全 文 ：2010 年
第 30 卷
12 月
第 12 期
河 南 中 医
HENAN TRADITIONAL CHINESE MEDICINE
December 2010
Vol． 30 No． 12
三七花提取物对 ET － 1 诱导的人主动脉血管平滑肌
细胞增殖及凋亡的影响
苑素云，周 端，王佑华，曹 敏
(上海中医药大学附属龙华医院，上海 200030)
摘要:目的:观察应用三七花提取物(三七花总皂苷)干预 ET － 1 诱导的 HASMC细胞增殖及凋亡的影响。方法:应用四唑盐(MTT)比色法检测
细胞活力情况。TUNEL染色法观察凋亡细胞形态学变化，流式细胞仪检测细胞凋亡率变化。结果:三七花总皂苷能有效抑制 HASMC 活性，随
剂量的增加，作用越明显，具有剂量依赖性。随着作用时间的延长，呈现一定的时效依赖性。观察到典型的核碎裂现象，且凝胶电泳图谱呈梯
状，能有效促进异常增殖血管平滑肌细胞的凋亡。结论:三七花总皂苷能改善血管平滑肌细胞异常增殖，能有效增加血管平滑肌细胞的凋亡。
关键词:三七花总皂苷;HASMC细胞;血管平滑肌;细胞凋亡;细胞增殖;ET － 1
中图分类号:R285． 6 文献标识码:A 文章编号:1003 － 5028(2010)12 － 1172 － 04
血管重构(vascular remodeling )是高血压病理改变的
重要部分和高血压维持、恶化的结构基础，是高血压靶器官
损害中的一种机制。目前认为其形成机理主要是:血流动力
学的刺激、血管活性物质的作用以及细胞外基质的调节引起
血管平滑肌细胞的增殖、凋亡和重构。其中心环节是 VSMC
的增殖、凋亡和重构。本文应用 ET － 1 诱导人主动脉血管平
滑肌细胞异常增殖，观察三七花总皂苷对 HASMC 增殖及凋
亡的影响。
1 材料与方法
1． 1 药品、试剂与仪器 三七花总皂苷由上海中医药大学
中药学院分离提取，呈黑褐色。以高效液相色谱分析法测得
含量为 95%以上。临用前用双蒸水配制，0． 22 μm 滤膜过
滤。硝苯地平片由上海长征制药厂提供，5%乙醇、超声波
助溶，0． 22 μm滤膜过滤，4℃保存。小牛血清白蛋白(BSA)
购自 Sigma (MO，USA) ，DMEM(低糖)购自 Gibco(NY，
USA) ，胰蛋白酶 AMRESCO，DMSO 购自中国医药集团上海
化学试剂公司，分析纯。其它试剂均为市售分析纯产品。
MTT(Sigma，北京鼎国生物技术发展中心分装) ，PBS 溶解成
5 mg /mL，0． 22 μm 滤膜过滤，4℃保存，两周内有效。80 － 2
离心机(上海手术器械厂) ，酶标仪(DG3022，四军大、国营华
东电子管厂联合研制) ，TUNEL 和牛血清白蛋白(BSA)购自
Sigma(MO，USA) ，RNase A 购自华舜生物工程有限公司，
DMEM(低糖)Gibco(NY，USA) ，胰蛋白酶 AMRESCO。其他
试剂均为市售分析纯产品。
收稿日期:2010 － 11 － 02
基金项目:上海市经委立项课题(编号:沪创新 J － 58)
作者简介:苑素云(1971 －) ，女，河北邯郸人，博士学位，副主任医师。
1． 2 人原代主动脉血管平滑肌细胞培养 人原代主动脉血
管平滑肌细胞株(HASMC)购于美国 CASCADE 公司。用含
10%小牛血清的 DMEM 在 37℃，5% CO2 湿热培养箱中培
养。
1． 3 标准曲线的制备 培养 2 d的单层 HASMC经 0． 125%
胰蛋白酶消化液消化后，种在 96 孔板上，密度分别为 1 ×
104，2 × 104，3 × 104，4 × 104，5 × 104 cells /well，n = 4。12 h
后，用 D － Hank’s液漂洗 2 次，孵育在含 1% BSA 的 100 μL
Krebs液中，再加入 5 mg /mL 的 MTT 20 μL，作用 1 h。吸弃
上清，加 100 μL DMSO，手摇振荡 10 min，540 nm 酶标仪测
定［1］。
1． 4 细胞分组及药物干预 HASMC 增殖 正常对照组
(N) :加等量 0． 9% NS。ET － 1 模型组:ET － 1 浓度为 2*
10 －8 mmol /L。硝苯地平 + ET － 1 组:硝苯地平浓度为:
50 μg /mL。三七花总皂苷组 + ET － 1 组:细胞增殖活力实验
中，三七花总皂苷浓度分别为 50 μg /mL、100 μg /mL、
150 μg /mL、200 μg /mL、250 μg /mL、300 μg /mL、350 μg /mL、
400 μg /mL、450 μg /mL、500 μg /mL、550 μg /mL、600 μg /mL。
