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芩蒿滴鼻剂中一枝蒿抗炎有效成分的提取工艺研究



全 文 :基金项目:新疆维吾尔自治区重大科技专项(201130105-4)
作者简介:杨国萍(1986-),女,在读硕士,研究方向:药物新制剂与新剂型研究。
通信作者:顾政一,男,研究员,博士生导师,研究方向:药物新制剂与新剂型研究,E-mail:zhengyi087@126.com。
芩蒿滴鼻剂中一枝蒿抗炎有效成分的提取工艺研究
杨国萍1,顾政一2,徐 芳2,赵 军2,黄 华2,董先红1
(1新疆医科大学药学院药剂/物化教研室,乌鲁木齐 830011;2新疆维吾尔自治区药物研究所,乌鲁木齐 830000)
摘要:目的 研究芩蒿滴鼻剂中一枝蒿抗炎有效成份的最佳提取工艺。方法 以抗炎药理学活性为考察指
标,确定一枝蒿抗炎有效成分的提取溶剂;以一枝蒿酮酸含量和出膏率为考察指标,采用单因素试验与L9(34)正交
试验设计优选一枝蒿的最佳提取工艺。结果 一枝蒿最佳工艺为10倍量95%乙醇回流提取3次,每次0.5h。结
论 优选的提取工艺稳定可行。
关键词:一枝蒿;一枝蒿酮酸;提取工艺;正交试验
中图分类号:R943  文献标识码:A  文章编号:1009-5551(2013)01-0047-05
Study on the extraction technology for Artemisia rupestris L.anti-inflammatory
effective constituent in Qin-hao nasal drops
YANG Guo-ping1,GU Zheng-yi 2,XU Fang2,ZHAO Jun2,HUANG Hua2,DONG Xian-hong1
(1 Department of Pharmaceatics and Physical Chemistry,College of Pharmacy,Xinjiang Medical
University,Urumqi 830011,China;2 Xinjiang Institute of Materia Medica,Urumqi 830000,China)
Abstract:Objective To optimize the extraction technology conditions for Artemisia rupestris L.anti-in-
flammatory effective constituent in Qin-hao nasal drops.Methods Determined the extraction solvent of
Artemisia rupestris L.anti-inflammatory effective constituent by anti-inflammatory activity.Then,we
used comprehensive score of the content of Rupestonic acid and dry extractive material as indexes,adapted
single factor experiments and orthogonal experimental design L9(34).Results The best extraction condi-
tions were as folows:fold of 95%alcohol,extracted for three times,0.5hour for each time.Conclusion 
The extraction technics of Artemisia rupestris L.is reliable and available.
Key words:Artemisia rupestris L.;rupestonic acid;extraction technology;orthogonal design
  芩蒿滴鼻剂是过敏性鼻炎的经验方,其主药为
一枝蒿。一枝蒿为新疆道地药材,故又称新疆一枝
蒿。一 枝 蒿 (Artemisia rupestris L.)为 菊 科
(Compositae)蒿属 (Artemisia L.)植物,以全草入
 第36卷 第1期 新 疆 医 科 大 学 学 报 Vol.36 No.1
 2013年1月 Journal of Xinjiang Medical University Jan.2013
药,是维吾尔医用传统药材,维医习称一孜乎艾曼
尼。一枝蒿主要分布于我国新疆阿尔泰山、天山和
