全 文 ：* 国家科技重大专项“重大新药创制”(课题编号:2011ZX09102 － 009 － 07)
＊＊ 通讯作者 Tel:(0991)2828537;E － mail:zhengyi087@ 126． com
HPLC －MS /MS法同时测定新疆一枝蒿药材中 5 个成分的含量*
蔡晓翠1，贺金华1，顾政一1＊＊，张瑞萍2，毛艳1
(1．新疆维吾尔自治区药物研究所，乌鲁木齐 830004;2．天然药物活性物质与功能国家重点实验室，
中国医学科学院北京协和医学院药物研究所，北京 100050)
摘要 目的:建立新疆一枝蒿药材中绿原酸、木犀草素、一枝蒿酮酸、紫花牡荆素及芹菜素 5 个指标成分的含量测定方法，比较
不同产地及不同采收期新疆一枝蒿药材中 5个成分的含量。方法:采用 HPLC －MS/MS法，使用 Agilent C18色谱柱(4. 6 mm × 250
mm，5 μm) ，流动相为甲醇 － 0. 2%甲酸溶液，梯度洗脱，流速 1. 0 mL·min － 1，柱温 30 ℃，进样量 10 μL;质谱采用电喷雾离
子源(ESI源) ，负离子模式检测，扫描方式为多反应监测(MＲM)。结果:绿原酸、木犀草素、一枝蒿酮酸、紫花牡荆素及芹菜
素分别在 52. 4 ～ 1048 μg·mL －1(r = 0. 9996)、2. 965 ～ 118. 6 μg·mL －1(r = 0. 9997)、25 ～ 700 μg·mL －1(r = 0. 9993)、
5. 96 ～ 238. 4 μg·mL －1(r = 0. 9994)、1. 219 ～ 243. 8 μg·mL －1(r = 0. 9992)范围内线性关系良好;平均加样回收率在
97. 6% ～ 100. 9%之间，ＲSD均小于 2. 5%。结论:该方法灵敏、快速、准确，专属性强，可为新疆一枝蒿药材的质量标准研究
提供依据。
关键词:新疆一枝蒿;绿原酸;木犀草素;一枝蒿酮酸;紫花牡荆素;芹菜素;不同产地不同采收期含量测定;高效液相色谱 －串
联质谱
中图分类号:Ｒ917 文献标识码:A 文章编号:0254 － 1793(2013)10 － 1672 － 05
Simultaneous determination of 5 constituents in Artemisia rupestris
L． by HPLC －MS /MS*
CAI Xiao － cui1，HE Jin － hua1，GU Zheng － yi1＊＊，ZHANG Ｒui － ping2，MAO Yan1
(1． Xinjiang Institute of Materia Medica，Urumqi 830004，China;2． State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines，
Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100050，China)
Abstract Objective:To establish a method for simultaneous determination of 5 main bioactive constituents inclu-
ding chlorogenic acid，luteolin，rupestonic acid，casticin and apigenin in Artemisia rupestris L． by HPLC － MS /MS，
and to compare the content differences of Artemisia rupestris L． from different areas and different harvest periods．
Methods:The HPLC separation was performed on an Agilent Cl8 column(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)in a gradient e-
lute mode with methanol and water(containing 0. 2% formic acid)as the mobile phase at a flow rate of 1. 0 mL·
min －1 ． MS detection was performed with multiple reaction monitoring(MＲM)mode using negative electrospray ioni-
