全 文 ：第 32 卷 第 6 期 西 南 林 业 大 学 学 报 Vol． 32 No． 6
2012 年 12 月 JOURNAL OF SOUTHWEST FORESTRY UNIVERSITY Dec． 2012
收稿日期:2012 － 08 － 17
基金项目:西南林业大学校级科研专项(110610)资助。
第 1 作者:姚鹏强(1986—) ，男，硕士生。研究方向:林木细胞和分子生物技术。E-mail:yaopengqiang1988@ 163． com。
通信作者:普晓兰(1956—) ，女，教授。研究方向:植物生物技术。E-mail:swfcpxl@ 126． com。
doi:10． 3969 / j． issn． 2095 － 1914． 2012． 06． 006
思茅松 AFLP分子标记体系的建立
姚鹏强 李 培 王曙光 普晓兰
(西南林业大学林学院，云南 昆明 650224)
摘要:采用改进的 SDS法，提取思茅松胚乳 DNA，获得较高质量的 DNA样品，用 Eco RI和 Pst I 2 种
限制性内切酶完全酶切后，再经过预扩和选扩，从 82 对引物中筛选出 24 对带型分布均匀、多态性
高且分辨力强的引物。扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，可获得清晰指纹图谱，重复性较好。建
立的思茅松 AFLP体系可用于后续研究。
关键词:思茅松;胚乳;AFLP
中图分类号:S718. 46 文献标志码:A 文章编号:2095 － 1914(2012)06 － 0030 － 04
Establishment of AFLP Molecular Mark System of
Pinus kesiya var． langbianensis
YAO Peng-qiang，LI Pei，WANG Shu-guang，PU Xiao-lan
(Forestry College，Southwest Forestry University，Kunming Yunnan 650224，China)
Abstract:High quality genome DNA of Pinus kesiya var． langbianensis was extracted from endosperm by the
improved SDS method． After the DNA samples were completely digested by restriction enzymes of EcoRI and PstI
and through pre-amplification and selective amplification，24 pairs of primers out of 82 pairs with even band distri-
bution，abundant polymorphism and high distinctiveness were selected． The distinct finger-printings of Pinus kesiya
var． langbianensis with high reproducibility were obtained through electrophoresis of the amplified product． The es-
tablishment of this AFLP mark system will be helpful to further study on Pinus kesiya var． langbianensis．
Key words:Pinus kesiya var． langbianensis;endosperm;AFLP
思茅松(Pinus kesiya var． langbianensis (A．
Chev．)Gaussen)为常绿乔木，主产于云南麻栗坡、
元阳、景东、元江、墨江、思茅、景洪等地海拔
600 ～ 1 600 m 处。其树干含丰富的树脂，为云南省
主要的采松脂树种［1］。经调查发现，思茅松个体之
间松脂产量存在较大差异，产脂量最高的单株年产
量达 33 kg / a，最低的不到 1 kg /a，甚至个别思茅松
个体根本达不到生产树脂的要求，采脂林分年平均
产量 2 ～ 3 kg /(株·a)［2］。
传统的优良个体选育主要是应用形态标记，但
形态标记数量有限、多态性差、易受环境影响［3］，随
着分子生物学的发展，出现了多种分子标记技
术［4］。AFLP(amplified fragment length ploymorphsim)
技术是由荷兰科学家 Zabeau 和 Vos 发展起来的检
测 DNA多态性的一种方法［5］，AFLP 分子标记利用
某些内切酶位点的变异，导致酶切后产生大小不等
的片段，从而反映出不同样品在 DNA水平上的多态
性［6］，AFLP分子标记不仅可靠性好、重复性高，而
且具有高效性、安全性和方便性的优点，适合所有
生物基因组的检测，因此被认为是迄今为止最有
效、最理想的一种 DNA分子标记技术［7 － 9］。本研究
以思茅松胚乳为研究材料，通过对 AFLP 各关键步
骤的优化，建立起适合思茅松的 AFLP反应体系，从
而为进一步的研究提供参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
