全 文 ：http:∥www． scxuebao． cn
第 35 卷第 9 期
2011 年 9 月
水 产 学 报
JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA
Vol． 35，No． 9
Sep．，2011
文章编号:1000 － 0615(2011)09 － 1354 － 08 DOI:10． 3724 /SP． J． 1231． 2011． 17467
收稿日期:2011 -04 -04 修回日期:2011 -06 -17
资助项目:江苏省海洋生物技术重点实验室开放课题(2008HS004) ;国家科技支撑计划重大项目(2006BAD09A01)
通讯作者:阎斌伦，E-mail:yanbinlun@ yahoo． com． cn
条斑紫菜谷胱甘肽 S-转移酶基因的克隆与表达分析
周向红1，2， 易乐飞1，2， 李信书1，2， 王 萍2， 阎斌伦1*
(1．淮海工学院江苏省海洋生物技术重点实验室，江苏 连云港 222005;
2．淮海工学院海洋学院，江苏 连云港 222005)
摘要:谷胱甘肽 S-转移酶(glutathione S-transferase，GST)是一类多功能蛋白家族，主要参与解
毒和抗氧化防御过程。为了研究 GST 在条斑紫菜叶状体解毒过程中的作用，克隆并分析了条
斑紫菜一个可溶性谷胱甘肽 S-转移酶基因(命名为 PyGST)的基因组 DNA 序列和 cDNA 序
列，采用实时荧光定量 PCR研究了其在铅胁迫下的表达规律。PyGST 包含一个长 624 bp 的
完整开放阅读框，编码区内含有一个长 248 bp 的内含子。PyGST 具有 GST 蛋白家族的保守
碱基和保守结构域。PyGST 与藻类 GST 的亲缘关系最近，与动物 Sigma 型 GST 的亲缘关系
次之;在进化树上 PyGST 等大多数藻类 GST 与动物 Sigma 型 GST 聚为一簇，表明 PyGST 属
类 Sigma型 GST。铅胁迫能显著诱导 PyGST 表达，说明在叶状体细胞内 PyGST 参与了重金
属铅的解毒过程。
关键词:条斑紫菜;谷胱甘肽 S-转移酶;克隆;表达;铅
中图分类号:S 917;Q 781;Q 786 文献标志码:A
谷胱甘肽 S-转移酶(glutathione S-transferase，
GST，EC2． 5． 1． 18)是一组广泛分布于各类生物
细胞的多功能蛋白，作为主要的第二相解毒酶
(phase Ⅱ detoxification enzyme) ，参与了外源性
或内源性毒素的解毒过程［1 － 2］。GST 能催化各种
疏水或亲电的化合物与还原型谷胱甘肽
(glutathione，GSH)结合，这些结合产物会被隔离
在植物的液泡或者被转运到质外体(apoplast) ，从
而实现解毒目的［2］。此外，GST 的 GSH 依赖性
过 氧 化 物 酶 活 性 能 清 除 氢 过 氧 化 物
(hydroperoxide) ，异构酶活性参与酪氨酸降解，非
催化载体活性参与花色素苷等结合与运输，GST
还能参与胁迫信息转导、细胞凋亡和发育调控过
程［2 － 4］。除草剂、重金属、冷、热、盐渍等非生物胁
迫和病原侵染等生物胁迫都会诱导 GST 表
达［3，5］，表明 GST 在植物解毒、抗逆和抗病过程中
起着重要作用。
1970 年首次在植物中发现了 GST［6］，随着研
究深入，在各类植物中相继报道了大量的 GST 蛋
白 家 族 成 员，例 如 在 拟 南 芥 (Arabidopsis
thaliana)、大豆(Glycine max)、玉米(Zea mays)和
水稻(Oryza sativa)中分别发现了 48、25、42 和 59
个 GST［3］。目前植物 GST 可分为两大类型，即存
在于胞质中的可溶性 GST 和结合于膜上的微粒
体 GST，其中可溶性 GST 又可分为 7 类，分别为
Phi、Tau、Zeta、Theta、Lambda 型 GST 以及脱氢抗
坏血酸还原酶(dehydroascorbate reductase)和四
氯 氢 醌 脱 卤 素 酶 (tetrachlorohydroquinone
dehalogenase)［2］。
条斑紫菜(Porphyra yezoensis Ueda)属红藻
门大型经济海藻，味道鲜美、营养丰富，兼有多种
药用和保健功能，在中国长江口以北、日本和韩国
等沿海地区被广泛栽培，其产量在 2008 年已达
5． 5 万吨干重［7］，紫菜养殖已成为水产养殖中的
一个重要产业。但是，2009 年度的渤海和东海区
海洋环境公报显示，中国北方海洋环境污染形势
严峻，特别是近岸海域污染较重，各类含铅污染物
的不断排放使海州湾等几处近岸海域出现了铅超
http:∥www． scxuebao． cn
9 期 周向红，等:条斑紫菜谷胱甘肽 S-转移酶基因的克隆与表达分析
标现象。铅不是植物必需的元素，却易被植物吸
收和积累;铅污染会抑制各类酶活性、光合作用、
呼吸代谢、矿物质吸收、水平衡、膜通透性，加重对
植物的氧化胁迫，从而导致植物的生理和生化过
程以及超微结构受到损伤，并最终抑制植物生长，
甚至导致死亡［8］。铅还会通过食物链转移到整
个生态系统，甚至危及人类健康。因此研究条斑
紫菜在铅污染下的解毒机制以及减少条斑紫菜叶
状体的铅积累量具有重要的现实意义。生理研究
已表明，条斑紫菜叶状体会通过提升其超氧化物
歧化酶(superoxide dismutase)和过氧化物酶
(peroxidase)活性以及总抗氧化力来缓解铅胁迫
引起的氧化损伤［9］。但在条斑紫菜 GST 解毒研
究方面，仅报道了微粒体 GST 克隆［10］，而可溶性
GST 及其在铅胁迫下对叶状体的保护等相关研
究未见报道。
本文采用生物信息学和 RT-PCR相结合的技
术，克隆了条斑紫菜 1 个可溶性谷胱甘肽 S-转移
酶基因(命名为 PyGST)的基因组 DNA 序列和