细胞凋亡实验中，三七花总皂苷浓度分别为 200 μg /mL、
400 μg /mL、600 μg /mL。
1． 5 细胞增殖活力影响实验方法 长满的单层 HASMC 用
0． 125%胰蛋白酶消化，种在 96 孔板(5 × 104 cells /well) ，随
机分为 4 组:正常对照组(N) ，ET － 1 模型组，硝苯地平 + ET
－1 组和三七花总皂苷各浓度组 + ET － 1 组，n = 3。12 h后，
用 D － Hanks 液(NaCl 8． 00 g /L，KCl 0． 40 g /L，Na2HPO4·
H2O 0． 06 g /L，KH2HPO4 0． 06 g /L，NaHCO3 0． 35 g /L，Phenol
red 0． 02 g /L)漂洗 2 次，孵育在含 1%BSA的 90 μL的 Krebs
液(NaCl 120 mM，KCl 5． 6 mM，MgSO4 1． 2 mM，NaH2PO4
1． 2 mM，NaHCO3 25 mM，glucose 10 mM，CaCl2 2． 5 mM)中。
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DOI:10.16367/j.issn.1003-5028.2010.12.047
第 30 卷 第 12 期 苑素云，等:三七花提取物对 ET －1诱导的人主动脉血管平滑肌细胞增殖及凋亡的影响 Vol． 30 No． 12
各组在正常条件下培养 24 h 后，按以上浓度加药，各组终体
积为 100 μL，不足者以含 1% BSA 的 Krebs 液补足。放回培
养箱，培养 48 h、96 h。在培养 48 h、96 h 后，各组加入
5 mg /mL的 MTT 20 μL，作用 1 h。吸弃上清，加 100 μL
DMSO，手摇振荡 10 min，540 nm酶标仪测定。
1． 6 细胞凋亡及细胞周期的影响实验方法 培养 2 d 的单
层 HASMC经 0． 125%胰蛋白酶消化液消化后，种在 12 孔板
(5 × 105 cells /well)上。随机分为以上各组。细胞培养 12 h
后，D － Hanks 液(NaCl 8． 00 g /L，KCl 0． 40 g /L，Na2HPO4·
H2O 0． 06 g /L，KH2HPO4 0． 06 g /L，NaHCO3 0． 35 g /L，Phenol
red 0． 02 g /L)漂洗 2 次后，孵育在 0． 5 mL 含 1% BSA 的
Krebs 液(NaCl 120 mM，KCl 5． 6 mM，MgSO4 1． 2 mM，
NaH2PO4 1． 2 mM，NaHCO3 25 mM，glucose 10 mM，CaCl2
2． 5 mM)中。各组在正常条件下培养 24 h 后，对照组不加
药，其余各组按以上浓度加药，各组终体积为 100 μL，不足者
以含 1%BSA的 Krebs液补足。放回培养箱，培养 48 h。
凋亡细胞形态学观察(TUNEL 染色法) :将三组种植于
盖玻片上，分别用 Hochest33258 标记，室温下用 4%多聚甲醛
固定 1 h;PBS洗 30 min;0℃ 0． 2% Triton x － 100 处理 2 min;
PBS洗两次共 10 min;加 50 μL TUNEL 混合物于切片上，
37℃湿盒孵育 60 min;PBS洗 2 次;于荧光显微镜下观察、计
数、照相。对照组选择转染空载体的细胞。
DNA LADDER:培养 48 h后收集细胞，加 0． 5 mL细胞裂
解液，混悬，37℃，水浴 12 － 16 h。加等体积(0． 5 mL)平衡
酚，上下颠倒混匀，离心 3 400 g，常温(16℃) ，5 min。200 μL
加样器取上清约 400 μL，加等体积酚:氯仿:异戊醇(25∶ 24
∶ 1) ，上下颠倒混匀，离心 3 400 g，常温(16℃) ，5 min，取上
清约 400 μL，加冷 1 mL － 20℃无水乙醇沉淀 DNA，加 3 M
NaCl 100 μL(终浓度 0． 2 M) ，－ 20℃，30 min。离心
13 640 g，30 min，4℃。去上清，加 70%冷 4℃乙醇 1 mL洗一
次，立即离心 13 700 g，30 min，4℃。去上清，吸去管底液体，
挥干。加 RNase A 20 μg /mL(TE 50 μL，0． 5 mg /mL RNase A
2 μL)37℃，1 h。取 10 μL，加上样缓冲液 2 μL，1%琼脂糖凝
