全 文 ：第 2 卷增刊
l卯 8年 10月
水 产 学 报
JO U R N A L O F FI SH E IU ES O F CH IN A
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22
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(灭 t . , l男 8
细菌酶酶解条斑紫菜体细胞
及室 内人工育苗的研究
马凌波 王素娟 黄益澎 李 晖
(中国水产科学研究院东海水产研究所 , 上海 2 ( XX从 ) ) (上海水产大学渔业学院 , 2 《XX廷刀
摘 要 本文研究了从海洋细菌 seP “ 〔人〕m o n 之砧 sP . 中快速简便获得高效经济的细菌酶酶解条
斑紫菜 ( oP , 人, 7。 ,段 〔祀。 is) 体细胞及室 内人工育苗的过程 , 明确了影响酶解及细胞培养的内在 因素
及外部条件 , 诸如细菌培养基 、 细菌培养时间 、 渗透压 、 PH 及培养液成分等 , 获得 了最佳酶解条件和
较理想的培养效果 。 在细 菌培养 6 天 ;州 为 6 . 5 以及适当提高酶液渗透压的条件下 , 条斑紫菜体细
胞得率最高达 3 . 62 1 x l口 个 / 克种藻 。 细胞培养成活率在合适的条件下 可高达 70 % 以上 。 研究结
果为海藻细胞及原生质体分离研究及海藻体细胞育苗的推广应用打下了 良好的基础 。
关键词 条斑紫菜 , 细菌酶 , 酶解 , 室内人工育苗
单细胞及原生质体的分离及培养不仅是研究海藻细胞基础生理过程和实现杂交育种 、 遗
传操作的重要手段 ,而且还是室 内体细胞人工育苗得以实现的基础 。 利用细胞工程于海藻苗
种生产 , 特别是紫菜体细胞育苗 , 已于 19 84 年即开始进行 , 并经过多 年的研究而 日臻完善 [赵
焕登和张学成 19 8 4 ,方宗熙等 19 56 , 王素娟等 19 86 、 一9 87 ,戴继勋等 19 8 5 , w an g 等 一9 9 5 ] 。 然
而 , 以上所有的研究工作大都不可缺少地利用了海洋软体动物消化腺中分离获得的海螺酶 、 鲍
鱼酶等消化酶对红藻细胞壁 中的半乳糖 、甘露聚糖及木聚糖等所构成的胶质成分及微纤 丝结
构进行解离 。 由于这些海洋软体动物的来源 日趋减少 , 而且酶的制备方法繁琐 , 价格 昂贵 , 严
重地抑制了海藻细胞分离工作的进一步开展 。 而酶源的短缺 , 也使海藻体细胞人工育苗技术
在生产上的应用受到一定影响 。
利用海洋细菌制备微生物工具酶将是解决酶源短缺的有效途径 。 除卢澄清等 ( 19 83 )采用
腐烂法即利用微生物作用于紫菜获得体细胞外 , ujF iat 和 肠 ig at 「1987 」及 硒 z l lk a l l l i [ 19 9 2」从海
洋假单胞菌属 (几 e “面 m o二 )中分离获得 了酶制剂 , 对条斑紫菜进行了解 离 ; A r a k i 等 「19 87」从
踢or sP . 和 A e or m on 。 中也分离获得 了降解紫菜细胞壁的酶制剂 。 韩宝芹等 「19 9 7 ]从埃 氏交
替单胞菌 ( A let 0r 0 0n o esP aejt an )中分离获得褐藻酸降解酶
。 但是这些细菌酶的获得还只是少
量 ,并且制备方法较繁琐 , 尚未应用于海藻体细胞人工育苗 中 。 因此 , 本文研究 了从海洋细菌
中快速获得高效 、经济的细菌酶的方法 ,对条斑紫菜体细胞分离和培养进行多方面的试验 , 以
推动紫菜体细胞育苗技术在生产上有效地应用 。
收稿日期 : l男 7 一 肠 一 16
卢 澄清 , 李永棋 , 胡增森等 . 198 3 . 紫菜 叶状体 营养细胞的研究 1 . 条斑紫菜营养细胞 的分离 、 培养和长 成小紫 菜的观察
第一届 中国藻类学术讨论会论文集 , 45 一 49 .