采自云南景谷县思茅松种子园基地优良单株，
选择粒大饱满的思茅松种子作为研究材料。
1. 2 主要试剂及设备
TE缓冲液、RNase、Tris 饱和酚、琼脂糖购自天
根生化科技有限公司;β －巯基乙醇，100 bp Maker
购自森格玛生物技术有限公司;AFLP 技术相关试
剂购自宝生物公司，引物合成全部来自上海生物工
程公司。
基本设备有紫外分光光度计(UV － 759)、高速
冷冻离心机(eppendorf 5804R)、琼脂糖凝胶电泳系
统装置(DYY －8C型)、凝胶成像仪(GelX － 1650)、
PCR扩增仪(PTC －100)、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
系统装置(JY － CX2B)、振荡器(国华 SK － 1)、移液
枪(eppendorf － 1234283)、电子天平(BS 233S) ，高
压灭菌锅(TOMY SS － 325)等。
1. 3 试验方法
1. 3. 1 胚乳 DNA 的提取 1)改良 SDS 法:向装有
大配子体的离心管中加入 SDS提取缓冲液及 β －巯
基乙醇，用玻璃棒研磨至乳浊状，放入 65 ℃水浴锅
中水浴 40 min，然后冷冻离心，取上清液，经过
Tris －饱和酚及氯仿 －异戊醇抽提后，用异丙醇沉
淀析出 DNA，经乙醇洗涤后用 1 × TE溶解备用。2)
常规的 CTAB法。
1. 3. 2 DNA的检测
1)琼脂糖凝胶电泳检测:用 1%的琼脂糖凝胶
电泳检测 DNA的大致含量、所含杂质的情况。
2)紫外分光光度计检测:提取的 DNA 用分光
光度计测定 OD260值、OD280值及 OD260 /OD280，以此检
测 DNA的质量，计算 DNA浓度。
1. 3. 3 AFLP反应体系建立方法
1)DNA样品的酶切连接。采用 EcoRI 和 PstI
2 种限制性内切酶对提取的 DNA 进行双酶切，然后
用 T4 ligase 将 EcoRI 和 PstI 接头以及酶切片段连
接，20 μL 反应体系为:10 × T4Buffer 1. 50 μL，10 ×
Tango Buffer 1. 50 μL，EcoRI 0. 40 μL，PstI 0. 40 μL，
EcoRI 接头 0. 50 μL，PstI 接头 0. 50 μL，T4 ligase
0. 30 μL，DNA样品 5. 00 μL，dd H2O 9. 90 μL，37 ℃
水浴锅中过夜。
2)预扩增。将酶切连接后的 DNA 样品进行
预扩增，10 μL 反应体系为:10 × Buffer1. 00 μL，
dNTP 0. 75 μL，EcoRI预扩增引物 0. 50 μL，PstI 预
扩增引物 0. 50 μL，Taq酶(5 U /μL)0. 10 μL，DNA
样品 4. 00 μL，dd H2O 3. 15 μL。预扩增程序为:94
℃预变性 3 min;94 ℃变性 30 s，56 ℃复性 30 s，72
℃延伸 1 min，30 个循环;72 ℃ 5 min，4 ℃保存。
将预扩增产物按 1 ∶ 20 稀释后作为选择性扩增
模板。
3)选择性扩增。10 μL反应体系为:10 × Buff-
er 1. 00 μL，dNTP 0. 75 μL，EcoRI 选扩引物 0. 50
μL，PstI 选扩引物 0. 50 μL，Taq 酶(5 U /μL)0. 10
μL，预扩后 DNA样品 4. 00 μL，dd H2O 3. 15 μL。扩
增程序为:94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性 30 s，65 ℃
复性 30 s(－ 0. 7 ℃ /循环) ，72 ℃延伸 1 min，13 个循
环;94 ℃预变性 3 min;94 ℃变性 30 s，56 ℃复性 30
s，72 ℃延伸 1 min，30 个循环;4 ℃保存。
4)引物筛选。将 EcoRI 选扩引物和 PstI 选扩
引物进行随机组合，对预扩增产物进行选择性扩
增，经聚丙烯酰胺凝胶检测后筛选出条带清晰，多
态性高的引物组合。
5)聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染。制作质量分
数为 6% 的聚丙烯酰胺凝胶，将选择性扩增后的
DNA样品，放入 PCR仪中经 90 ℃变性 3 min，70 W
恒定电压进行电泳。经过固定、水洗、银染、显色检
验结果。
2 结果与分析
2. 1 种子胚乳 DNA的提取与检测
2. 1. 1 胚乳 DNA 的提取 采用改良 SDS 法，
CTAB 法提取思茅松胚乳 DNA，结果表明，改良
SDS法步骤简易，可操作性强;经琼脂糖凝胶电泳
和分光光度计检测，均证明此方法可获得较高质
量的 DNA。SDS法经改良后，步骤更加简单，DNA
损失也较少。
2. 1. 2 琼脂糖凝胶电泳 思茅松基因组 DNA提取
电泳见图 1。
从图 1 可看出，改良的 SDS 法，能有效去除思
茅松基因组 DNA 中的蛋白质、多糖等杂质，提取的
13第 6 期 姚鹏强等:思茅松 AFLP分子标记体系的建立
DNA条带清晰，亮度较大，无拖尾现象，说明提取的
DNA完整性较好，无 RNA污染，提取效率较高。
2. 1. 3 分光光度计检测 若 OD260 /OD280 值为
1. 7 ～ 1. 9，表明 DNA 杂质污染较小，纯度较好［10］，