zation． Ｒesults:The linearity was achieved in the range of 52. 4 － 1048 μg·mL －1(r = 0. 9996)for chlorogenic
acid，2. 965 － 118. 6 μg·mL －1(r = 0. 9997)for luteolin，25 － 700 μg·mL －1(r = 0. 9993)for rupestonic acid，
5. 96 － 238. 4 μg·mL －1(r = 0. 9994)for casticin，and 1. 219 － 243. 8 μg·mL －1(r = 0. 9992)for apigenin． The
recoveries were 97. 6% －100. 9% with ＲSD less than 2. 5% ． Conclusion:The method is sensitive，rapid，accurate
and specific and can be used for the quality control of Artemisia rupestris L．
Key words:Artemisia rupestris L．;chlorogenic acid;luteolin;rupestonic acid;casticin;apigenin;content determina-
tion of different rigions and different hariest periods;HPLC － MS /MS
新疆一枝蒿(Artemisia rupestris L．)为菊科蒿属 植物，主要分布在新疆海拔 1600 ～ 4500 m森林草原
—2761— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(10)
DOI:10.16155/j.0254-1793.2013.10.007
带;哈萨克斯坦、蒙古、俄罗斯、欧洲各国亦有分布，
在《中华人民共和国卫生部药品质量标准》维吾尔
药分册和《维吾尔药志》(上册)［1］有收载。新疆一
枝蒿为新疆地产药材，维吾尔药名“一孜乎艾曼
尼”，具有清热退烧、消炎止痛、凉血解毒、健胃消
食、活血化瘀等功能，主治热性或胆液质性或血液质
性疾病，如热性感冒、发热、头疼、胃疼、腹胀、肝炎、
荨麻疹、毒虫咬伤等，对感冒和肝炎的疗效尤为显
著［2］。文献报道新疆一枝蒿全草含有黄酮类、倍半
萜酮酸类、多糖、氨基酸、挥发油等多种成分［3 － 5］，国
内学者从中分离得到一枝蒿酸、一枝蒿酮酸等萜类
化合物。目前多采用 HPLC法检测新疆一枝蒿中单
一成分或多个成分的含量［6 － 8］，为了更全面反映其
物质基础，本研究建立同时测定绿原酸、木犀草素、
一枝蒿酮酸、紫花牡荆素及芹菜素 5 个指标成分的
含量测定方法，分别考察不同产地、不同采收期新疆
一枝蒿药材中 5 个成分的含量，比较人工种植与野
生品种的差异，为新疆一枝蒿的质量评价及人工种
植研究提供分析依据。
1 仪器和实验材料
1. 1 仪器 QTＲAP 型四极杆 －线性离子阱串联质
谱仪(Applied Biosystems /MDS SCIEX公司) ;Agilent
1260 系列高效液相色谱仪(Agilent Technologies 公
司) ;BP211D 电子天平(Sartorius，d = 0. 01 mg) ;
AS20500BDT型超声清洗仪(天津奥特赛恩斯公
司) ;Cosmosil C18色谱柱(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)。
1. 2 对照品 一枝蒿酮酸(中国科学院新疆理化
研究所提供，纯度大于 99%) ;绿原酸(批号 110753
－20041)、木犀草素(批号 11720 － 201106)、紫花牡
荆素(批号 111554 － 200503)、芹菜素(批号 111901
－ 201102)购于中国食品药品检定研究院。
1. 3 药材 不同产地、不同采收期新疆一枝蒿均
采自新疆，经新疆药物研究所贺金华副研究员鉴
定为菊科蒿属植物新疆一枝蒿(Artemisia rupestris
L．)。
1. 4 试剂 在本研究中，所用试剂均为药典［7］
规定试剂;配制方法均采用 2010 年版中国药典
附录规定的方法;甲酸和甲醇为色谱纯;水为纯
化水。
2 方法与结果［9 －14］
2. 1 色谱条件 色谱柱:Cosmosil waters － C18
(250 mm × 4. 6 mm，5 μm) ;流动相:甲醇(A)－
0. 2%甲酸水溶液(B) ;梯度洗脱:0 ～ 5 min(92%
B→70% B) ，5 ～ 25 min(70% B→40% B) ，25 ～ 40
