全 文 ：　　＊国家自然科学基金(49976030)资助;宁波市重点基金(02J20101-15)资助。刘必谦 , 博士 , 副研究员 , E-mail:lbqhy@
nbu.edu.cn
收稿日期:2004-03-20 ,收修改稿日期:2005-01-06
条斑紫菜(Porphyra yezoensis)dbEST中筛选
微卫星位点及引物种间转移扩增＊
刘必谦　曾庆国 　骆其君　王亚军　厉盛华
(宁波大学海洋生物工程重点实验室　宁波　315211)
(宁波海洋与渔业研究院　宁波　315012)
提要　　采用电子查询的方法 ,借助 Blast软件从条斑紫菜表达序列标签数据库的 20979条序
列中筛选微卫星位点 , 共发现非冗余微卫星位点 211 个 , 占整个条斑紫菜 EST 数据库的
1.01%。其中双碱基重复微卫星位点共有 35个 ,占查找微卫星序列总数的 16.6%;三碱基微
卫星有 176个 ,占 83.4%。双碱基重复微卫星中 AG/CT 形式最多 ,而三碱基中 GGC/GCC 最
多。从筛选出的微卫星位点中选取序列设计合成引物 ,用在坛紫菜上进行引物种间转移扩增
研究 。在总共 15对引物中有 13对引物在两个种间都有扩增产物。结果表明 ,微卫星位点在
这两种紫菜之间具有很高的同源性 。获得的微卫星引物可用来进行种群遗传多样性研究 、谱
系鉴定和遗传图谱的构建。而微卫星标记的共显性可用来进行紫菜二倍体丝状体纯合性检
验 ,为纯系紫菜品系的鉴定提供分子生物学鉴定方法 。
关键词　　条斑紫菜 ,表达序列标签 ,微卫星 ,种间转移扩增
中图分类号　　Q789
　　微卫星(Microsatellite),又称为简单序列重复
(Simple Sequence Repeat , SSR)、短串联重复(Short
tandem repeats , STR)、可变数目串联重复(Varied
number tandem repeats , VNTR),是以少数几个核苷
酸(一般为 2—4 个)为重复单位的串联重复 DNA
序列 ,广泛分布于真核生物的基因组中(Powell et
al , 1996)。微卫星标记除具有多态性程度高和共
显性特点外 ,其特异性引物扩增还具有很好的重
复性和保真性 ,方便于实验室间的交流。目前 ,
微卫星标记已广泛应用于基因连锁与遗传图谱
的构建 、遗传多样性研究 、谱系和发育研究 、疾病
检测以及品种鉴定 、亲本分析与个体 、纯系
检验 。　　　
微卫星标记研究中的最大困难是引物的获
得。与 RAPD、AFLP等遗传标记不同 ,微卫星首先
需要获知位点的序列信息 ,以便从两端的侧翼序
列设计引物。在已发表的筛选微卫星位点方法
中 ,最简便 、最省时的方法就是从公共数据库或已
发表的文献中查找到微卫星位点。近年来 ,随着
表达序列标签(Expressed sequence tag , EST)文库
的增多 ,从 EST 文库中筛选微卫星位点的方法已
得到了广泛应用 。目前 ,从 EST 文库中筛选微卫
星标记的方法已应用到葡萄(Vitis vinifera)(Scott
et al , 2000)、甘蔗(Saccharum spp.)(Cordeiro et al ,
2001)、小麦(Eujayl et al , 2002;Bandopadhyay et
al , 2004)、大麦(Hordeum vulgare L.)(Thiel et al ,
2003)、对虾(Fenneropenaeus chinensis)(徐鹏等 ,
2003)等物种的遗传研究中 。
截止到 2004年 6月 ,在 Genbank中的条斑紫
菜(Porphyra yezoensis)EST 数据库(dbEST)中共有
20 979 条序列(Nikaido et al , 2000;Lee et al ,
1999;杨官品等 , 2002),其中大部分为 Nikaido 等
(2000)所提供的条斑紫菜叶状体 EST序列 。本文
从条斑紫菜 EST 数据库中筛选微卫星位点 ,并选
第 36 卷　第 3期 海　洋　与　湖　沼 Vol.36 , No.3
2 0 0 5 年 5 月 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA May , 2 0 0 5　
取一些序 列设计引物 , 在坛紫菜 (Porphyra
haitanensis)叶状体上进行微卫星引物种间转移扩
增研究。
1　材料与方法
1.1　从条斑紫菜 dbEST中筛选微卫星位点
在Genbank 中编号为 AU186563-AU197187和
AV429311-AV439464的为条斑紫菜 EST 序列 。应
用BLAST 软件(Altschual et al , 1997)在条斑紫菜
EST 中筛选所有的两核苷酸和三核苷酸重复微卫
星。只有重复次数不少于 7次的两核苷酸重复微
卫星和重复次数不少于 5次的三核苷酸重复微卫
星才被选用 。接着 ,再次用 BLAST 程序进行序列
之间的比较 ,将相似性≥90%的序列认为是同一
序列 ,以排除冗余。
1.2　微卫星引物设计
从排除冗余后的微卫星序列中 ,选取一些序列
进行引物设计。用引物设计软件Primer Premier(ver-
