全 文 ：第 32 卷第 4 期 中南民族大学学报(自然科学版) Vol． 32 No． 4
2013 年 12 月 Journal of South-Central University for Nationalities(Nat． Sci． Edition) Dec． 2013
收稿日期 2013-07-29
作者简介 黄先菊(1972-)，女，教授，博士后，研究方向:心脑血管、神经药理，药物毒理学，Email:huangxianju1972@
yahoo． cn
基金项目 国家自然科学基金资助项目(81102897，81374064);国家十二五科技支撑计划资助项目(2012BAI27B06)
雪上一枝蒿体内外毒性研究
黄先菊，周 欢，蒋 逸，任 炜，郑 蜜，蔡光雄
(中南民族大学 药学院，武汉 430074)
摘 要 为观察雪上一枝蒿不同部位提取物的体内外毒性，以 MTT法测定了药物在体外对 Vero 猴肾细胞的毒性
作用，以小鼠急性毒性试验测定了药物对小鼠的口服半数致死量(LD50)．结果表明:雪上一枝蒿各提取部位对 Vero
细胞有不同程度的毒性作用，药物浓度为 500 μg /mL时，氯仿、石油醚、正丁醇和乙酸乙酯提取物对体外培养 24 h
的细胞增殖抑制率分别为 63． 9%，69． 7%，32． 9%和 18． 2% ． 氯仿部位、石油醚部位、正丁醇部位对小鼠的经口
LD50分别为 37． 991 mg /kg，6766． 928 mg /kg和 5492． 337mg /kg．
关键词 雪上一枝蒿;提取部位;Vero细胞;急性毒性
中图分类号 Ｒ965 文献标识码 A 文章编号 1672-4321(2013)04-0050-03
Investigation of the Toxicity of Aconitum brachypodum
Diels in vitro and in vivo
Huang Xianju，Zhou Huan，Jiang Yi，Ｒen Wei，Zheng Mi，Cai Guangxiong
(College of Pharmacy，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China)
Abstract To investigate the toxicities of different extracts from Aconitum brachypodum Diels in vitro and in vivo，MTT
assay was used on Vero cell in vitro and LD50 was monitored after intragastric administration with the different extracts． The
results showed that different inhibition effect rates were obtained from different extracts． The 24h inhibition rate of
chloroform，petroleum ether，n-butanol and ethyl acetate extracts on Vero cell were 63． 9%，69． 7%，32． 9% and 18． 2%
respectively． Different extracts from Aconitum brachypodum Diels had different degrees of toxic effects to mice as well． LD50
of chloroform，petroleun ether and n-butanol extracts were 37． 991 mg /kg，6766． 928 mg /kg and 5492． 337mg /kg，
respectively．
Keywords Aconitum brachypodum Diels;extracts;Vero cell;acute toxicity
雪上一枝蒿为毛茛科乌头属(Aconitum)植物短
柄乌头的干燥块根，性温，味苦、辛，有剧毒，能祛风
除湿、消炎镇痛，用于风湿骨痛、跌打肿痛和牙痛等
症疗效显著［1］． 雪上一枝蒿含有甲、乙、丙、丁、戊、
己、庚素，乌头碱，次乌头碱，3 －去氧乌头碱，3 －乙
酰乌头碱，雪乌碱，丽鲁碱，准葛尔乌头碱，欧乌头碱
等［2］．雪上一枝蒿甲、乙、丙、丁素均有镇痛作用［3］，
雪上一枝蒿速效止痛搽剂具有抗炎作用［4］，此外它
还具有局麻、抗生育等作用［5］． 现代研究表明，乌头
属植物可能具有一定的抗癌作用． 乌头属植物多含
aconitine型 C19 二萜生物碱［5］，主要有毒成分为乌
头碱，一般中毒剂量为 0． 2 mg，致死量为 2． 0 ～ 4． 0
mg ，对神经系统先兴奋后抑制，消化系统表现为流
涎、恶心、呕吐、腹痛、腹泻，并直接作用于心脏，产生
异常兴奋，可致心率失常，甚至室颤而死亡［6］．
本文采用一次灌胃给药法观察雪上一枝蒿不同
提取部位(石油醚部位、氯仿部位、正丁醇部位)对
小鼠急性毒性作用，并以 MTT法观察各个提取部位
对 Vero细胞的抑制作用．
1 材料和方法
1． 1 材料