胶电泳，100 V 跑出孔后改为 40 V，2 h，凝胶图象分析系统
(FR － 980)拍照。
流式细胞仪检测:各组培养 48 h后收集细胞，PBS洗 2次，
70%冷乙醇过夜固定，PBS 洗 1 次，加 0． 5 mL PBS 含 PI
50 μg /mL、RNase A 20 μg /mL，混悬，37℃避光孵育30 min，上机。
启动 CELLQuest软件，以正常组细胞调 FL2，使 G1 期在
200 道左右，保存条件后，收取其它样品。
分析凋亡时，以 FL2 － A 直方图中小于 200 道的为凋亡
细胞，标记 Marker，得到凋亡百分比。分析细胞周期时，启动
MODFIT LT FOR Mac 3． 0 软件，MOD 中去 Debris 和 Aggre-
gate，按 FIT得到细胞周期分析结果。
1． 7 统计学分析 所有数据均以 珋x ± s 表示。用统计软件
SPSS 10． 0 中的 One － Way ANOVA 进行统计分析，P ＜ 0． 05
表示有统计意义。
2 结果
2． 1 MTT标准曲线 见图 1。
图 1 MTT标准曲线(n =4)
从标准曲线上可看出，在 10000 － 50000 cells /well范围，
细胞数与吸光度 A值直线关系良好。
2． 2 三七花总皂苷各剂量组细胞培养 48 h后细胞活性的比
较 见图 2。
图 2 各剂量组细胞培养 48 h后细胞活性的比较
2． 3 三七花总皂苷各剂量组细胞培养 96 h后细胞活性的比
较 见图 3。
图 3 各剂量组细胞培养 96 h后细胞活性的比较
2． 4 各组细胞培养 48 h细胞活性的比较 见图 4。
由上图表中可见:ET － 1 造模组细胞活性明显高于正常
组，表明 ET － 1 诱导 HASMC 异常增殖造模成功。硝苯地平
等显著抑制 HASMC 细胞活性。三七花总皂苷从低浓度
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图 4 各组细胞培养 48 h细胞活性的比较
注:1．空白组;2． ET － 1 组;3． 硝苯地平组;4． 三七
花总 皂 苷 50 μg /mL，依 次 类 推，剂 量 每 次 增 加
50 μg /mL。
50 μg /mL组即开始抑制 HASMC 活性，随剂量的增加，作用
越明显，具有剂量依赖性。48 h 与 96 h 各组比较，随着作用
时间的延长，抑制增殖的作用越明显，呈现一定的时效依赖
性。
2． 5 凋亡细胞形态学观察 TUNEL染色后荧光显微镜下观
察，发现三七花总皂苷 200 μg /mL、400 μg /mL、600 μg /mL与
硝苯地平组(50 μg /mL)有较多的细胞出现凋亡现象。其
中，三七花总皂苷 600 μg /mL组细胞凋亡现象最为突出。见
图 5。
图 5 各组细胞凋亡形态学观察
2． 6 DNA LADDER 各组 HASMC 培养 48 h 后显微镜下
见:三七花总皂苷 600 μg /mL 组细胞绝大部分呈悬浮状，形
态与正常细胞完全不同。DNA电泳结果显示:具有典型的细
胞凋亡特征，呈现 ladder 状。其余各组未见典型的 ladder
状。培养 72 h后 DNA电泳结果显示:硝苯地平与三七花总
皂苷 200 μg /mL均呈现出 ladder条带。见图 6、图 7。
表 1 ET －1 诱导 HASMC增殖各组细胞凋亡率的变化(n = 4)
组别 凋亡率(%)
N 2． 44 1． 03
ET － 1 组 2． 83 1． 30
硝苯地平组 4． 88 1． 36*
三七花总皂苷 600 μg /mL 14． 57 1． 61＊＊##
400 μg /mL 6． 67 1． 54＊＊#
200 μg /mL 4． 75 1． 11*
注:与 ET － 1 造模组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01;与硝苯地
平组比较，#P ＜ 0． 05，##P ＜ 0． 01。
图 6 各组细胞 DNA电泳图
注:A －空白组;B － ET － 1 组;C －硝苯地平组;D －
三七花总皂苷 200 μg /mL 组。E － 三七花总皂苷
400 μg /mL组。F －三七花总皂苷 600 μg /mL组。
图 7 培养 72 h后各组的 DNA电泳图
注:A －空白组;C － ET － 1 组;B －硝苯地平组;D －
三七花总皂苷 200 μg /mL组。
ET － 1 诱导 HASMC增殖 48 h，与对照组比较凋亡率无
明显增加。加入相应药物后，硝苯地平、三七花总皂苷
