全 文 ：木槿根瘤内生放线菌的分离及系统发育分析
张利敏,张利平
（河北大学生命科学学院,河北省微生物多样性研究与应用实验室，河北保定 071002）
摘 要：采用匀浆法利用 S,JA,BAP这 3种培养基从木槿根瘤内分离出 6株菌株并把菌株进行系统
发育分析。结果表明 S培养基分离效果较好；系统发育分析表明 4株小单孢菌属、2株野野村菌属、1株
马杜拉菌属。
关键词：木槿；植物内生放线菌；16S rDNA；系统发育分析
中图分类号：S564.+09 文献标识码：A 文章编号：1005- 4650（2009)02- 0005- 02
Isolation and Phylogenetic Analysis of Endophytic Actinomycetes
in Root- tubercle of Hibiscus syriacus
ZHANG Li- min,ZHANG Li- ping
(Key Laboratory ofMicrobial Diversity Research and Application, College of Life Sciences, Hebei University, Baoding,
Hebei 071002, China)
Abstract: The 6 strains were isolated respectively on S,JA,BAP three mediums from root- tubercle of Hibiscus syriacus by the nod-
ule- slicingmethod, and these strains were used to phylogenetic analysis. S mediumwas the best medium for isolating endophytic actino-
mycetes.The phylogenetic analysis results showed that 6 strains of endophytic actinomycetes in plants could be divided into 3 genus , in-
cluding 4 strain ofMicromonospora, 1 strains of Nonomuria and 1 strains of Actinomadura.
Key words: Hibiscus syriacus; endophytic actinomycetes in plants; 16S rDNA ;phylogenetic analysis
收稿日期：2009- 01- 24
植物内生菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生
活于健康植物各种组织和器官内部或细胞间隙的真菌或细
菌[1]。植物本身是一个复杂的微生态系统，在这个微生态系
中发挥重要作用的成员之一是内生放线菌，由于植物内生放
线菌生境的特殊性，决定了其不仅具有理论研究意义,而且
是潜力巨大一类重要的微生物新资源[2- 3]。
能在非豆科植物根部形成根瘤并具有固氮能力的弗兰
克氏菌属是最早被发现的内生放线菌。此后,世界各国又采
用不同的方法从约 8个属的非豆科植物根瘤中分离出内生
菌，但在国内外相关研究中，尚未见对木槿根瘤内生菌报道。
本实验通过对本实验室分离得到的木槿根瘤内放线菌系统
发育地位的研究，揭示植物内生放线菌菌种的多样性，丰富
放线菌的物种资源，为植物内生放线菌资源的开发与利用提
供有价值的资料。
1 材料与方法
1.1 植物样品的采集
从保定地区随机采集健壮木槿植物根瘤样品，带回实验
室 4℃冰箱保存。
1.2 菌株的分离与纯化
1.2.1 分离培养基
本实验采用的分离培养基主要 BAP 培养基、JA培养
基、S培养基。
1.2.2 分离方法
主要采用匀浆法。将木槿根瘤用无菌水冲洗 2～5次，置
于 70%的酒精溶液中浸泡 5 min。转置无菌条件下，无菌水
浸泡 10 min，用饱和 CaCO3溶液 10 min。无菌水冲洗数遍，
用玻璃匀浆器研磨匀浆，取匀浆液接种到培养基上。为了避
免杂菌的污染在培养基上加入 30μg/mL的制霉菌素和
30μg/mL的萘啶酮酸。
1.3 菌体培养
将分离纯化菌株接种到 Bennett液体培养基中 28℃摇
床培养 3～7 d，待菌株生长至对数期，镜检验纯，离心收集菌
体。- 20℃冷冻保存待用。
1.4 基因组 DNA的提取
基因组 DNA的提取采用改进的 FRED[4]法。
1.5 PCR 扩增 16S rDNA序列
PCR扩增 16S rDNA用通用引物，27f (E.coli 8- 27碱基:
5′ - GAG TTT GAT CCT GGC TCA G- 3′ )，1525r (E.coli
1525- 1545 碱 基 :5′ - AGA AAG GAG GTG TAC CAG
CC- 3′)。
PCR 扩增体系：采用 50?L体系，引物 27f(20μmol/L)
第 16卷第 2期
2009年 2月
现代农业科学
Modern Agricultural Sciences
Vol.16 No.2
Feb.2009
3 讨论
本实验采用匀浆法用 3种培养基对木槿根瘤内生菌进
行分离, 结果表明 S的分离效果及物种的多样性均好于 JA
和 BAP培养基。
从系统发育分析结果来看，木槿根瘤内放线菌种群较为
多样化，小单孢菌属在木槿根瘤内占大多数，未分离出弗兰
克氏菌。这些菌群在木槿根瘤内具有怎样的生物学作用，是
否具有固氮活性还需要进一步的探讨。利用 16S rDNA序列
分析方法分析植物内生放线菌的类群具有重要意义，但由于
16S rDNA序列分析这一方法只能将供试菌株确定到属，因
此，还需要通过 DNA- DNA杂交确定其种的归属。
参考文献
[1] 杨颖,陈华红,徐丽华.植物内生放线菌多样性研究[J].云南大
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[2] 文才艺，吴元华，田秀玲.植物内生放线菌研究进展及其存在的
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Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0 [J]. Molecular Biol-
ogy and Evolution 2007, 24: 1596- 1599.
1μL,引物 1525r (20μmol/L) 1μL, dNTP(10mmol/L) 1μL,
10×Buffer 5μL,Taq polymerase (2.5 U/mL) 0.5μL, ddH
2O40.5μL,基因组 DNA(50ng/μL) 1μL。
PCR扩增程序：先 95℃预变性 4分钟，再 95℃变性 40 s，
55℃退火 40 s，72℃延伸 1.5 min，进行 30个循环后，72℃后
延伸 10 min。
1.6 构建系统发育树
将所测的 16S rDNA序列用 BLAST方式与 Genbank数
据库中已知相关 16S rDNA序列进行比较，采用 Clustal W
1.4[5]软件进行多序列匹配排列,利用 MEGA 4.1[6]软件包中的
邻接法构建系统发育树分析其系统发育地位。
2 结果与分析
2.1 木槿根内菌株分离结果
从木槿根瘤内成功分离出 6株放线菌, 纯培养的菌株
49482、49485、49514、49481从 S培养基中获得，菌株 49506
从 JA培养基中获得，菌株 49508从 BAP培养基中获得。
2.2 菌株 16S rDNA序列的系统进化树的构建
通过将供试菌株与 GenBank等数据库中相应菌属的标
准菌株的 16S rDNA序列进行比较得知，6株菌株分属于 3
个菌属，其中小单孢菌属(Micromonospora)4 株，野野村菌属
(Nonomuria)1株，马杜拉菌属(Actinomadura)1株。所构建的系
统发育进化树见图 1。菌株 49514与 Actinomadura spadix的
进化距离最近为 99.69%。49481与 Nonomuria kuesten的进
化距离最近为 99.78%。49482、49485、49506、49508 与 Mi-
cromonospora pattaloongensis 的 进 化 距 离 最 近 分 别 为
99.76%，99.78%，99.68%，99.79%。
图 1根据 16S rDNA序列分析结果构建的供试菌株与相关菌株的系统发育树
6 现 代 农 业 科 学 2009年