min，(40%B→20%B) ;40 ～ 45 min(20% B) ;流速:
1. 0 mL·min －1，柱后分流 3∶ 1;柱温:30 ℃;进样量:
10 μL。
2. 2 质谱条件 离子源为 ESI 源;负离子模式检
测;扫描方式为多反应监测;电喷雾电压:－ 4. 5 kV;
离子源温度:400. 00 ℃;GS1:60. 00;GS2:40. 00;扫
描方式:多反应监测(MＲM) ;MＲM 离子对:绿原酸
m/z 353. 0→161. 0、木犀草素 m/z 285. 0→133. 0、一
枝蒿酮酸 m/z 247. 2→ 203. 2、紫花牡荆素 m/z
373. 2→358. 2、芹菜素 m/z 269. 0→ 117. 0。
2. 3 溶液的制备
2. 3. 1 对照品储备液 精密称取绿原酸、木犀草
素、一枝蒿酮酸、紫花牡荆素和芹菜素的对照品适
量，加甲醇分别制成 2. 62、0. 593、5. 00、1. 192、1. 219
mg·mL －1的对照品储备液，备用。
2. 3. 2 供试品溶液 取新疆一枝蒿药材粉末约
2. 5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入 50%
甲醇溶液 50 mL，称重，超声(功率 250 W，频率
40 kHz)处理 45 min，放冷，称重，用 50%甲醇溶液
补足失重，摇匀，2000 r·min －1离心 5 min，取上清
液，即得。
2. 4 专属性试验 分别取上述对照品溶液、供试品
溶液与溶剂空白，进行 LC － MS /MS 测定，总离子流
色谱图见图 1，对照品的出峰位置未见干扰峰，专属
性良好。
2. 5 检测限(LOD)和定量限(LOQ) 分别取上述
对照品储备液逐级稀释，进行 HPLC － MS /MS 分析，
以测得信噪比 S /N≥3 时的量为检测限(LOD) ，信
噪比 S /N≥10 时的量为定量限(LOQ)。结果表明，
绿原酸、木犀草素、一枝蒿酮酸、紫花牡荆素及芹菜
素检测限分别为 0. 519、0. 311、0. 300、0. 0403、
0. 0185 μg· mL －1，定量限分别为 1. 73、1. 037、
1. 000、0. 1344、0. 0615 μg·mL －1。
2. 6 线性关系考察 精密吸取绿原酸、一枝蒿酮
酸、木犀草素、紫花牡荆素和芹菜素对照品储备液
逐级稀释，分别制成一系列不同浓度的对照品混
合溶液，分别进样，记录峰面积。以对照品浓度 X
为横坐标，峰面积 Y 为纵坐标进行线性回归，绘制
标准曲线，结果表明 5 个成分线性关系良好，见
表 1。
—3761—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(10)
图 1 混合对照品(A)、供试品溶液(B)及空白溶剂(C)的提取离子流色谱图
Fig 1 XIC chromatograms of mixed reference substances(A) ，sample(B)and blank solvent(C)
1．绿原酸(chlorogenic acid) 2．木犀草素(luteolin) 3．一枝蒿酮酸(rupestonic acid) 4．紫花牡荆素(casticin) 5．芹菜素(apigenin )
表 1 5 种指标成分的线性关系
Tab 1 The linearity correlations of 5 constituents
成分
(constituent)
回归方程
(regression equation)
线性范围
(linear range)/μg·mL －1
r
绿原酸(chlorogenic acid) Y =5. 59 × 106X －2. 02 × 105 52. 4 － 1048 0. 9991
木犀草素(luteolin) Y =1. 31 × 104X +7. 14 × 105 2. 965 － 118. 6 0. 9998
一枝蒿酮酸(rupestonic acid) Y =1. 06 × 107X +1. 5 × 106 25 － 700 0. 9996
紫花牡荆素(casticin) Y =2. 23 × 103X +2. 08 × 105 5. 96 － 238. 4 0. 9994
芹菜素(apigenin ) Y =1. 26 × 104X +9. 23 × 105 1. 219 － 243. 8 0. 9995
2. 7 精密度试验 精密吸取“2. 3. 1”项下的对照
品储备，在上述色谱质谱条件下，连续进样 6 次，记
录峰面积，结果绿原酸、木犀草素、一枝蒿酮酸、紫花
牡荆素、芹菜素峰面积的 ＲSD分别为 1. 3%、2. 4%、
1. 7%、1. 7%、2. 0%，表明仪器精密度良好。