600 μg /mL、400 μg /mL、200 μg /mL 均能保护细胞，促进凋
亡。其中 600 μg /mL、400 μg /mL组作用优于硝苯地平组。
表 2 ET －1 诱导 HASMC增殖各组细胞周期的变化(n = 4)
组别 G1% G2% S%
N 53． 49 2． 10 6． 18 1． 62 40． 33 3． 69
ET － 1 组 51． 70 0． 92 7． 65 4． 73 40． 65 3． 88
硝苯地平组 50． 44 1． 32 7． 09 4． 02 42． 47 3． 09
600 mg /L 49． 88 1． 87 6． 85 4． 80 43． 27 3． 61
400 mg /L 50． 56 1． 33 6． 26 4． 20 43． 18 3． 20
200 mg /L 52． 75 0． 68 6． 26 4． 31 40． 77 4． 09
注:与 ET － 1 造模组比较，* P ＜ 0． 05，＊＊P ＜ 0． 01。
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ET － 1 诱导 HASMC增殖 48 h 及各组药物应用后，与正
常 HASMC的细胞周期相比似无明显差别。G1 期是分裂间
期的前期。这个时期将合成 RNA 和蛋白质，是 DNA 合成的
准备时期。G1 期的减少引起细胞功能失常，衰老，功能丧
失，以致于细胞消失和死亡［2］。但用药各组与损伤对照组比
较无显著性差异。
3 讨论
高血压血管重构是近年来高血压研究的热点之一［1］。
它既是高血压所造成的病理变化，又是高血压持续存在的重
要原因，还是高血压相关疾病的危险因素。血管重构的过程
涉及几个细胞过程的变化，如细胞生长、细胞死亡、细胞增
殖、细胞外基质产生或降解。目前研究证实 ET － 1、AngⅡ、
PDGF、b － FGF、a － FGF 和 TGF － β 等细胞生长因子都有激
活 VSMC增殖的作用［2］，可使 c － myb、c － myc、c － fos、c － jun
等原癌基因显著表达，从而调控 VSMC增殖和迁移［3］。最近
研究表明，细胞凋亡发生于血管重构过程中［4］。在重构血管
的中层 SMC中，发现凋亡刺激基因 p53 的低表达和凋亡抑制
基因 bcl － 2 的高表达，提示细胞凋亡可能在血管重构中起一
定作用。
高血压血管重构属于中医血瘀证的一种表现形式。《说
文解字》云:“瘀，积血也。”现代医学工作者从血液流变学、
血管内皮细胞功能、血液有形成份的改变等多个角度进行研
究［5］，认为血液的高凝状态是血瘀证发生的重要环节。但血
瘀证不等同于血液流变学异常。陈可冀等［6］认为血瘀应分
“有形之瘀”和“无形之瘀”。“有形之瘀”包括血栓、红肿、结
块、皮肤瘀斑、结缔组织异常增生、动脉粥样硬化等，“无形之
瘀”包括血液流变学改变、病灶组织液增多所致的炎症等。
余林中等［7］提出“宏观血瘀”和“微观血瘀”的概念，延伸了
血瘀的内涵。早在叶天士时期就提出“病久入络”、“久病血
瘀”的理论。《灵枢·脉度》:“经脉为里，支而横者为络，络
之别者为孙”。“脉道以通，血气乃行”，脉道通利是血液运
行的重要条件，脉的功能或本身受损必然与血瘀证的发生有
密切关系。中医学的脉与现代医学的血管具有相通性。做
为血管重构核心内容的血管平滑肌细胞增殖，与血瘀证的发
生有密切关系。近年来，探讨活血化瘀类中药对血管重构、
血管平滑肌细胞增殖的影响及其作用机制的研究进行的较
为深入。
三七花为传统名贵中药五加科植物人参三七的花蕾。
其作为药物始载于《云南中草药选》:“甘凉。清热平肝，降
压。治疗高血压，头昏，目眩，耳鸣，急性咽喉炎。”《中华本
草》:“本品又名田七花。于 6 － 8 月开花时采收花序熏蒸晒
干入药。性甘味凉。清热生津，平肝降压。主治津伤口渴，
咽痛音哑，高血压病。”由冉先德主编的《中华药海》:“甘凉，
入肝肾二经。功效主治。①平肝熄风。治头昏、目眩、耳鸣。
②清热解毒。治急性咽喉炎。”现代研究提示，三七花有活血
化瘀的作用。三七花总皂苷为三七花提取物，本文观察了三
七花总皂苷对 HASMC细胞增殖及凋亡的影响。结果显示，
三七花总皂苷能改善 ET － 1 诱导的血管平滑肌细胞增殖的
细胞活力，能有效增加血管平滑肌细胞的凋亡率，其作用机
理有待进一步研究。
参考文献:
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(编辑:李 华)
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