昆明小鼠，SPF级，雌雄各半，体重 18 ～ 22 g，购
自湖北省实验动物中心［SCXK(鄂)2008-0005］．
Vero细胞株(武汉病毒所王汉中老师馈赠)．雪上一
枝蒿块根(购自安徽亳州药市)，小牛血清(杭州四
季青生物工程材料有限公司)，ＲPMI-1640 细胞培养
基(GIBCO，Invitrogen，USA)，MTT(Biotech) ，DMSO
(天津科密欧化学试剂有限公司)，胰酶(Amerisco
公司)，其他试剂均为分析纯．
全自动酶标仪(354 型，上海 Thermo公司)，CO2
培养箱(MCO-15AC型，日本 SANYO 公司)，超净工
作台(SW-CJ型，上海 AIＲTECH 公司)，台式离心机
(TDL80-2B 型，上海安亭科技器材厂)，精密天平
(AL204 型，上海梅特勒-托利多仪器有限公司)．
1． 2 方法
2． 1． 1 雪上一枝蒿不同提取物部位的制备
取雪上一枝蒿干药材 100 g粉碎，置于 1000 mL
圆底烧瓶中，分别加 10 倍、8 倍、5 倍量 95%的乙
醇，回流提取 3 次，每次分别为 3，2，1 h，3 层纱布
过滤，合并提取液，两层滤纸抽滤，再旋转蒸发，得
23． 6 g浸膏，用 200 mL 0． 2%的 H2SO4超声溶解，用
石油醚多次萃取(至石油醚萃取液澄清，即石油醚
部位充分萃取，下同)，得石油醚萃取液，剩余液用
氨水调 pH值为 9 ～ 10，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁
醇分多次萃取，分别得到氯仿萃取液、乙酸乙酯萃取
液、正丁醇萃取液;将各种萃取液旋转蒸发、干燥后
分别得石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位和正丁
醇部位．
2． 1． 2 雪上一枝蒿活性部位对 Vero细胞的毒性
Vero猴肾细胞培养于含 10%小牛血清，青霉素
(100 μg /mL)，链霉素(100 μg /mL)的 PＲMI-1640
培养液中，置于 37℃，5% CO2，相对湿度 100%的恒
温培养箱中进行培养，每日观察细胞生长情况，定期
换液，对生长密度超过 80%瓶底面积的细胞进行消
化传代．用 D-hank’s 液冲洗 2 次，加入 0． 25%胰蛋
白酶 1 mL消化液，置 37℃约 3 ～ 4 min，倒置显微镜
下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞间连接消失，表
明此时细胞消化适度，吸取上清液，加入完全培养液
2 mL，反复吹打，将细胞吹打均匀．每次传代的比例
为 1 ︰ 2，置于恒温培养箱里培养．实验用的细胞均
处于对数生长期．
参考文献［7］，选取生长处于对数期的 Vero 猴
肾细胞，胰酶消化后，调整细胞浓度，转移到 96 孔板
中，12 h培养后加药处理(乙酸乙酯提取部位、氯仿
提取部位、石油醚提取部位、正丁醇提取部位)，培
养 24 h后，每孔加入 5 mg / mL MTT 10 μL，继续培
养 2 ～ 4 h 后，去上清，加入 150 μL DMSO 溶解，于
酶标仪 492 nm 处检测 OD 值，计算药物的处理后
Vero细胞存活率．
2． 1． 3 急性毒性试验
预试验结果显示，氯仿部位的 LD50约为 40 mg /
kg，石油醚部位和正丁醇部位的 LD50约为 5000 mg /
kg．取健康昆明小鼠 140 只，实验前禁食 12 h，不禁
水，随机分成 14 组，每组 10 只，雌雄各半．分组包括
空白组、氯仿部位组、石油醚组和正丁醇组，剂量比
值为 0． 6，其中氯仿部位组分为 78． 13，62． 5，50，
40，32，25． 6，20． 48 mg /kg 各 7 组，;石油醚部位
组分为 3000，5000，8333 mg /kg 各 3 组;正丁醇部
位组分为 3000，5000，8333 mg /kg 各 3 组． 氯仿组
和正丁醇组以高压灭菌水溶解药物，石油醚部位以
植物油溶解药物，按 10 mL /kg 体积一次性灌胃给
药，空白组一次性给同等体积的高压灭菌水，连续 7
d观察动物的毒性表现和死亡数．
1． 3 统计学处理
以(珋x ± s)表示实验数据，用 SPSS 软件计算
LD50并进行 ANOVA中 LSD事后比较方法比较组间
差异，P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义．
2 结果
2． 1 雪上一枝蒿活性部位对 Vero细胞的活性影响
雪上一枝蒿氯仿提取物对 Vero 细胞作用 24 h
后的毒性结果见图 1．如图 1 所示，62． 5，125，250，
500 μg /mL的氯仿提取物均导致 Vero 细胞存活率
显著下降(P ＜ 0． 01)，且具有剂量依赖性． 500 μg /
mL 氯仿提取物对 Vero 细胞的增值抑制率
为63． 9 % ．
雪上一枝蒿石油醚提取物对 Vero 细胞的毒性
结果见图 2． 如图 2 所示，7． 8，15． 6，31． 2 μg /mL
的石油醚提取物对 Vero 细胞存活率无明显作用，
62． 5，125，250，500 μg /mL 的石油醚提取物均导
致 Vero细胞存活率显著下降(P ＜ 0． 01)，药物浓度