cDNA 序列，然后采用实时荧光定量 PCR 技术分
析了条斑紫菜叶状体在铅胁迫时 PyGST 的表达
变化。研究 PyGST 将有助于探索条斑紫菜叶状
体的解毒机制及相关调控过程，为条斑紫菜的抗
性育种提供理论指导。
1 材料与方法
1． 1 条斑紫菜叶状体采集与胁迫处理
条斑紫菜叶状体于 2010 年 2—3 月从连云港
海区的紫菜养殖场采集。选取健康且无杂藻附着
的叶状体在实验室内充气培养，控制海水盐度为
30、温度为 8 ℃、光照为 40 μmol photons /(m2·
s)、光周期为 12 h∶ 12 h(光照∶黑暗) ，每天更换海
水和 PES 培养液。暂养 1周后进行铅胁迫处理，在
胁迫处理中保持其它培养条件不变。将叶状体分
别转移至含 Pb2 +质量浓度为 0，1，4，7，10 mg /L 的
海水中进行不同浓度的短期铅胁迫，处理 2 h 后取
样。将健康叶状体转移至含 Pb2 +质量浓度为 10
mg /L 的海水中进行持续铅胁迫，处理 0，2，4，6，8，
10，12 h后取样。
1． 2 条斑紫菜基因组DNA和总RNA的分离纯化
参照 Plant DNA Isolation Reagent(TaKaRa)
说明操作，分离纯化叶状体基因组 DNA。参照
TRIZOL 试剂(Invitrogen)说明操作，分离纯化叶
状体总 RNA，接着按 DNase Ⅰ(Fermentas)说明
书对总 RNA 进行处理，以避免残留的基因组
DNA 影响定量 PCR 的准确性。使用非变性琼脂
糖凝胶电泳和核酸蛋白定量仪(Bio-Rad)检测
DNA 和 RNA 的质量。
1． 3 条斑紫菜 PyGST cDNA序列的获取
参考易乐飞等［11］的方法对 PyGST 进行了计
算机辅助克隆，来自 GenBank 的 28 条条斑紫菜
表达序列标签(expressed sequence tag，EST)参与
了序列组装，拼接后得到了长 1 104 nt 的 contig。
然后据此设计和合成一对克隆用引物，正向引物:
5-CCGCCTTCTCGTCTTCC-3，反 向 引 物:5-
GGTCGGCTCGACTGCTA-3，预期扩增产物长
713 bp。
取 2 μg 总 RNA，以 Oligo(dT)为引物，按
RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis
kit(Fermentas)说明操作，反转录生成第一链
cDNA。PCR反应在 25 μL 体系中进行，体系中
含有 1 × Dream Buffer(with 2 mmol /L MgCl2) ，
200 μmol /L dNTP，0． 5 μmol /L 引物，1 U Dream
Taq DNA 聚合酶 (Fermentas) ，1 μL 第一链
cDNA。PCR循环为 95 ℃预变性 3 min;接着 30
个循环，每个循环中 95 ℃变性 30 s，57 ℃退火
30 s，72 ℃延伸 45 s;最后 72 ℃充分延伸 5 min。
扩增产物进行电泳检测和正反双向测序。
1． 4 条斑紫菜 PyGST编码区内含子的检验
为了检测 PyGST 编码区内部是否存在内含
子，以基因组 DNA 为模板进行了扩增，扩增用引
物和 PCR反应体系同条斑紫菜 PyGST cDNA 序
列的获取中所述，PCR循环为95 ℃预变性 3 min;
接着 30 个循环，每个循环 95 ℃变性 30 s，57 ℃退
火 30 s，68 ℃延伸 5 min;最后 68 ℃充分延伸 10
min。扩增产物进行电泳检测和正反双向测序。
1． 5 条斑紫菜 PyGST 表达的实时荧光定量
PCR检测
根据 PyGST的测序结果设计定量 PCR引物，
正向引物:5-TCTACTACCGCCATCCTGTCC-3，
反向引物:5-CGCTGCCGTTCGCCTTG-3，预期
扩增产物长 142 bp。参考周向红等［12］的方法，选
用 18S rRNA 作内参进行上样误差校正和标准
化。根据 GenBank 上条斑紫菜 18S rRNA 序列
(DQ666486)设计定量 PCR 引物，正向引物:5-
TGCCAGCACTGCGTTCTTACC-3，反 向 引 物:
5531
http:∥www． scxuebao． cn
水 产 学 报 35 卷
5-AGCCTTCCGACCCAGGACTATC-3，预期扩
增产物长 163 bp。所有引物均由上海生工合成。
按 PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)说
明操作，以 Oligo(dT)和 Random 6 mers为引物进
行反转录反应。实时荧光定量 PCR 反应在 IQ5
PCR仪(Bio-Rad)上进行。25 μL 的反应体系中
包含 12． 5 μL 2 × SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ
(TaKaRa)、0． 2 μmol /L 定量 PCR 引物和 2 μL
反转录产物。采用两步 PCR法进行扩增，即首先
95 ℃预变性 1 min，然后进入 45 个循环，每个循
环中 95 ℃变性 10 s，62 ℃延伸 30 s，循环结束后，
从 55 ℃缓慢升温到 95 ℃，制备熔解曲线。以
10 ×系列稀释的 cDNA 为模板进行定量 PCR，制
作 PyGST 和内参的标准曲线。每次反应都设置
阴性对照和无模板对照，每个反应设 3 个复孔。
1． 6 数据分析
用 BLAST［13］在 GenBank 中进行序列相似性
(similarity)搜索，用 ProtParam［14］、Clustal W［15］、
PhyML［16］和 CDD［17］对 PyGST 的基本理化特性、
多序列比对、进化树和功能结构域进行分析。应用
PFAFFL［18］建立的数学模型对定量 PCR数据进行