昆仑山区海拔1 600~4 500m的森林草原带,具有
抗过敏、散瘀消肿、清热解毒等功能,用于治疗过敏
性疾病、荨麻疹、感冒等症[1-2]。一枝蒿主要含有倍
半萜类、黄酮类等多种化合物,其中酮酸含量最为丰
富[3-4]。根据芩蒿滴鼻剂的功能主治,研究以抗炎
活性为指标,优选一枝蒿适宜的提取溶剂;以一枝蒿
酮酸含量和出膏率为指标,采用单因素试验和
L9(34)正交试验设计优选一枝蒿最佳提取工艺,为
芩蒿滴鼻剂的进一步研究和开发提供依据。
1 仪器与材料
1.1 仪器 LC-20AB高效液相色谱仪,SPD-20A
紫外检测器(日本岛津公司),UV765紫外-可见分
光光度计(上海精密科学仪器有限公司),AB135-S
型电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司),
KDM型调温电热套(山东省鄄城永兴仪器厂),KQ-
500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限
公司)。
1.2 材料 一枝蒿酮酸对照品(供含量测定用,含
量99.6%,批号20110420)购于中国科学院新疆理
化技术研究所。一枝蒿购自新疆乌鲁木齐华泰辉煌
商贸有限公司,由新疆维吾尔自治区药物研究所何
江副研究员鉴定为菊科蒿属植物一枝蒿 (Artemisia
rupestris L.)。甲醇为色谱纯,水为双蒸水,其它试
剂均为分析纯;昆明种小鼠,体质量18~22g,雌雄
各半,由新疆实验动物中心提供[许可证号:SYXK
(新)2003-0003]。
2 方法与结果
2.1 一枝蒿酮酸含量测定方法
2.1.1 色谱条件与系统适用性实验 色谱柱:Phe-
nomenex C18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm);流
动相甲醇-0.4%磷酸溶液(55∶45);检测波长
242nm,流速1.0mL/min,柱温30℃,进样量10μL。
在此色谱条件下,一枝蒿酮酸与供试品溶液中其它
组分色谱峰基线分离,一枝蒿酮酸对照品及供试品
色谱图见图1。
   
A:一枝蒿酮酸对照品      B:供试品
图1 一枝蒿酮酸HPLC图
2.1.2 对照品溶液的制备 取一枝蒿酮酸对照品
约10mg,精密称定,置10mL量瓶中,用甲醇溶解
并稀释至刻度,摇匀,即得浓度为1 156μg/mL的
储备液。精密量取储备液5mL于10mL量瓶中,
用甲醇稀释至刻度,即得浓度为578μg/mL的一枝
蒿酮酸对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备 取各提取液适量稀释
后经0.45μm微孔滤膜过滤,取续滤液作为供试品
溶液。
2.1.4 标准曲线及线性范围 分别精密量取0.2、
0.4、0.6、0.8、1.0mL一枝蒿酮酸对照品溶液于
10mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀。精密吸取
各对照品溶液10μL,注入液相色谱仪,按上述色谱
条件测定。以峰面积A对浓度C进行线性回归,得
回归方程为:A=37 153 C+124 661,相关系数r=
0.999 4,一枝蒿酮酸在11.56~80.92μg/mL范围
84 新 疆 医 科 大 学 学 报 第36卷 
内线性关系良好。
2.1.5 精密度试验 取对照品溶液连续进样6次,
每次进样10μL,记录峰面积,RSD为0.75% (n=
6),表明本方法精密度良好。
2.1.6 稳定性试验 取供试品溶液分别于0、1、2、
4、8、12h进样测定含量,RSD为0.99%,表明供试
品溶液在室温条件下12h内稳定较好。
2.1.7 重复性试验 取同一供试品,按“2.1.3”项制
备供试品溶液6份,在上述色谱条件下进样测定含
量,RSD=0.75%(n=6),表明本方法重复性良好。
2.1.8 加样回收率试验 取已知含量的供试品6
份,分别精密加入578μg/mL一枝蒿酮酸对照品溶
液各0.5mL,按“2.1.3”项制备供试品溶液,在上述
色谱条件下进样测定,结果一枝蒿酮酸的平均回收
率为97.86%,RSD为0.96% (n=6)。
2.2 出膏率测定方法 精密吸取供试品25mL,置
已干燥至恒重的蒸发皿中,在水浴上蒸干,于105℃
干燥3h,移置干燥器中,冷却30min,迅速精密称
定重量,计算出膏率。
2.3 评价指标 以一枝蒿酮酸含量(Y1)和出膏率
(Y2)的加权综合评分(Y=Y1×90+Y2×10)为评
价指标。
2.4 单因素试验
2.4.1 提取溶剂的选择 称取一枝蒿粗粉5份,每
份50g,分别加10倍量蒸馏水、30%乙醇、50%乙