2. 8 重复性试验 取同一批新疆一枝蒿药材(编号
S4)粉末，按“2. 3. 2”项下方法制得 6 份供试品溶液，
进样分析，结果绿原酸、木犀草素、一枝蒿酮酸、紫花
牡荆素、芹菜素的平均含量分别为 4. 3882、0. 4805、
8. 3197、0. 9928、0. 1304 mg·g －1，ＲSD 分别为 1. 7%、
2. 1%、2. 0%、2. 2%、2. 1%。表明重复性良好。
2. 9 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在 0、
2、4、8、12、24 h进样，以峰面积计算，结果绿原酸、
木犀草素、一枝蒿酮酸、紫花牡荆素、芹菜素的
ＲSD分别为 1. 3%、1. 1%、1. 9%、1. 9%、1. 3%，表
明供试品溶液在 24 h 内稳定;将同一供试品溶液
置于 4 ℃冰箱中，每天进样 1 次，连续测定 5 d，以
峰面积计算，结果绿原酸、木犀草素、一枝蒿酮酸、
紫花牡荆素、芹菜素的 ＲSD 分别为 1. 3%、1. 1%、
1. 1%、1. 0%、1. 8%。
2. 10 加样回收率试验 取已知含量的新疆一枝蒿
药材粉末(编号 S4)约 1. 25 g，共 9 份，按低、中、高
质量浓度分别精密加入混合对照品溶液适量，按
“2. 3. 2”项下方法制备每一质量浓度的溶液各 3
—4761— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(10)
份，分别进样分析，记录峰面积，计算加样回收率，结
果绿原酸、木犀草素、一枝蒿酮酸、紫花牡荆素、芹菜
素的回收率 (n = 6)分别为 100. 1%、99. 4%、
99. 5%、100. 9%、100. 1%，ＲSD 分 别 为 2. 0%、
1. 6%、1. 3%、1. 3%、2. 0%。
2. 11 不同样品含量测定 分别取不同来源的药材
粉末，每份样品各取 2 份，按“2. 3. 2”项下方法制备
供试品溶液，依法测定，计算含量，结果见表 2。
表 2 不同来源药材的 5 种指标成分的含量测定结果
Tab 2 Determination results of the 5 constituents from different sources
编号
(No．)
来源
(source)
成分
(constituent)
含量
(content)/mg·g － 1
S1 人工种植蕾前
(before artificial cultivation of bud)
绿原酸(chlorogenic acid) 3. 60
木犀草素(luteolin) 0. 31
一枝蒿酮酸(rupestonic acid) 8. 79
紫花牡荆素(casticin) 0. 73
芹菜素(apigenin) 1. 53
S2 新疆伊犁
(Yili，Xinjiang)
绿原酸(chlorogenic acid) 4. 37
木犀草素(luteolin) 0. 15
一枝蒿酮酸(rupestonic acid) 6. 13
紫花牡荆素(casticin) 0. 96
芹菜素(apigenin) 1. 46
S3 新疆阜康
(Fukang，Xinjiang)
绿原酸(chlorogenic acid) 4. 08
木犀草素(luteolin) 0. 29
一枝蒿酮酸(rupestonic acid) 5. 55
紫花牡荆素(casticin) 0. 95
芹菜素(apigenin) 1. 67
S4 人工种植盛花期
(7，May)
(full － blossom stage of artificial cultivation)
绿原酸(chlorogenic acid) 4. 38
木犀草素(luteolin) 0. 36
一枝蒿酮酸(rupestonic acid) 6. 32
紫花牡荆素(casticin) 1. 21
芹菜素(apigenin) 1. 75
S5 人工种植盛花期
(22，May)
(full － blossom stage of artificial cultivation)
绿原酸(chlorogenic acid) 5. 74
木犀草素(luteolin) 0. 31
一枝蒿酮酸(rupestonic acid) 7. 76
紫花牡荆素(casticin) 0. 92
芹菜素(apigenin) 1. 57
S6 人工种植花前期
(pre － flowering stage of artificial cultivation)
绿原酸(chlorogenic acid) 5. 76
木犀草素(luteolin) 0. 56
一枝蒿酮酸(rupestonic acid) 4. 07