sion 5.0)设计引物。引物设计的标准是:引物长度为
(20±2)bp ,GC含量在50%—75%之间 ,Tm值为50—
65℃,期望产物长度在 100—300bp之间 ,引物内不出
现发夹结构。引物委托上海生工公司合成。
1.3　模板 DNA的提取
3种不同地区采集的坛紫菜种群和一个条斑
紫菜种群(表 1)被用来进行微卫星引物扩增。种
群样品 DNA 提取用上海生工的 UNIQ-10 柱式临
床样品基因组抽提试剂盒(SK1342),提取步骤按
说明书。提取的 DNA样品在 0.8%琼脂糖胶上检
验浓度。
表 1　样本紫菜种类及分布
Tab.1　The species and locations of collected samples
品种 采集地点 采集时间(年.月.日) 状态
坛紫菜 Ph-CC 慈溪七姐八妹列岛 2003.04.15 野生
坛紫菜 Ph-XSH 象山南田塘 2003.11.10 栽培
坛紫菜 Ph-WL 温岭 2003.02.13 栽培
条斑紫菜 Py-DL 大连老虎滩 2003.02.15 野生
1.4　微卫星引物扩增及有用引物检测
实验中9个坛紫菜个体和 2个条斑紫菜的个
体被用来进行微卫星扩增。PCR反应体积为25μl ,
反应成分包括:10 ×PCR buffer 2.5μl , 25mmol/L
mg
2+
2.0μl ,2.0μmol/L dNTPs ,1U TaqDNA 聚合酶 ,
微卫星正向引物和反向引物各 40pmol ,模板 DNA
5—10ng ,用超纯水定量到 25μl ,添加石蜡油以防
止扩增时液体蒸发。PCR 反应在 Perkin Elmer
2400扩增仪上进行 ,反应条件是:94℃变性 5min ,
接下来35个循环为 94℃变性 30s;退火 30s ,退火
温度依引物而异;72℃延伸 1min 。循环结束后
72℃继续延伸 7min , 4℃保温。扩增的产物先在
1.5 %琼脂糖凝胶上检验扩增效果 ,然后在 4.5%
聚丙烯酰胺凝胶 30W恒功率电泳 3.5h 。电泳结
束后 ,胶板 10%冰醋酸溶液脱色 20min ,双蒸水清
洗3次 ,加入染色液(0.1%AgNO3 , 0.15%甲醛)
染色 30min后在双蒸水中清洗胶不超过 5s ,迅速
将胶板放入冷却的显色液(3%Na2CO3 , 0.15%甲
醛)中轻摇至条带出现。那些扩增产物条带明显 、
在种间具有多态性的引物认为是可用的 ,筛选出
来以进行进一步的研究 。　　　
2　结果
2.1　微卫星序列筛选结果
从20979 个条斑紫菜的 EST 序列中 , 经过
BLAST 软件在线查找 ,同时结合人工筛选 ,共获得
211个非冗余(non-redundant)的微卫星位点 ,占整
个条斑紫菜 EST 数据库的 1.01%。其中含有双
碱基 ,重复次数不少于 7次的微卫星位点共有 35
个 ,占 EST 数据库中发现的微卫星序列总数的
16.6 %;三核苷重复次数不少于 5次的微卫星有
176个 ,占 83.4%。表 2 总结了微卫星位点的重
复类型及个数 。
由于这些微卫星位点主要是通过电子软件从
EST 文库中筛选出来的 ,所以大部分发现的微卫
星序列为 Perfect形式的重复。在所有非冗余位点
中 ,Perfect形式的微卫星有 168个 , Imperfect有 34
个 , Compound 有 9 个 , 分别占总数的 79.6%、
16.1%和 4.3%。
在双碱基重复序列中 ,(AG/CT)n 形式最为常
3期 刘必谦等:条斑紫菜(Porphyra yezoensis)dbEST中筛选微卫星位点及引物种间转移扩增 249　
表 2　条斑紫菜 dbEST中筛选的微卫星序列
Tab.2　The summary of microsatellite sequences exploited from dbEST of P .yezoensis
重复类型 查找位点总数 非冗余数 最大重复次数 非冗余微卫星重复方式
Perfect Imperfect Compound
2 碱基 62 35 — 23 8 4
(AG/CT)n 26 24 49 19 3 2
(AC/ GT)n 7 7 13 2 3 2
(CG)n 29 4 7 2 2 0
3 碱基 652 176 — 145 26 5
(AAG/ CTT)n 4 4 5 3 1 0
(AAC/GTT)n 87 5 17 1 4 0
(AGA/ TCT)n 22 2 5 1 1 0
(AGG/CCT)n 19 5 6 4 1 0
(AGC/GCT)n 99 32 18 21 10 1
(ACG/CGT)n 100 4 5 4 0 0
(ACC/GGT)n 38 8 10 6 1 1
(TGG/CCA)n 104 3 5 3 0 0
(TGC/GCA)n 20 17 6 15 0 2
(TCG/CGA)n 2 2 5 2 0 0
(GAG/CTC)n 11 3 5 3 0 0
(GAC/GTC)n 1 1 6 1 0 0
(GTG/CAC)n 2 2 5 2 0 0
(GGA/TCC)n 1 1 5 1 0 0
(GGC/GCC)n 95 64 14 55 8 1
(GCG/ CGC)n 34 11 5 11 0 0