醇、70%乙醇、95%乙醇,回流提取3次,每次1h,过
滤,滤液合并,减压浓缩至干膏备用。采用二甲苯致
小鼠耳肿胀试验和毛细血管通透性试验进行抗炎药
理活性筛选。
2.4.1.1 二甲苯致小鼠耳肿胀试验 取健康昆明
种小鼠54只,体质量18~22g,随即分成6组,即模
型组(生理盐水)、水提物组,30%乙醇提取物组,
50%乙醇提取物组,70%乙醇提取物组,95%乙醇提
取物组。各组按生药量2g/kg的剂量或生理盐水,
于小鼠右耳涂药每日2次,连续5d,于末次给药
1.5h后,温水洗去,用干棉球擦净。将0.02mL二
甲苯均匀涂抹于小鼠右耳廓两面,致肿,以左耳作对
照。30min后脱颈椎处死小鼠,沿耳廓基线剪下两
耳,用直径8mm打孔器分别在两耳的同一部位打
下圆耳片,于分析天平称重(精确到0.000 1g),计
算肿胀度与肿胀抑制率,结果见表1。
2.4.1.2 毛细血管通透性试验 取健康昆明种小
鼠60只,体质量18~22g,随机分成6组,药方法同
耳肿胀试验,在最后一次给药1h后,腹腔注射1%
HAc溶液 (0.4 mL/只),同时尾静脉注射 1%
Evan’s溶液(0.4mL/只),30min后,脱颈处死,用
10mL生理盐水冲洗腹腔,合并滤液,于590nm处
测定吸收度,结果见表2。
表1 一枝蒿提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响
组别 酮酸含量/% 出膏率/% 小鼠数/只 剂量/(mg/kg) 肿胀度/(×10-4g) 抑制率/%
模型组 - - 9 - 118.8±24.6 -
水提物组 0.18  19.53  9  337  108.4±27.1  8.7
30%乙醇提取物组 0.21  15.21  9  294  92.9±28.1* 21.8
50%乙醇提取物组 0.22  14.64  9  283  66.8±24.0* 43.8
70%乙醇提取物组 0.25  13.72  9  265  66.0±22.6* 44.4
95%乙醇提取物组 0.28  6.55  9  127  51.3±22.7* 56.8
  注 与模型组比较,*P<0.05。
  试验结果表明,95%乙醇提取物中一枝蒿酮酸
的含量最高,且95%乙醇提取物的二甲苯致小鼠耳
肿胀抑制率和毛细血管通透性抑制率均>50%,故
确定用95%乙醇提取一枝蒿。
2.4.2 提取溶剂加入倍量的考察 称取一枝蒿粗
粉5份,每份50g,分别加6、8、10、12、14倍量95%
94 第1期 杨国萍,等:芩蒿滴鼻剂中一枝蒿抗炎有效成分的提取工艺研究
乙醇,回流提取3次,每次1h,过滤,滤液合并,放冷
至室温,置于2 000mL容量瓶中,用95%乙醇定容
至刻度。分别按评价指标对提取液进行评价,结果
表明,8、10、12倍溶剂加入倍量的综合评分基本相
当(图2A)。
2.4.3 提取时间的考察 称取一枝蒿粗粉5份,每
份50g,分别加8倍量95%乙醇,回流提取3次,每
次按规定时间提取,过滤,滤液合并,放冷至室温,置
于2 000mL量瓶中,用95%乙醇定容至刻度。分
别按评价指标对提取液进行评价,结果表明,提取时
间为1h时,综合评分最高(图2B)。
2.4.4 提取次数的考察 称取一枝蒿粗粉4份,每
份50g,分别加8倍量95%乙醇,回流提取,每次
1h,过滤,滤液合并,放冷至室温,置2 000mL量瓶
中,用95%乙醇定容至刻度。分别按评价指标对提
取液进行评价,结果表明,提取2、3、4次综合评分均
在90分以上(图2C),说明提取2次基本提取完全。
表2 一枝蒿提取物对毛细血管通透的影响
组别 酮酸含量/% 出膏率/% 小鼠数/只 剂量/(mg/kg) 吸收度 抑制率/%
模型组 - - 10 - 0.593±0.098 -
水提物组 0.18  19.53  10  337  0.407±0.109* 31.4
30%乙醇提取物组 0.21  15.21  10  294  0.372±0.092* 37.3
0%乙醇提取物组 0.22  14.64  10  283  0.325±0.114* 45.1
70%乙醇提取物组 0.25  13.72  10  265  0.312±0.105* 47.5
95%乙醇提取物组 0.28  6.55  10  127  0.222±0.082* 62.6
  注 与模型组比较,*P<0.05。
A    B    C
图2 单因素试验中各因素对提取效果的影响
2.5 正交试验 根据单因素试验结果确定因素水
平范围,选用L9(34)正交表,因素水平表见表3。称
取一枝蒿粗粉9份,每份50g,加入95%乙醇,以一