处理，结果采用平均数 ±标准差(mean ± SD)表示。
采用 SPSS 进行统计分析，各组数据都通过了正态
性和方差齐性检验，所以组间差异采用单因素方差
分析(One-Way ANOVA) ，组间多重比较采用 SNK
(Student-Newman-Keuls)检验，P ＜ 0． 05 表示差异
显著。
2 结果
2． 1 条斑紫菜基因组DNA和总RNA的分离纯化
基因组 DNA 经电泳检测后显示出约 20 kb
以上的条带，且条带清晰、无拖尾，其 A260 /A280 =
1． 79，A260 /A230 = 2． 03。所有总 RNA 电泳后显示
出明亮且清晰的 28S rRNA 和 18S rRNA 条带以
及一些细胞器 rRNA 条带，条带无弥散，点样孔无
残留，其 A260 /A280 = 1． 9 ～ 2． 1，A260 /A230 = 2． 0 ～
2． 3。表明抽提的基因组 DNA 和总 RNA 片段完
整、纯度高，核酸质量能满足后续实验要求。
2． 2 条斑紫菜 PyGST 的基因组 DNA 序列和
cDNA序列
以总 RNA 为模板，经 RT-PCR扩增得到了一
条大约 700 bp的特异性扩增条带(图 1) ，与预期
扩增产物大小相符。PCR 产物测序后得到了
PyGST 的 cDNA 序列(GQ415054) ，与 contig 序
列完全一致(identity) ，且包含一个长 624 nt 的完
整编码区。
以基因组 DNA 为模板，经 PCR扩增得到了一
条大约 1 000 bp的特异性扩增条带(图 1) ，测序后
得到了 PyGST 的基因组 DNA 序列(JF729317)。
将基因组 DNA 序列与 cDNA 序列进行比对，发现
在 PyGST的编码区内含有 1 个内含子。内含子位
于编码区的第 35个密码子内，长 248 bp;剪接位点
符合经典的“GT-AG”法则，即在内含子的 5端为
保守碱基 GT，3端为保守碱基 AG。
图 1 扩增产物电泳图
1． PyGST cDNA 序列的扩增产物;2． PyGST基因组 DNA 序列
的扩增产物;M． 200 bp DNA Marker。
Fig． 1 Electrophoresis of amplicons
1． PCR amplification products of cDNA of PyGST;2． PCR
amplification products of genomic DNA of PyGST;M． 200 bp
DNA Marker．
2． 3 条斑紫菜 PyGST 蛋白序列、结构和进化树
分析
PyGST 含 207 个氨基酸残基，分子量为 22． 6
ku，其碱性、酸性、疏水性和极性氨基酸数量分别为
30、24、77 和 40 个，含量最丰富的氨基酸是 Leu 和
Ala，含量最少的是 Asn 和 His，理论等电点(pI)为
5． 0。结构域分析结果表明，PyGST 的结构域与
Sigma型 GST 相似，其 1 ～71位氨基酸构成 N 端结
构域，85 ～191位氨基酸构成 C 端结构域。其中，残
基 Y5，L11，K47，T48，G49，V61和 D62参与 GSH的结合，
残基M96，Q98，E99，S102，D103，W165和 H168参与形成底
物结合口袋，残基 A46，I60，V61，E63，V67，R71，G85，V89，
E90，A93，A94和 V97参与二聚体的形成。
参考 HERV 等［19］的方法从 GenBank 选取
拟南芥、水稻、人(Homo sapiens)、小鼠(Mus
musculus)、果蝇(Drosophila melanogaster)、斑马
鱼(Danio rerio)和大肠杆菌(Escherichia coli)等
模式生物的各型别可溶性 GST 以及各种藻类
6531
http:∥www． scxuebao． cn
9 期 周向红，等:条斑紫菜谷胱甘肽 S-转移酶基因的克隆与表达分析
GST 用于多序列比对和进化树的构建。不论动
物、植物还是微生物，在进化树上所有 GST 都按
不同型别进行聚类，例如所有来自人、小鼠、拟南
芥和水稻的 Zeta 型 GST 聚为一簇，它们的 Theta
型 GST 也聚为一簇(图 2)。在进化树上，PyGST
与皱波角叉菜(Chondrus crispus，红藻)等藻类
GST 的亲缘关系最近，与它们的序列一致性绝大
部分介于 28． 0% ～ 39． 6%。PyGST 与人和小鼠
的 Sigma，Pi，Mu 和 Alpha 型 GST 的亲缘关系次
之，与它们的序列一致性介于 18． 8% ～ 28． 5%。
PyGST 与大肠杆菌的 Beta型 GST 的亲缘关系稍
远，序列一致性为 23． 9%。PyGST 与其它各型
GST 的亲缘关系都较远，与人和小鼠的 Theta，
Omega，Zeta型 GST 的序列一致性介于 16． 8% ～
20． 5%之间，与拟南芥和水稻的各型 GST 的序列
一致性介于 13． 9% ～ 19． 5%，与果蝇的 Delta 和
Epsilon 型 GST 的序列一致性介于 13． 2% ～
18． 1%。
图 2 不同型别 GST的进化树
利用 PhyML 程序按最大似然法构建 GST 的进化树，节点前小数表示分支支持率，不同型别 GST 都进行了标识。用两字母缩写表
示物种来源:Hs、Mm、At、Os、Dm、Bm、Dr、Sc、Pl、Cr、Tp、Cc、Ld、Es、Pp和 Ec分别表示人、小鼠、拟南芥、水稻、果蝇、家蚕、斑马鱼、鳜
鱼、新月梨甲藻、莱茵衣藻、假微型海链藻、皱波角叉菜、掌状海带、长囊水云、噬鱼费氏藻和大肠杆菌。用一字母缩写表示 GST 的
型别:A、M、P、S、T、O、Z、R、B、D、E、U、L 和 F 分别表示 Alpha、Mu、Pi、Sigma、Theta、Omega、Zeta、Rho、Beta、Delta、Epsilon、Tau、