基本符合标准;若比值 ＞ 1. 9，则表明存在 RNA的污
染;若比值 ＜ 1. 6，则证明有蛋白质、酚类等杂质的影
响［11］。结果显示，利用 SDS 法提取的基因组 DNA
OD260 /OD280平均值为 1. 77，浓度大多在 100 ng /μL
以上，符合 AFLP分子标记的要求。
2. 2 AFLP反应体系的建立
2. 2. 1 酶切与连接产物检测 酶切连接产物经琼
脂糖凝胶电泳检测结果见图 2，结果显示:思茅松基
因组 DNA酶切较彻底。可确定将 EcoRI 和 PstI 2
种低频酶作为思茅松酶切连接的内切酶组合。
2. 2. 2 预扩增产物检测 预扩增产物检测琼脂糖
凝胶电泳图见图 3。观察发现，预扩增产物大小为
100 ～ 500 bp，呈现清晰且分布均匀的连续弥散条
带，证明其组分经预扩增产生的片段量较多，为选
择性扩增提供了充足的模板。
2. 2. 3 选择性扩增产物检测 选择性扩增产物经
琼脂糖电泳(图 4)后发现，各电泳条带较清晰，出现
分离的条带，扩增产物丰富，多态性强，可进行聚丙
烯酰胺凝胶电泳。说明选择合适的 EcoRI和 PstI选
扩引物，经 PCR 扩增后，能很好的将各个大小的
DNA片段分离出来。
2. 2. 4 引物筛选结果 本试验从 82 对引物中筛选
出 24 对带型分布均匀、多态性高且分辨力强的引
物。其组合和碱基序列见表 1。
表 1 筛选后的引物组合及其碱基序列
引物组合
名称
碱基序列
引物组合
名称
碱基序列
E65P57 E － GAG /P － CGG E62P53 E － CTT /P － CCC
E31P40 E － AAA /P － AGC E39P32 E － AGA /P － AAC
E32P52 E － AAC /P － CCC E39P62 E － AGA /P － CTT
E32P40 E － AAC /P － AGC E47P53 E － CAA /P － CCC
E33P34 E － AAG /P － AAT E47P79 E － CAA /P － TAA
E63P45 E － GAA /P － ATG E47P85 E － CAA /P － TCG
E63P79 E － GAA /P － TAA E47P45 E － CAA /P － ATG
E45P62 E － ATG /P － CTT E55P57 E － CGA /P － CGG
E17P60 E － TA /P － CTC E55P45 E － CGA /P － ATG
E34P62 E － AAT /P － CTT E46P34 E － ATT /P － AAT
E34P43 E － AAT /P － ATA E60P32 E － CTC /P － AAC
E62P35 E － CTT /P － ACA E36P68 E － ACC /P － GCC
2. 2. 5 聚丙烯酰胺凝脉电泳 选择性扩增产物聚
丙烯酰胺凝胶电泳图见图 5。
23 西 南 林 业 大 学 学 报 第 32 卷
如图 5 所示，选择性扩增产物在聚丙烯酰胺凝
胶上电泳后，经过银染显色，显示较高的多态性，且
条带清晰，可以为试验的记录提供较为可靠的试验
数据。表明此反应体系能产生较好的试验效果。
3 结论与讨论
AFLP分子标记受诸多因素的影响。首先，基
因组 DNA是否完全被消化是成败的决定性因素。
获得高质量的基因组 DNA 至关重要［12］，思茅松种
子较小，胚乳少，且脂类等杂质较多。需要极为小
心才能剔除种子中的胚，为了减少损失，本试验把
胚乳直接放入 2 mL 的离心管中研磨，采用改良的
SDS法提取，获得了较高质量的 DNA。其次，对基
因组进行完全酶切，否则会出现扩增带型不稳定
的现象。本试验参考了胡小虎等人对芒果(Man-
gifera indica)AFLP 反应体系建立中的酶切体
系［13］，应用 EcoRI和 MseI 进行酶切，效果不佳，可
能是因为酶切和连接分开进行，酶切及连接的温
度和时间不好掌握，最终采用 EcoRI和 PstI进行酶
切，且酶切和连接在一个体系里进行，一方面 PstI
相对于 MseI来说更经济实惠，另一方面，此反应体
系更简便，一次性加入内切酶和接头，在 37 ℃水
浴过夜即可，效果较好。第三，不同的引物组合具
有不同的扩增效果，其中末端带有 2 个选择性核
苷酸组合下扩增出的条带极多，条带细且密，难以
统计和分析;末端带有 2 个和 3 个选择性核苷酸的
组合条带也较多，但仅能选出少数条带数多且清
晰(E17 /P60)的引物组合;末端带有 3 个选择性核
苷酸的组合条带多且清晰，易于统计和分析，是最
理想的组合。第四，温度对聚丙烯酰胺凝胶的聚
合、显影等过程影响较大，室温条件下，在夏季效
果较好，冬季效果较差。
本试验中，采用改良的 SDS 法，提取思茅松胚
乳 DNA，可获得较高质量的 DNA 样品，用 EcoRI 和
PstI 2 种限制性内切酶完全酶切后，再经过预扩和
选扩，从 82 对引物中筛选出 24 对带型分布均匀，多
态性高且分辨力强的引物。通过酶切、预扩、选扩、
银染等过程，建立了思茅松 AFLP分子标记体系，获
得清晰指纹图谱，重复性较好。
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(责任编辑 张 坤)
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