枝蒿酮酸含量(Y1)和出膏率(Y2)的加权综合评分
(Y=Y1×90+Y2×10)为评价指标,按照L9(34)正
交表安排试验,考察乙醇倍量(A)、提取时间(B)、提
取次数(C)3个因素对提取效率的影响。直观分析
结果表明,各因素对试验结果的影响程度分别为 A
>C>B,各因素的最佳水平为A3B1C3,见表4。方
差分析结果表明,各因素对试验结果的影响程度依
次为A>C>B,A、C因素对试验结果明显有影响
(P<0.1),其中 A3 优于 A2 和 A1,C3 优于C2 和
C1;B因素对试验结果无影响(P>0.1),见表5,从节
省时间和成本考虑,选择 B1。最佳提取工艺为
A3B1C3,即10倍量95%乙醇,提取3次,每次0.5h。
表3 因素水平表
水 平
因 素
A/倍 B/h  C/次
1  6  0.5  1
2  8  1  2
3  10  2  3
05 新 疆 医 科 大 学 学 报 第36卷 
表4 正交试验安排及结果
试验号
因 素 及 水 平
A  B  C  D
试 验 结 果
Y1 Y2 综合评分/分
1  6  0.5  1  1  0.17 3.48  57.69
2  6  1  2  2  0.18 5.08  63.51
3  6  2  3  3  0.19 6.64  69.38
4  8  0.5  2  3  0.28 5.45  93.91
5  8  1  3  1  0.27 6.42  92.63
6  8  2  1  2  0.20 4.90  67.30
7  10  0.5  3  2  0.29 6.14  98.86
8  10  1  1  3  0.20 4.59  69.02
9  10  2  2  1  0.29 6.94  99.59
K1 63.53  83.49  64.67  83.30
K2 84.61  75.05  85.67  76.56
K3 89.16  78.76  86.96  77.44
R  25.63  8.43  22.29  6.75
表5 方差分析表
变异来源 SS  V  MS  F  P
A  1122.186  2  561.093  13.904  0.067
B  107.209  2  53.604  1.328  0.429
C  939.351  2  469.676  11.639  0.079
D(误差) 80.709  2  40.354
  注:F1-0.05(2,2)=19.0;F1-0.10(2,2)=9.0
2.6 验证试验 按最佳提取工艺平行操作3次,平
均综合评分为95.87,表明优选出的提取工艺设计
合理,工艺稳定可行,结果见表6。
表6 验证试验结果
试验号 一枝蒿酮酸含量/% 出膏率/% 综合评分/分 平均综合评分/分
1  0.31  6.16  99.55
2  0.28  6.45  92.89  95.87
3  0.29  6.35  95.19
3 讨论
3.1 色谱条件的考察 参考文献[5-7]并结合实
际,本研究比较了甲醇-磷酸、乙腈-磷酸、甲醇-甲酸
系统条件下一枝蒿酮酸的出峰情况,结果采用甲醇
-0.4%磷酸(55∶45)作为流动相时,一枝蒿酮酸的
保留时间适宜,色谱峰的分离度、理论板数及对称性
等色谱参数均符合要求,故最终确定流动相为甲醇
-0.4%磷酸(55∶45)。
3.2 含量测定指标的考察 一枝蒿中含有一枝蒿
酮酸、木犀草素以及紫花牡荆素等抗炎活性成
分[4-7]。本研究依次对一枝蒿酮酸、木犀草素、紫花
牡荆素的含量进行了测定,结果表明,一枝蒿中一枝
蒿酮酸的含量高于其他成分10倍以上,因此选择一
枝蒿酮酸作为一枝蒿提取工艺的考察指标。
3.3 提取温度的考察 本研究分别考察了提取温
度(150、120、100、80℃)对一枝蒿中有效成分一枝蒿
酮酸含量的影响,结果随着提取温度的升高,一枝蒿
酮酸的含量呈下降趋势。当提取温度为100℃和
80℃时,一枝蒿酮酸的含量几乎没有差异,为降低成
本,本试验最终选择提取温度为80℃。
3.4 提取溶剂的考察 为使一枝蒿中抗炎药理活
性成分得到最大保留,本研究采用二甲苯致小鼠耳
肿胀试验和毛细血管通透性试验对不同溶剂提取物
进行抗炎药理活性筛选,结果表明,95%乙醇提取物
的二甲苯致小鼠耳肿胀抑制率和毛细血管通透性抑
制率均高于其它溶剂提取物,故确定以95%乙醇作
为一枝蒿的提取溶剂。
参考文献:
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[收稿日期:2012-09-26]
(本文编辑 施洋)
15 第1期 杨国萍,等:芩蒿滴鼻剂中一枝蒿抗炎有效成分的提取工艺研究