(CAG/CTG)n 3 2 5 2 0 0
(CCG/CGG)n 9 9 5 9 0 0
(ATG/ CAT)n 1 1 5 1 0 0
合计 714 211 — 168 34 9
见 ,而三碱基中(GGC/GCC)n 形式最多。这其中
(GGC/GCC)n 约占了从 EST 中筛选的非冗余微卫
星位点的 1/3 ,其次是(AGC/GCT)n 、(AG/CT)n 和
(TGC/GCA)n 。
2.2　引物设计及可用引物的筛选
从查找出的包含微卫星位点的序列中选取了
15条序列进行引物设计 、合成和检测 。其中 14
对引物来自 3碱基重复序列 ,一对引物来自双碱
基重复。
将合成的引物在大连采集的野生条斑紫菜 、
慈溪的野生坛紫菜 、象山和温岭的养殖坛紫菜上
进行多态性检测以及引物种间扩增研究 。经过
PCR扩增 、聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染 ,在总共
15对引物中 ,有 13对引物在条斑紫菜和坛紫菜
中都有扩增条带出现 ,还有 2对引物在两个紫菜
种中没有条带产生(表 3)。
250　 海　　洋　　与　　湖　　沼 36 卷
表3　条斑紫菜 EST-SSR引物序列和种间转移扩增的可行性
Tab.3　The sequences of SSR primers derived from dbEST of P .yezoensis and transferring amplification of interspecies
引物编号 引物序列1) 温度(℃)
产物大小
(bp)
引物扩增结果2)
Py-DL Ph-WL Ph-XSH Ph-CC
AV434463 GGTGCTGAT GTCCAGAGGC 54 171 0 0 0 0
GTTGGGCACTTTCACCTATT
AU188905 CGTCGTCAACTTCCTCTTCC 56 126 1 1 1 1
CCTCCCACTCAGTCTGCGTA
AU196122 TGCTCTTGTCCTAAACCCAT 55 207 1 1 1 1
CGTGTTGATGCTCGTCGTGC
AU195385 TCCAGCAGACGGGAGAAAGA 58 140 1 1 1 0
CCGATACACCTGTTACGCCT
AU192492 GGCACAGGCTCAGCAAGTA 56 117 1 1 1 1
TATGCCACGGATGTAAGGAGG
AU192094 CGTCGCTTCCGTCGCTGTCT 57 197 1 1 1 1
TAGTTGGTGTTGTGCGTTGA
AU187410 AGCCCGTTGGCGAAATCC 61 177 1 1 1 1
TACTGGGTTGCTGTGCTCTGTT
AU194267 GCCCACGCAAGTGTTTACCC 58 186 1 1 0 0
GGAAAGTATGTTGTCGGTCGGG
AU191289 TTCCAGCAGACGGGAGAAAGAC 59 142 1 1 1 1
CCGATACACCTGTTACGCCTC
AU196400 TATCCGAAACACTATCGCTCCC 59 186 1 1 1 1
CCCAGACGCCGCCAATGCT
AU193408 GGTGTCAGCGGTGGTGTTGG 61 143 1 1 1 1
TAGAGGTFFFCTTAGTGGCAG
AAC21 ACGGCTACGCTGCTGGCTAC 51 119 1 1 1 1
TGTTGGTCGTCTTGTTGGAC
ACA25 CCAACGATGGGTTTCTTCAA 56 300 1 1 1 1
ACTTCATGCCCCTGCCGATG
ACC10 GACCAACGCAGCAGTCTTCC 59 225 0 0 0 0
TAACGGCTCCAACTCTACGG
AG28 TCTTGTTCCTTGACGACTGG 57 253 1 1 1 1
GATGGTGGCAGTGGCAGATG
　　1)引物序列:上排为正向引物 5′※3′, 下排为反向引物 3′※5′;2)有扩增产物记为 1 ,没有扩增产物记为0
3　讨论
Kantety等(2002)查找了五种禾本科植物的
EST 数据库 ,其中包含重复长度最小为 18bp的
di-、tri-微卫星位点的序列所占的比例最小为
1.3 %(玉米),最大是 4.4%(水稻),都高于条斑
紫菜 EST 数据库的 1.01%。可能的原因是条斑
紫菜 EST数据库中序列数相对较少 ,且冗余序列
较多 ,在实验中共获得微卫星序列 714条 ,非冗余
位点只有 211条 ,比例为 29.6%。另一个可能的
原因是由于条斑紫菜基因组相对较小 ,单倍体只
有三条染色体 。
在重复形式上 ,双碱基重复微卫星最多的是
3期 刘必谦等:条斑紫菜(Porphyra yezoensis)dbEST中筛选微卫星位点及引物种间转移扩增 251　
图 1　4 个条斑紫菜 EST-SSR 引物扩增电泳图
Fig.1　The amplification results of 4 EST-SSR primers derived from P.yezoensis
a.引物 AU188905;b.引物 AU191289;c.引物 AU192492;d.引物 AU196400