Lambda和 Phi型 GST，PGDS、TCHQD 和 DHAR分别表示前列腺素 D 合酶、四氯氢醌脱卤素酶和脱氢抗坏血酸还原酶。GenBank
索引号显示在名称后。
Fig． 2 Phylogenetic tree of GST family members
The maximum-likelihood tree of GSTs was constructed by the PhyML program． Numbers at the nodes indicate statistical support for each
branch，according to the approximate likelihood-ratio test(given in decimal values)． Clustering of proteins into GST classes is indicated．
The names of organisms are prefixed with two letters denoting the source organism:Hs． Homo sapiens;Mm． Mus musculus;At．
Arabidopsis thaliana;Os． Oryza sativa;Dm． Drosophila melanogaster;Bm． Bombyx mori;Dr． Danio rerio;Sc． Siniperca chuatsi;Pl．
Pyrocystis lunula;Cr． Chlamydomonas reinhardtii;Tp． Thalassiosira pseudonana;Cc． Chondrus crispus;Ld． Laminaria digitata;Es．
Ectocarpus siliculosus;Pp． Pfiesteria piscicida;Ec． Escherichia coli． The classes of GSTs are suffixed with one letter:A． Alpha;M． Mu;
P． Pi;S． Sigma;T． Theta;O． Omega;Z． Zeta;R． Rho;B． Beta;D． Delta;E． Epsilon;U． Tau;L． Lambda;F． Phi． PGDS，TCHQD and
DHAR refer to prostaglandin D synthase，tetrachlorohydroquinone dehalogenase and dehydroascorbate reductase，respectively． Accession
numbers are shown after name．
7531
http:∥www． scxuebao． cn
水 产 学 报 35 卷
2． 4 条斑紫菜 PyGST的表达分析
PyGST和内参的扩增曲线都呈规则的“S”
形，基线平整、指数区明显，阴性对照和无模板对
照呈水平直线，复孔间扩增曲线基本重叠，熔解曲
线均显示单一的特异峰，扩增效率为 100% ±
5%。说明定量 PCR 反应体系良好，无非特异性
扩增，确保了定量结果的准确性。
不同质量浓度铅胁迫能显著诱导条斑紫菜叶
状体 PyGST表达(图 3-a)。其中在 1 和 4 mg /L
铅胁迫下，PyGST 的表达量较高，分别是对照的
2． 11 和 2． 54 倍;但在 7 和 10 mg /L 铅胁迫下，
PyGST的表达量相对较低，分别是对照的 1． 26 和
1． 34 倍。持续铅胁迫也显著诱导条斑紫菜叶状
体 PyGST表达，且 PyGST表达量在整个持续胁迫
过程中呈现波动状态(图3-b)。在胁迫的前6 h
图 3 条斑紫菜 PyGST在胁迫下的相对表达量
采用实时定量 PCR 技术分析了 PyGST 在不同质量浓度铅胁
迫(a)和持续铅胁迫(b)下的相对表达量。PyGST 的相对表
达量按 PFAFFL［18］的方法计算。图中数据表示为平均值 ±
标准差(n = 3) ，柱形图上的不同字母表示差异的显著性(P ＜
0． 05)。
Fig． 3 The relative mRNA expression levels of PyGST
gene in P． yezoensis under Pb stress
The relative expression levels of PyGST in response to stress of
different concentration of Pb(a)and continuous Pb stress(b)were
analyzed using real-time PCR． The relative expression levels of the
PyGST were determined by the PFAFFL method ［18］． Error bars
indicate the mean and standard deviation(n = 3)． Different letters
above each bar indicate statistical difference(P ＜0． 05)．
内 PyGST的表达逐步上升，与对照相比其表达量
从 2 h的 1． 34 倍上升到 6 h的 3． 94 倍;PyGST的
表达量在 8 h 时回落到 1． 99 倍，然后再逐步上
升，至 12 h时达第二个峰值，是对照的 3． 60 倍。
3 讨论
HERV等［19］首先指出皱波角叉菜和掌状海
带(Laminaria digitata，褐藻)含有类似 Sigma 型
的 GST，随后 DE FRANCO 等［20］认定长囊水云
(Ectocarpus siliculosus，褐藻)的可溶性 GST 属于
Sigma 型 GST。为了弄清 PyGST 的分类，以