紫花牡荆素(casticin) 0. 92
芹菜素(apigenin) 1. 61
S7 人工种植花衰期
(decaying stage of artificial cultivation)
绿原酸(chlorogenic acid) 2. 32
木犀草素(luteolin) 0. 25
一枝蒿酮酸(rupestonic acid) 2. 01
紫花牡荆素(casticin) 0. 37
芹菜素(apigenin) 1. 50
S8 新疆博湖
(Bohu，Xinjiang)
绿原酸(chlorogenic acid) 1. 17
木犀草素(luteolin) 0. 14
一枝蒿酮酸(rupestonic acid) 0. 72
紫花牡荆素(casticin) 0. 19
芹菜素(apigenin) 1. 49
—5761—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(10)
3 讨论
3. 1 提取条件的选择 本研究分别对样品的提取
溶剂、提取方式、提取时间进行了考察。①超声提取
和加热回流提取 2 种方法，结果超声提取方法的样
品，色谱峰的个数多于回流提取法，且峰面积较大;
②分别考察了甲醇、50%甲醇、80%甲醇、乙醇等不
同溶剂提取效果，结果 50%甲醇提取效率最高;③
分别考察了超声提取 15、30、45、60 min，结果超声提
取 45 min时提取效果最佳，峰面积最大。最终优化
的提取方法为 50%甲醇超声提取 45 min。
3. 2 流动相的选择 由于 5 个指标成分极性差别
较大，采用等度洗脱很难同时测定，分离度不佳，故
采用梯度洗脱进行色谱条件的筛选，可使所测成分
色谱峰得到良好的分离，同时缩短分析时间。流动
相分别考察了 0. 2% 甲酸、0. 02% 甲酸，结果采用
0. 2%的甲酸时待测物的分离度优于 0. 02%甲酸。
3. 3 质谱定性分析的意义 采用保留时间和二级
质谱同时对 5 个指标成分进行定性鉴别，可以避免
采用传统紫外检测保留时间定性的假阳性结果，保
证进一步定量测定结果的准确性及一枝蒿药材中成
分确定的准确性。
3. 4 质谱离子模式的选择 本实验选取的 5 个指
标成分，分别比较正离子模式和负离子模式的响应，
结果表明负离子模式响应较高，故采用负离子模式
进行检测。
3. 5 不同产地及不同采摘时期的含量结果讨论
不同产地的新疆一枝蒿药材中，木犀草素、一枝蒿酮
酸、芹菜素含量差别较大，可能与气候、光照时间、海
拔高度等生长环境有关;绿原酸、紫花牡荆素的含量
差别不大。人工种植的不同采摘时间的新疆一枝蒿
药材中，绿原酸、一枝蒿酮酸、紫花牡荆素的含量开
花期含量最高;木犀草素的含量花衰期最低;芹菜素
的含量花前含量最低结果表明开花期采摘的药材 5
个指标成分含量最高，优于其余采摘时间，故可用于
指导人工种植新疆一枝蒿药材采摘时期的确定。人
工种植药材与野生药材 5个成分的含量差异较小，对
于指导人工种植新疆一枝蒿药材有重要意义，为人工
种植新疆一枝蒿药材品种筛选提供了分析依据。
参考文献
1 LIU Yong － ming(刘勇明) ，LIU Wei － xin(刘伟新) ，YI Wu － ti·
YiKeMu(伊吾提·依克木) ，et al． Ｒecords of Uygur Materia Medi-
ca(维吾尔药志) ［M］． Urumqi(乌鲁木齐) :Xinjiang Science
Technology and Hygiene Publishing House(新疆科技卫生出版
社) ，1999. 9
2 TANG Xiao － yi(唐晓义) ，WANG Xiao － jun(王晓军) ，KANG Xi
－ liang(康喜亮) ，et al． Tissue culture and rapid propagation of Ar-
temisia rupestris L．(新疆一枝蒿的组织培养与快速繁殖) ［J］．
Plant Physiol(植物生理学通讯) ，2008，44(3) :523
3 SONG Wei － xia(宋卫霞) ，JI Teng － fei(吉腾飞) ，SI Yi － kang
(司伊康) ，et al． Studies on the chemical constituents of Artemisia
rupestris L．(新疆一枝蒿化学成分的研究) ［J］． China J Chin Ma-
ter Med(中国中药杂志) ，2006，31(21) :1790
4 Ｒahima ABDULLA(热依木古丽·阿布都拉) ，ZHONG Jie(仲
婕) ，Zulheyre EZIZ，(佐艾热·艾孜江) ，et al． Quality control of