J曾刊 马凌波等 :细菌酶酶解条斑紫菜体细抱及室 内人 _ l_ 育苗的研究
1 材料与方法
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1 细菌的培养及酶液的配制
1
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1
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1 菌种
由腐烂的条斑紫菜中获得 Ps e汕In o~ Ps . 菌株 。 该菌株具有酶解紫菜胶 质膜及细胞壁
成分的活性 。 菌种培养于 Z劝be n 2 2 1 6 E培养基仁M o rita 和 助be u1 95 〕。
1
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1
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2 产酶的发酵培养
发酵培养基为 2劝be n 221 6E液体培养基去除有机成分后 , 加紫菜胶质成分或 0 . 05 % 琼脂
粉制成 。 接种菌种于培养基 中 , 黑暗振荡培养 ,温度 20 ℃ 。
1
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1
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3 酶液的配制及使用
将培养了数天的菌液离心 30 分钟 ( 3以 ,〕pr m )后 ,取上清液 ,用孔径为 0 . 3胖m 的微孔滤膜抽
滤 ,并加入 1% C e l u lase “ On o z uk a ” R 一 10 ( Y A K U L T H O N SH A C O . L刀 ) . ) ,再用 l m o l/ L 的 HC I
或 N ao H 调整 p H 为 6 . 。 一 6 . 5 范 围内 。 渗透压分别加人不同比例的 N aC I进行调整 。 酶液配
制后放人 4℃冰箱中保存 。
2 种藻的处理
条斑 紫菜为 19 96 ` }三 2 月及 19 97 年 1 月采 自江苏如东海区养殃架上 , 保存及处理力一法见王
素娟等 [ 19 86 〕
试验前将种藻用毛笔洗刷多次 , 并用盐度为 26 的消毒海水冲洗数次 ,然后在 1% K l一 12溶
液 中浸泡 1分钟 ,再用消毒海水冲洗数次 。 将藻体用刀 片切碎 , 在消毒海水中清洗数次 , 滤干
称重待用 。
1
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3 细胞及原生 质体的酶解 、 收集和培养
细胞及原生质体的酶解 、 收集方法见王素娟等「19 8 6」。 细胞培养于直径 g cm 的培养皿中
(平面静止培养 )或直径 1c2 m 高 3c0 m 的玻璃瓶中 (立体充气培养 ) , 培养液为 M E S 培养液 , 定
期加人 NP 营养盐 [王素娟等 19 86 」。 培养密度为每 只培养皿 50 x l护细胞 (平面培养 )或 10 x
l了 / m L 一 20 x l护 / m L (立体培养 ) 。 每 3 天更换一 次培养液 。 光照周期为 12 :L 12 D , 光照 20 -
4D 拌mo 眺 / =nl ,培养温度为 18 一 20 ℃ 〕
1
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4 细胞的定期检查及采苗
在培养过程 中定期检查细胞的健康状况及发育情况 ,并对细胞存活率及发育状况进行统
计 。
当细胞发育至形成大量的细胞团或体细胞苗 ,且颜色开始转为淡黄色后 ,用毛笔将培养皿
中细胞团或体细胞苗刷下 ,加人一定量 的消毒海水 ,使之达 1 0以〕个 / m L 左右的浓度 ,倒人直
径为 sc m 高约 3 c0 m 的玻璃瓶中 , 并在瓶中放人一定长度的网绳 ,充气培养并附苗 。

增刊 马凌波等 :细菌酶酶解条斑紫菜体细胞及室内人工育苗的研究
2
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1