PyGST 为探针对 GenBank 进行 BLAST 搜索，结
果显示 PyGST 与藻类 GST 和动物的 Sigma 型
GST 具有较高相似性，但与植物的相似性较低。
那么 PyGST 的具体型别又如何呢?考虑到 GST
是一个庞大的蛋白家族，型别众多，分布广泛，家
族成员间的序列一致性较低，本文采用最大似然
算法(maximum-likelihood)和 LG 模型［21］构建进
化树，采用 aLRT (approximate likelihood-ratio
test)方法［22］检测进化树分支。构建的进化树与
DE FRANCO 等［20］和 HERV 等［19］的结果基本
一致。在进化树上，除了红藻、甲藻和硅藻的少数
可溶性 GST 与 Beta 和 Pi型 GST 聚类在一起外，
红藻、褐藻、绿藻和甲藻的大多数可溶性 GST 与
Sigma 型 GST 聚为一大类。因此，可以推断
PyGST 属于类 Sigma 型 GST。可是 GST 的进化
树与藻类的进化地位不符。虽然 Theta 型被认为
是真核生物中最原始的一类 GST［23］，但是藻类
GST 却与之相距较远;虽然陆生植物没有 Sigma
型 GST，但与陆生植物亲缘关系较近的绿藻却含
有类 Sigma 型 GST;虽然大多数藻类 GST 与
Sigma型相似，但也有少数接近原核生物的 Beta
型 GST。这反映藻类 GST 可能存在多种起源，大
多数藻类 GST 可能与 Sigma 型 GST 存在趋同
进化。
铅等重金属是生物非必需的或需要量极少的
元素，过量重金属进入细胞会对生物造成严重损
伤，甚至死亡，因此解除重金属毒性对生物生存十
分重要。在长期进化过程中，生物逐渐建立了多
种重 金 属 解 毒 机 制，能 调 用 金 属 硫 蛋 白
(metallothionein)、植物络合素(phytochelatin)、
GSH、多磷酸体(polyphosphate body)、脯氨酸、热
激蛋白(heat shock protein)等分子以及 GST、过
8531
http:∥www． scxuebao． cn
9 期 周向红，等:条斑紫菜谷胱甘肽 S-转移酶基因的克隆与表达分析
氧化氢酶(catalase)、过氧化物酶、超氧化物歧化
酶等酶类来应对重金属胁迫［24 － 25］。其中，GST
主要通过以下 2 种方式参与重金属的解毒:GST
能催化 GSH直接与重金属离子共价结合，从而降
低重金属离子毒性并促进重金属向液泡或质外体
转运［26］;GST 的过氧化物酶活性能利用 GSH 向
氢过氧化物发动亲核攻击，使其还原为低毒的一
元醇(monohydroxy alcohol) ，从而缓解重金属胁
迫产生的氧化胁迫［27］。
定量 PCR结果显示，PyGST受铅胁迫的诱导
表达，表明 PyGST在条斑紫菜叶状体细胞内参与
了铅胁迫的解毒过程。在持续铅胁迫下，PyGST
的表达量呈现波动状态，这种表达量的高低波动，
可能是 PyGST 的负反馈调控机制的作用结果。
虽然具体的负反馈调控机制并不清楚，但在酿酒
酵母(Saccharomyces cerevisiae)中已经发现 GSH
与重金属镉的结合产物在胞质中的积累会抑制
GST 的活性［26］;在小鼠中也发现 GSH 与环境致
癌物苯并芘代谢产物反式二羟环氧苯并芘
［(+)-anti-BPDE］的结合产物在胞质中的积累
会抑制 Pi 型 GST 活性［28］。虽然 PyGST 受铅胁
迫诱导表达，但是 PyGST 的诱导水平并不高。短
期高浓度铅胁迫诱导的 PyGST 表达量小于短期
低浓度铅胁迫诱导的表达量，持续高浓度铅胁迫
诱导的表达量大于短期高浓度铅胁迫诱导的表达
量。这些表达模式表明条斑紫菜叶状体具备多种
重金属解毒机制，它们之间存在协同作用，即受到
不同强度的铅胁迫，叶状体会组合不同的解毒机
制来应对胁迫。在海洋植物茎生波喜荡草
(Posidonia oceanica)中也发现了类似的结果，低
浓度汞胁迫时 GST 活性上升，但在高浓度汞胁迫
时 GST 活性下降，而植物络合素被诱导合成［29］。
由于没有排泄系统，植物的解毒系统会将重
金属存储在液泡和质外体中，从而导致重金属在
植物中的富集。因此培育高重金属抗性且低重金
属富集的食用植物显得十分必要。早期研究显
示，表达大肠杆菌 GST 或拟南芥的植物络合素合
酶(phytochelatin synthase)等解毒基因的转基因
植物的确获得了较高的重金属抗性，但同时也增
加了重金属的富集［30 － 31］。直到最近，表达绿木霉
(Trichoderma virens )GST 的 转 基 因 烟 草
(Nicotiana tabacum)既获得了较强的重金属抗
性，又没有增强重金属的富集［32］。这种特质的具
体机理虽不清楚，却让我们看到了希望。从目前
的数据来看，尚不能推断超表达 PyGST 能否降低
重金属富集，这一问题有待于进一步研究。
参考文献:
［1］ HAYES J D，FLANAGAN J U，JOWSEY I R．
Glutathione transferases［J］． Annual Review of
Pharmacology and Toxicology，2005，45:51 － 88．
［2］ BASANTANI M， SRIVASTAVA A． Plant
glutathione transferases—a decade falls short［J］．
Canadian Journal of Botany，2007，85 (5 ) :
443 － 456．
［3］ 胡廷章，周大祥，罗凯． 植物谷胱甘肽转移酶的结
构与功能及其基因表达［J］． 植物生理学通讯，
2007，43(1) :195 － 200．
［4］ JIANG H W，LIU M J，CHEN I C，et al． A
glutathione S-transferase regulated by light and