Artemisia rupestris L． from Xinjiang Province(新疆一枝蒿的质量标
准研究) ［J］． Her Med(医药导报) ，2011，30(9) :1200
5 HE Fei(贺飞) ，HOU Gui － ping(侯桂萍) ，ZHONG Jie(仲婕) ，et
al． Fingerprints of Artemisia rupestris L． from Xinjiang by HPLC(新
疆一枝蒿药材高效液相色谱指纹图谱研究) ［J］． Her Med(医药
导报) ，2010，29(7) :854
6 MA Cheng(马成) ，YANG Min(杨敏) ，ZHANG Xuan(张煊) ，et
al． Determination of rupestonic acid in Artemisia rupestris L． growing
in Xinjiang by HPLC(高效液相色谱法测定新疆一枝蒿中一枝蒿
酮酸的含量) ［J］． Lishizhen Med Mater Med Ｒes(时珍国医国药) ，
2008，19(4) :991
7 YANG Jian － bo(杨建波) ，SU Ya － lun(苏亚伦) ，JI Teng － fei
(吉腾飞) ，et al． HPLC determination of rupestonic acid in Artemisia
rupestris L．(HPLC法测定新疆一枝蒿全草中一枝蒿酮酸的含
量) ［J］． Chin J Pharm Anal(药物分析杂志) ，2010，30(1) :103
8 ZHANG Jie(张洁) ，GU Zheng － yi(顾政一) ，HE Cheng － hui(何
承辉)． Determination of luteolin and rupestonic acid in Artemisia
rupestris by high performance liquid chromatography(HPLC 法同时
测定新疆一枝蒿中木犀草素和一枝蒿酮酸的含量) ［J］． China J
Exp Tradit Med Form(中国实验方剂学杂志) ，2009，15(4) :1
10 XIE Jun － bo(谢军波) ，ZHANG Yan － qing(张彦青) ，WU Guo －
jiao(吴国娇) ，et al． Determination of luteolin in Herba Lami －
ophlomis by liquid chromatography tandem mass spectrometry meth-
od(LC － MS /MS 法测定独一味中木犀草素) ［J］． China J Exp
Tradit Med Form(中国实验方剂学杂志) ，2010，16(7) :64
11 HUANG Quan － fang(黄权芳) ，WU Xiao － yan(伍小燕) ，HUANG
Min(黄敏) ，et al． Determination of luteolin in Zhuangyao Qingre
granula by HPLC(HPLC法测定状药清热颗粒中木犀草素的含
量) ［J］． Tradit Chin Drug Ｒes Pharmacol(中药新药与临床药
理) ，2010，21(3) :285
12 LUO Mi － na，ZHAO Liang，LIU Xi，et al． HPLC determination of
quercetin，luteolin and apigenin in Lamiophlomis rotate(Benth．)Ku-
do and its capsule(藏药独一味中槲皮素、木犀草素和芹菜素的
HPLC测定) ［J］． Chin J Pharm Anal(药物分析杂志) ，2006，26
(12) :1773
13 WANG Shuai(王帅) ，DI Duo － long(邸多隆) ，JIANG Sheng －
xiang(蒋生祥)． Determination of luteolin content in Lamiophlomis
rotata capsules by HPLC(HPLC法测定独一味胶囊中木犀草素的
含量) ［J］． Chin Anal Lab(分析试验室) ，2004，23［Suppl(增
刊) ］:87
14 ChP(中国药典) ［S］. 2010． VolⅠ(一部) :205
(本文于 2012 年 12 月 3 日收到)
—6761— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2013，33(10)