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1 细菌培养时间对紫菜酶解的影响
试验对培养不同天数的细菌菌液制备细菌酶 , 并进行酶效 比较 ,发现细菌培养时间的长短
对紫菜的酶解效果有一定影响 。 结果见表 l 。 由表 1可知 ,细菌酶的酶效在细菌培养至第 6 天
最高 ,第 3 天时酶效最低 。 而细菌在培养后第 1 、 2 天时制备的细菌酶酶液对紫菜几乎不酶解
或者酶解的时间增长 ,酶解效果很差 。 在培养 7 天以后 ,细菌酶的酶解效果 比第 6 天时稍差 ,
并随时间的延长而下降 。 因此 ,大量制备细菌酶的时间应选择在细菌培养 5 一 6 天后 。
表 1 细菌培养时间对条斑紫菜分离效果的影响
T妞b . I E饰eC st 优 山 1姆 优加 d e对al g 旧w 比皿 c d如 七幻如心叨
菌 培 养 天 数
丛翎胭州
143必沁绝奶832719
细一夭仍醉犯`.一.打7426
第 l 次
第 2 次
第 3 次
注 :表中数据为细胞获得率 ( x l护/克 )
2
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1
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2 酶液渗透压对条斑紫菜分离效果的影响
酶液采用盐度 26 的海水作为酶溶剂 ,在加人不同比例的 卜区口 后 ,得到不同渗透压下的酶
解结果如表 2 。
表 2 酶溶剂渗透压对条斑萦菜分离效果的影晌
I 知b . Z E口比 t 嘴 0 , 团盯廿c IP艰 . 叮e or ht e 曰业扣此 ,目视 n t on eC山 七幻妞垃犯一 .门 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 曰 .曰 . . . . .口 . . . . 组 别1 2 3 4 5酶溶剂 盐度 26 海水 + 0 . 11住幻 l/ L + 0 . 16 om l/ L细胞获得率 ( x l护 /克藻体 ) + 0 . 07 Il l DI/ LN以〕2 185 + 0 . 2 11刃】/ LN以〕, , 只S N a( 〕, 自石 N叔〕淡梵6
从表 2 可见 , 在一定范围内细胞得率随酶液渗透压的增大而增多 。 在第 5 组中 , 以盐度 26
海水加 0 . 2 m o U L N初C l 作为酶溶剂时 , 紫菜细胞得率高达 3 . 肠 5 x l护个 /克种藻 。 而不加盐
的 2 6%。海水作为酶溶剂即第 1 组只有 1 . 肠5 x l护个 / 克种藻 。 由此可见 ,酶液的渗透压对酶解
的效果影响很大 。
2
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1
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3 酶液 PH 对条斑紫菜分离效果的影响
试验对不同 PH 的酶液酶解紫菜的效果进行 比较 ,结果见表 3 。
表 3 酶液声对条斑紫菜分离效果的影响
飞抽b . 3 E肠改妇成 PH 血 ,阅. 柱c c d ls 七幻坛d on of P . 夕已邵昭九` 心
. . . . . . . . . . ~ . ~ ~ . ~
PH
细胞获得率 ( x l护 /克藻体 ) 0 毕11烈〕 互卫13汉 ) 丝10 10 二旦10 1 5 毕8 10
由表 3 可以看出 ,酶液 PH 在 6 . 0 一 6 . 5 时较为适宜 ,不仅获得 的细胞数量最多 , 而且细胞
比较健康 ,很少有死细胞 。 声 值低于 6 . 0 时 , 虽然酶效增高 , 但由于死细胞增多 ,最终获得 的
活细胞数仍不多 ,而且培养时因细胞受损害大而难以成活 。 PH 在 5 . 0 时 ,酶解 3 小时后 , 酶液
水 产 学 报 第 2 卷
中的藻体都 已发红死亡 。 PH 在 7 .0 和 7 .5 时 ,酶液仍获得 了一定量 的活细胞 ,但数量较少 ,而
且酶解时间增长 。
2
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2 条斑紫菜体细胞培养情况
2
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2
.
