的 1Δ-二氢吡咯-5-羧酸
合成酶 ( P5CS)基因 [10 ]、催化甘氨酰甜菜碱生物合成的甜菜碱醛脱氢酶 ( BADH)基因 [11 ]、
海藻糖合成的酶基因 [ 12, 13]等。 胚胎发生后期丰富蛋白是植物脱水保护剂 ,在干旱胁迫下
能保护膜系统的稳定性 [14, 15 ]。大麦 ( H. vulgare L. )与二棱大麦 ( H. dist ichon L. )是同属
的近缘植物 ,因而具有几乎相同的第 3组 LEA基因。 HVA1与 HDCS1在结构上的差异
仅在于 HDCS1比 HV A1缺少 1个含有 11个氨基酸残基的基元序列 ,其他部分则完全相
同。由 11个氨基酸残基构成的基元序列是第 3组 LEA蛋白的结构特征 ,该基元序列是亲
水亲脂兼性的 ,呈α-螺旋结构 ,可能是形成第 3组 LEA蛋白高级结构的基础 [ 1]。然而 ,基
元序列的数量多少是否会对第 3组 LEA蛋白高级结构和脱水保护功能的发挥产生影响?
影响的程度如何?这方面的问题尚缺少深入研究。 HDCS1和 HVA1的差异为研究这些问
题提供了试验的材料。
11第 2期 郭卫东等: 二棱大麦 LEA cDNA的克隆与测序
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Cloning of a g roup 3 Lea cDN A from two row barley
GUO Wei-dong
1 ,RAO Jing-ping
1 , LI Jia-rui
1 , ZHENGXue-qin
2
( 1 Depa rtment of Hort icul ture, Northwest Science and Tech nolog y University of
Ag ricul tura l and Forestr y, Yangl ing , Shaan xi 712100,China )
( 2 N ational Key B iotechnology Labora tor y for Tropical Crop s, Danzhou , Hainan 571737,Ch ina )
Abstract: To tal RN A is ex t racted f rom tw orow barley ( Hordeum distichon Linn. )
seedling s induced wi th 0. 1 mmo l /L ABA and reversely t ranscribed to first strands of
cDN A. The interest fragment , HDCS1, is obtained by PCR and cloned by T-overhang
vecto rs. HDCS1 is 664 bp long containing one open reading f rame. It encodes a deduced
pro tein o f 202 amino acid residues, which contains eight moti fs composed of 11 amino
acids and belong s to g roup 3 LEA pro tein. HDCS1 is highly homo logous to ba rley
( H. vulgare Linn. ) HV A1. The only di fference between them is that the number of 11-
mer repeating units of HDCS1 is one less than that of HV A1.
Key words: tw orow barley; LEA cDNA; cloning
12 西北农业大学学报 第 28卷