泳道 1—3 为 Ph-CC;4—6 为 Ph-XSH;7—9为 Ph-WL;10—11为 Py-DL
AG/CT ,而在三碱基重复中GGC/GCC 形式的微卫
星序列占了绝大多数 ,这与 Kantety 等(2002)的结
果相符。
由于重复序列和包含引物位点的侧翼序列在
252　 海　　洋　　与　　湖　　沼 36 卷
物种间具有保守性 ,所以一个物种的微卫星引物
可以用来检测相近物种同源位点的多态性。在国
内已经进行了铲鲟微卫星引物在中华鲟上(邵昭
君等 , 2002),鲤的微卫星引物在草鱼上(林凯东
等 , 2003),斑节对虾的引物在中国对虾 、凡纳对
虾 、日本对虾(张天时等 , 2003)中的通用性研究 。
同基因组中获得的微卫星相比 ,EST 中获得的微
卫星位点在种间(甚至在属间)具有更高的保守
性 ,这是由功能基因的保守性决定的 。实验中用
条斑紫菜的 EST 微卫星引物在坛紫菜 3个品系中
进行了引物种间转移扩增研究 ,在 15对引物中 ,
13对引物在条斑紫菜和坛紫菜上都有扩增条带
出现 ,证明所选用的微卫星位点在条斑紫菜和坛
紫菜具有高的保守性 。至于引物是否能在圆紫
菜 、铁钉紫菜等紫菜属种间进行扩增还需要实验
的验证。
从条斑紫菜 dbEST中获得的微卫星引物可用
来进行紫菜种群遗传多样性研究 、遗传图谱构建 。
另外 ,微卫星标记的高分辨率可用来进行遗传距
离相近的紫菜养殖品系的鉴定 ,为紫菜养殖中的
种质鉴定提供分子生物学方法 。
比较在国内广泛应用的 RAPD 、AFLP 等遗传
标记 ,微卫星标记的费用相对较高。但微卫星标
记的独特之处在于其共显性的特点 ,可以区分杂
合体和纯合体 ,对纯合品系筛选非常有用 。本实
验的出发点就是应用微卫星的共显性特点来检验
紫菜二倍体丝状体是否为纯合的 ,为纯系紫菜品
系从传统的形态鉴定到分子鉴定打下基础。
目前紫菜生活史存在的一个争论是壳孢子减
数分裂发生的时期 ,其结果为子代叶状体是否为
嵌合体 。应用微卫星标记的特异性单一位点特
征 ,追踪杂合丝状体的同源位点在子代叶状体中
的分布 ,从而可间接确定壳孢子减数分裂发生时
期。
从EST中获得的微卫星引物同基因组中筛选
的微卫星位点所设计的引物相比 ,多态性水平低 。
为了补充引物 ,应用磁珠法从坛紫菜叶状体基因
组中筛选微卫星位点的研究也在进行中 。
参　考　文　献
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ISOLATION OF MICROSATELLITE LOCI FROM dbEST OF
ALGAE PORPHYRA YEZOENSIS AND PRIMER AMPLIFICATION
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LIU Bi-Qian , ZENG Qing-Guo , LUO Qi-Jun , WANG Ya-Jun , LI Sheng-Hua
(Key Lab of Marine Biotechnology , NingboUniversity , Ningbo , 315211)
(The Institute of Ocean and Fishery of Ningbo , Ningbo , 315012)
Abstract　　To establish the molecular basis for the pure line conchocelis tests of algae Porphyra , marking mi-
crosatellite of the species was performed.However , the biggest obstacle is to obtain the sequence information for de-
signing primer on flanking regions.Comparing high cost for isolation microsatellite loci in genomic DNA , screening
microsatellite loci from public database is very easy and less expensive.In recent years , with increasing databases of
expressed sequence tags , microsatellite loci derived from EST have been reported for many species.
Microsatellites derived from EST databases are equivalent to those from cDNA libraries , as an EST is a se-
quenced cDNA.Thus , microsatellite lengths , mixtures of repeat types , and polymorphic nature of microsatellites