为 250 μg /mL和 500 μg /mL时，细胞存活率均小于
50% ． 500 μg /mL石油醚提取物对 Vero 细胞的增值
15第 4 期 黄先菊，等:雪上一枝蒿体内外毒性研究
ρ /(μg·mL －1)
与对照组比较，＊＊P ＜ 0． 01
图 1 雪上一枝蒿氯仿提取部位对 Vero细胞的毒性作用
Fig． 1 Toxic effect of chloroform extracts on Vero cells
抑制率为 69． 7 % ．
ρ /(μg·mL －1)
与对照组比较，＊＊P ＜ 0． 01
图 2 雪上一枝蒿石油醚提取部位对 Vero细胞的毒性作用
Fig． 2 Toxic effects of petroleum ether extracts on Vero cells
雪上一枝蒿正丁醇提取物对 Vero细胞的毒性结果
见图3．如图3所示，7．8，15．6，31．2，62．5，125，250，500
μg /mL的正丁醇提取物均导致 Vero细胞存活率下降(P
＜0．05)，当药物浓度为 500μg /mL时存活率最小，为 67．
1%，对Vero细胞的增值抑制率为 32． 9%．雪上一枝蒿乙
酸乙酯提取物对Vero细胞的毒性结果见图4．
ρ /(μg·mL －1)
与对照组比较，* P ＜0．05，＊＊P ＜0．01
图3 雪上一枝蒿正丁醇提取部位对Vero细胞的毒性作用
Fig．3 Toxic effects of n-butanol extracts onVero cells
如图 4 所示，药物浓度为 7． 8，15． 6，31． 2，62． 5，
125，250 μg /mL时，对细胞无明显影响，500 μg /mL的乙
酸乙酯提取物使 Vero细胞存活率显著下降(P ＜0． 01)，
为81．8%，对Vero细胞的增值抑制率为18．2 %．
ρ /(μg·mL －1)
与对照组比较，＊＊P ＜ 0． 01
图4 雪上一枝蒿乙酸乙酯提取部位对 Vero细胞的毒性作用
Fig． 4 Toxic effects of ethyl acetate extracts on Vero cells
2． 2 雪上一枝蒿不同部位的急性毒性
雪上一枝蒿不同活性成分给药后 4 h 的中毒表
观特征(主要是呕吐、腹式呼吸、怠动和腹泻)和死
亡数统计结果见表 1．
表 1 急性毒性实验中毒表征和死亡数统计 (n = 10，mean ± SD)
Tab． 1 The poisoning characterization and mortality statistics of acute toxicity experiment
组别 动物数 /只 给药量 /(mg·kg －1) 是否出现中毒症状 死亡数 /只
氯仿部位 10 20． 48 无 0
10 25． 60 有 3
10 32． 00 有 6
10 40． 00 有 6
10 50． 00 有 7
10 62． 50 有 8
10 78． 13 有 10
正丁醇部位 10 3000． 00 无 0
10 5000． 00 有 2
10 8333． 00 有 8
石油醚部位 10 3000． 00 无 0
10 5000． 00 有 5
10 8333． 00 有 9
对照组 10 － 无 0
( 下转第 68 页)
25 中南民族大学学报(自然科学版) 第 32 卷
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88-92．
( 上接第 52 页)
由 SPSS软件处理以上数据得到雪上一枝蒿氯
仿部位，石油醚部位，正丁醇部位 3 种不同活性成分
的 LD50分别为 37． 991 mg /kg(95%置信区间 37． 131
～ 45． 185 mg /kg)，6766． 928 mg /kg(95%置信区间
5440． 313 ～ 8477． 545 mg /kg)，5492． 337 mg /kg
(95%置信区间 4344． 933 ～ 7293． 847 mg /kg)．
3 讨论
雪上一枝蒿治疗量与中毒量十分接近，若用量
不当可以出现剧烈的毒性反应，甚至死亡。其主要
毒性成分为乌头碱，中毒主要表现为出现心血管和
神经系统症状。本文结果表明，雪上一枝蒿不同提
取部位对小鼠均有不同程度的毒性作用，氯仿部位
提取物毒性为高毒，对昆明小鼠的经口 LD50为
37． 991 mg /kg，石油醚部位、正丁醇部位提取物微
毒，对 昆 明 小 鼠 的 经 口 LD50 分 别 为
6766． 928，5492． 337 mg /kg．
国内有报道表明乌头碱具有心脏毒性、肝毒性
和肾毒性［8］，本课题组前期研究亦发现乙醇总提物
大剂量对猪肾 PK － 15 细胞具有一定的毒性． 本研
究发现，500 μg /mL 的氯仿提取物、石油醚提取物、
正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物对 Vero 细胞的增
值抑制率分别为 63． 9%，69． 7%，32． 9% 和
18． 2%，表明 4 个提取部位对 Vero 细胞均有一定毒
性，其毒性机制有待进一步研究．
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