1 体细胞生长发育情况
在 20 ℃ 、 光照 20 一犯 拼m o u s耐 、 培养液为 M ES 的条件下 , 条斑紫菜体细胞的生长发育结
果见表 4 。
表 4 条斑紫菜体细胞培养情况 《% )
T ab
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4 R段刀 l st of ds ve lo p们祀 n t of , x n a d c 沈 us of p . y改。 四” 绍 (% )
培养天数 单细胞 双分细胞 四细胞 细胞团 体细胞苗 单抱子及苗
l 0
1 2
叩 . 7
功 . 2
29
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0
2
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9
10
.
3
10
.
2
0
.
4
5
.
2
18
.
8
从表 4 可看出 , 细胞在培养至 5 天时 , 有少部分的细胞二分裂 ;到第 8 天时 ,有一半的细胞
已二分裂或形成体细胞苗和细胞团 ,其中以二分裂的细胞数量最多 ,有个别的细胞 团开始放散
单抱子 ,到第 10 天 ,细胞 已大多分裂 ,但 2 个细胞的数量仍最多 ,细胞团和体细胞苗也有少量
增加 (图版 一 2 ) ,放散的单抱子达 5 . 0 % 左右 。 培养至第 12 天时 ,单抱子及单抱子苗已占较大
比例 , 达 10 % 以上 ,细胞团 、体细胞苗 比例增多 。 由此可见 , 在进行体细胞采苗时可选择在单
抱子放散前的第 5 一 8 天 。
从体细胞的发育趋势看 , 由体细胞直接发育成苗的个体较少 , 只占 10 % 左右 ,而大多数的
细胞发育成细胞团 ,再由细胞 团长出假根形成细胞苗 ,或 由细胞 团放散出单抱子形成单抱子
苗 。 在最终形成的幼苗中 ,单抱子苗 占了极大部分 (图版 一 a) 。
2
.
3 条斑紫菜体细胞培养成活率
条斑紫菜体细胞培养成活率试验共进行了 9 次 ,结果见表 5 。
表 5 紫菜体细胞培养成活率情况
护
n b
.
5 S u r v l、 , I邝 t es 优 c u ltU代 of os ~ t ie e el ls
酶解次数 种藻重量
(克 )
出细胞量
(
x 104 )
细胞获得率
(
x l了 /克藻体 )
3 天成活率
(% )
5 天成活率
(% )
誉〕 困 . 35
85
.
30
O
5 1
.
48
7 8
.
7 5
0
乏粥 . 7 2
0
仅 3 75
6 7
.
70
之盗3 . 79
27卯4930185271兜
7 6 5
2 0
.
7
3
.
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10 52 0
1 5 13 0
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74 9刃
10 7 74
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1 印 l
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1 0拟〕
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1 758
2 泉 X)
在 9 次试验中共有 6次成活率达到较高水平 (第 1次因种藻质量较差 ,所以全部死亡 ) , 而
增刊 马凌波等 : 细菌酶酶解条斑紫菜体细胞及室内人工育苗的研究
且细胞在培养 5天 以后成活率基本稳定 。 影响成活率的因素除酶解条件外 ,还包括种藻 、 培养
方式及培养条件等 。 因此 ,利用细菌酶酶解条斑紫菜 , 只要具有 良好的培养条件 , 而且种藻健
康 , 细胞成活率仍可达到大规模育苗的要求 。
2
.
4 体细胞室内人工采苗
利用体细胞能直接分裂成苗或形成细胞团释放抱子的规律 进 行 采 苗 。 在 细 胞 密 度 为
5 。叉) 个 / 1l l L 时 ,放人的 5 米苗绳在 l (x刃m L 水 中冲气采苗 。 第 5 天时检查 ,平均每个视野 ( 10
x lo )可看见 8 棵左右的小苗 ,以 6 一 8 个细胞 的小苗最多 。 至 30 天后苗绳上 已基本 附满小苗
(图版 一 4 ) 。
3 讨论
试验采用细菌酶对条斑紫菜进行酶解 ,在不同条件下都获得 了一定量的细胞和原生质体 ,
其中条斑紫菜体细胞得率最高达 3 . 62 1 x 10 7 / 克藻体 。 其酶效可以同海螺酶 、 鲍鱼酶等其它工
具酶的酶效相媲美 。
3
.