hormones participates in the modulation of
Arabidopsis seedling development ［ J］． Plant
Physiology，2010，154(4) :1646 － 1658．
［5］ DUDLER R，HERTIG C，REBMANN G，et al． A
pathogen-induced wheat gene encodes a protein
homologous to glutathione-S-transferases ［ J］．
Molecular Plant-Microbe Interactions，1991，4(1) :
14 － 18．
［6］ FREAR D S，SWANSON H R． Biosynthesis of S-(4-
ethylamino-6-isopropylamino-2-s-triazino)glutathione:
Partial purification and properties of a glutathione S-
transferase from corn［J］． Phytochemistry，1970，9(10):
2123 －2132．
［7］ BLOUIN N A，BRODIE J A，GROSSMAN A C，
et al． Porphyra:a marine crop shaped by stress［J］．
Trends in Plant Science，2011，16(1) :29 － 37．
［8］ SHARMA P，DUBEY R S． Lead toxicity in plants
［J］． Brazilian Journal of Plant Physiology，2005，17
(1) :35 － 52．
［9］ 邵世光，阎斌伦，李廷友，等． Cr6 +、Pb2 +、Cd2 +胁迫
下条斑紫菜保护酶系统的响应［J］． 水生态学杂
志，2009，2(4) :94 － 97．
［10］ 吕娓娓．条斑紫菜丝状体对重金属胁迫的响应及
抗性基因 GST 的克隆与表达［D］．沈阳:辽宁师范
大学，2009．
［11］ 易乐飞，刘楚吾，王萍，等．条斑紫菜泛素结合酶基
因的 cDNA 序列克隆与分析［J］．水产学报，2009，
33(5) :719 － 726．
［12］ 周向红，李信书，王萍，等．条斑紫菜 HSP90 基因的
克隆与表达分析［J］． 水产学报，2010，34(12) :
9531
http:∥www． scxuebao． cn
水 产 学 报 35 卷
1844 － 1852．
［13］ ALTSCHUL S F，MADDEN T L，SCHAFFER A
A，et al． Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new
generation of protein database search programs［J］．
Nucleic Acids Research，1997，25(17) :3389 － 3402．
［14］ WILKINS M R，GASTEIGER E，BAIROCH A，
et al． Protein identification and analysis tools in the
ExPASy server［J］． Methods in Molecular Biology，
1999，112:531 － 552．
［15］ THOMPSON J D，HIGGINS D G，GIBSON T J．
CLUSTAL W: improving the sensitivity of
progressive multiple sequence alignment through
sequence weighting，position-specific gap penalties
and weight matrix choice ［J］． Nucleic Acids
Research，1994，22(22) :4673 － 4680．
［16］ GUINDON S，GASCUEL O． A simple，fast，and
accurate algorithm to estimate large phylogenies by
maximum likelihood［J］． Systematic Biology，2003，
52(5) :696 － 704．
［17］ MARCHLER-BAUER A，LU S，ANDERSON J B，
et al． CDD:a Conserved Domain Database for the
functional annotation of proteins［J］． Nucleic Acids
Research，2011，39(D) :225 － 229．
［18］ PFAFFL M W． A new mathematical model for
relative quantification in real-time RT-PCR［J］．
Nucleic Acids Research，2001，29(9) :2002 － 2007．
［19］ HERV C，DE FRANCO P O，GROISILLIER A，
et al． New members of the glutathione transferase
family discovered in red and brown algae［J］．
Biochemical Journal，2008，412(3) :535 － 544．
［20］ DE FRANCO P O，ROUSVOAL S，TONON T，
et al． Whole genome survey of the glutathione