from cDNA and ESTs are identical.In this research , microsatellite loci were screened from EST database of Porphyra
yezoensis by on-line software Blasting.Total 714 loci were isolated from 20979 sequences in the database and 211 loci
(about 1.01% of the sequences in database)were un-redundant ones.Among these un-redundant microsatellite
loci , 35 loci(16.6%)were di-nucleotide that repeated no less than 7 times.AG/TC motif was dominant.176 loci
(83.4%)had tri-nucleotide core unit with dominant GGC/GCC motif that repeated no less than 5 times.GGC/GCC
motif also the most abundant , amount to 1/3 of the total loci , and AGC/GCT , AG/CT and TGC/GCA were less
abundant loci.Besides , the microsatellite loci were screened by software , so the microsatellites in perfect form were
the most common (168;79.6%)ones , followed by the imperfect form (34;16.1%)and compound form (9;
4.3%).These results were similar to the published papers regarding EST-SSRs.
From those 211 loci , 15 sequences were selected for designing microsatellite primers on the flanking regions us-
ing software Primer Premier 5.0.The criteria of the design were as followed:primer length within (20±2)bp , GC
content between 50%and 75%, melting temperature between 50℃and 65℃, expected product size between 100bp
and 300bp and no secondary structure.Among these selected sequences , 14 contained tri-nucleotide repeats and 1
was bi-nucleotide repeat.With those 15 primer pairs the transferring amplifications of interspecies were carried on in
3 wild and cultivated populations of P .haitanensis.Meanwhile , a wild population of P .yezoensis was checked as
the positive control.The amplification results showed that 13 primers produced bands in both P .yezoensis and P.
haitanensis , implying high conservation of these microsatellite primers in P.yezoensis and P .haitanensis.So , the
microsatellite primers derived from P.yezoensis can be used in genetic study of other species in Porphyra .Besides ,
co-dominance and high polymorphism make the microsatellite marker very useful in DNA fingerprint mapping and
identification of homozygote diploid.
Key words　　Porphyra yezoensis , EST , Microsatellite , Transferring amplification of interspecies
254　 海　　洋　　与　　湖　　沼 36 卷