1 细菌酶的酶效与细菌培养时间的关系
对 seP “ 之fo m o二 sP . 的生长曲线测定后发现 ,细菌在接种后 24 小时基本处于生长延缓期 ,
第 2 4 小时起到 72 小时 ,细菌处于对数生长期 ,第 14 小时后活菌数量呈下降趋势 。 而细菌酶
在细菌培养至第 3 天后开始具有一定效果 ,并在第 6 天以后达到最高酶效 。 由此可见 ,酶效 的
变化和细菌的生长变化是相一致的 。
3
.
2 酶溶剂的成分对酶解效果的影响
试验中细菌酶酶溶剂的成分为海水 、紫菜胶质成分或琼脂及 N aC I等无机盐 。 这些成分都
较小地影响紫菜细胞的生理状况 , 因而获得 了较好的酶解效果 。 而 在 酶 液 中 加 人 适 量 的
Na CI
,提高酶液渗透压 ,可以大幅度提高体细胞得率 。 PH 则在 6 . 0 一 6 . 5 时较为合适 , 过高或
过低都影响酶解效果 。 这与海螺酶等其它工具酶酶解时的情况基本一致 。
3
.
3 影响细胞成活率的因素
试验利用所制备的细菌酶分离获得了大量的紫菜体细胞 ,然而细胞 的成活率受到多方面
因素的影响 。 首先种藻必须健康 ,否则将影响细胞成活率 (如表 5 中第 1 组 , 细胞获得量很高
但到第 3 天就全部死亡 ) 。 其次细胞分离过程 中合适的 PH 、 渗透压及酶解时间既可 以提高体
细胞得率 ,又能获得更多的健康细胞 ,从而提高成活率 。 另外培养时培养基条件 、温度 、光照及
培养方式也直接影响细胞的生长发育 。
本项 目由上 海水产 大学海藻生物技术实验室课题基金提供经费。 菌种 由上海水产 大学微生物教研室孙其焕 副教授鉴
定 , 特此感谢 。
30 水 产 学 报 第 2 卷
参 考 文 献
方宗熙 ,戴继勋 ,唐延林等 . 1性班晒 .紫菜细胞 的酶法分离和在水产养殖中的应用 .海洋科学 , 10 ( 3) : 46 一 47 .
王素娟 ,张小平 ,徐志东等 . l q 沁 .坛紫菜营养细胞和原生质体培养的研究 1 .海洋与湖沼 7 ( 3) : 2 17 、 2 1 .
王素娟 ,孙云龙 ,路安 民等 . 1男7 .坛紫菜营养细胞和原生质体培养的研究 n ,直接下海养殖实验研究 . 海洋科学 , 1 1 ( 1 ) : 1 一 7 .
赵焕登 ,张学成 . 19 3 1 .条斑紫菜营养细胞的分离和培养试验 . 水产学报 , 8 ( 3 ) : 197 一沁 1 .
韩宝芹 , 刘万顺 ,戴继勋等 . 1望刀 .褐藻酸降解菌的发酵培养及褐藻酸酶对褐藻细胞的解离作用 . 海洋科学 , 2 : 39 一 铭 .
戴继勋 ,包振民 ,唐延林等 . 1久盗3 .紫菜叶状体细胞的酶法分离及其养殖研究 . 生物工程学报 , 4 ( 2 ) : 13 一 137 .
户` a k i T , A o ik T ,苟 t出拍如永。 M . 1(犯 7 . R印咧 lon an d 啡e n a旧 it o n of P r o吻】愁 t s 丘习 n l嫩协勺伴 of OP 林” ” , 尧越` 匆记 C忱口 I v州田吐
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