transferase family in the brown algal model
Ectocarpus siliculosus［J］． Marine Genomics，2009，1
(3 － 4) :135 － 148．
［21］ LE S Q，GASCUEL O． An improved general amino
acid replacement matrix［J］． Molecular Biology and
Evolution，2008，25(7) :1307 － 1320．
［22］ ANISIMOVA M， GASCUEL O． Approximate
likelihood-ratio test for branches:A fast，accurate，
and powerful alternative［J］． Systematic Biology，
2006，55(4) :539 － 552．
［23］ FROVA C． Glutathione transferases in the genomics
era:New insights and perspectives［J］． Biomolecular
Engineering，2006，23(4) :149 － 169．
［24］ 周文彬，邱保胜．藻类对重金属的耐性与解毒机理
［J］．湖泊科学，2004，16(3) :265 － 272．
［25］ 李磊，黄小平．重金属在海草中累积及其对海草生
长的 影 响［J］． 生 态 学 杂 志，2009，28 (9) :
1897 － 1904．
［26］ ADAMIS P D B，MANNARINO S C，ELEUTHERIO
E C A． Glutathione and gamma-glutamyl transferases
are involved in the formation of cadmium-glutathione
complex ［J］． FEBS Letters，2009，583 (9 ) :
1489 －1492．
［27］ EDWARDS R，DIXON DP，WALBOT V． Plant
glutathione S-transferases:enzymes with multiple
functions in sickness and in health［J］． Trends in
Plant Science，2000，5(5) :193 － 198．
［28］ SRIVASTAVA S K，HU X，XIA H，et al． ATP-
dependent transport of glutathione conjugate of
7beta，8alpha-dihydroxy-9alpha，10alpha-oxy-7，8，9，
10-tetrahydrobenzo［a］ pyrene in murine hepatic
canalicular plasma membrane vesicles ［ J］．
Biochemical Journal，1998，332(3) :799 － 805．
［29］ FERRAT L，ROMEO M，GNASSIA-BARELLI M，
et al． Effects of mercury on antioxidant mechanisms
in the marine phanerogam Posidonia oceanica［J］．
Diseases of Aquatic Organisms，2002，50 (2) :
157 － 160．
［30］ LIANG ZHU Y，PILON-SMITS E A，JOUANIN L，
et al． Overexpression of glutathione synthetase in
indian mustard enhances cadmium accumulation and
tolerance［J］． Plant Physiology，1999，119 (1) :
73 － 80．
［31］ GASIC K，KORBAN S． Transgenic Indian mustard
(Brassica juncea)plants expressing an Arabidopsis
phytochelatin synthase(AtPCS1)exhibit enhanced As
and Cd tolerance［J］． Plant Molecular Biology，2007，
64(4) :361 － 369．
［32］ DIXIT P，MUKHERJEE P K，RAMACHANDRAN
V，et al． Glutathione transferase from Trichoderma
virens enhances cadmium tolerance without
enhancing its accumulation in transgenic Nicotiana
tabacum［J］． PloS One，2011，6(1) :e16360．
0631
http:∥www． scxuebao． cn
9 期 周向红，等:条斑紫菜谷胱甘肽 S-转移酶基因的克隆与表达分析
Molecular cloning and expression pattern of glutathione S-transferase
gene in Porphyra yezoensis Ueda(Bangiales，Rhodophyta)
ZHOU Xiang-hong1，2，YI Le-fei1，2，LI Xin-shu1，2，WANG Ping2，YAN Bin-lun1*
(1． Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China;
2． School of Marine Science ＆ Technology，Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China)
Abstract:Glutathione S-transferases(GSTs)are a superfamily of multifunctional proteins present in all
organisms． GSTs catalyze the conjugation of reduced glutathioe with xenobiotics，to form more soluble，
nontoxic compounds，ready to be excreted or compartmentalized． So GSTs are primarily involved in
detoxification and antioxidant defense． So far，compared to higher plants and mammals，there is limited
information on genes related to detoxification or antioxidant defense from Porphyra yezoensis Ueda． In order
to investigate the contribution of GST to detoxification in thalli of P． yezoensis，molecular cloning and
expression analysis of a glutathione S-transferase gene(designated as PyGST)from P． yezoensis were
performed． The genomic DNA and cDNA sequences of PyGST were obtained with computer assisted
cloning，and characterized using multiple bioinformatic programs． The relative mRNA expression levels of
PyGST under lead stress were investigated in thalli of P． yezoensis using real-time quantitative PCR． The
PyGST cDNA contained a 624 nt of continuous complete coding region，encoding a polypeptide of 207
amino acids with a calculated molecular mass of 22． 6 ku． The alignment of the genomic DNA with the
cDNA showed that PyGST contained a 248 bp of intron，whose ends were defined by the 5-GT and 3-AG
rule． PyGST contained conserved N-and C-domains of GST family． The amino acids defining the binding
sites of glutathione and xenobiotic substrates were also conserved． Sequence comparison of PyGST revealed
28． 0% － 39． 6% and 23． 0% － 28． 5% identity with most algal GSTs and animal Sigma class GSTs，
respectively． PyGST was closely clustered with most algal GSTs in the phylogenetic tree． Phylogenetic tree
also showed that most algal GSTs including PyGST were distinct from previously described GST classes，but
were most closely related to the Sigma class． These features indicated that the PyGST belongs to Sigma-like
GST． Lead stress significantly induced the expression of PyGST． The expression levels of PyGST induced by
low concentrations of lead were higher than those by high concentrations of lead． Upon lead exposure(10
mg /L)for 12 h，the higher expression levels of PyGST were observed at 6 h and 12 h． These findings
indicated that PyGST plays a role in detoxification of lead in thalli of P． yezoensis．
Key words:Porphyra yezoensis Ueda;glutathione S-transferase(GST) ;cloning;expression;Pb
Corresponding author:YAN Bin-lun． E-mail:yanbinlun@ yahoo． com． cn
1631