全 文 ：华 南 理 工 大 学 学 报 ( 自然科 学版 )
第2 0卷第 4期 J o r n a ul o f S o u tC h hin a U n i v e r s i ty o f T e e hn o l o gy V o l . o ZNo . 魂
1 9 9 2年1 2月 ( Na t住 r a l S e ie n e e ) D e e e o b e r 1 99 2
玫瑰茄细胞生长及其花黄素产生的研究
蔡燕漩 郭
(华南理工大学
勇 彭志英
食品工程系 )
提 典 木文对玫瑰茄细胞培养生产花黄素进行了研究 。实验结果表明 ,细胞在含 1卜m ol / L
2
,
4 一 D 及 。 . 5件m ol / L K T的B 。 悬浮 培 养 基中生长良好 , 能产生较多的花黄 素 , 为 1 72
m g / L
, ;与细胞干重的2 . 1% 。 细胞的比生长速率为o . 2 8 2 d ~ 1 , 倍增时间为 5h9 , 色素产生的
二 _ 、 _ _ _ 、 d P _ _ . _ 、 _ _ _动力学方程为 : 示 = `” · ” “ ” 十 “ · `“ ”。` xo “ , 4 一 D 的浓度升高对色素的产生 有 抑 制 作
用 。 蔗糖的最适浓度为 3 % 。 培养基中有无 F e 卜十对产物形成的影响作用极微 , 而光照对细胞
胞生长和色素形成都是必需的 。
关键词 : 植物组 织 ; 花黄素 , 木桂属 ; /玫瑰 茄
天然色素用于食品着色 , 具有很大的安全性和实用价值 。
玫瑰茄的花冠呈黄色 , 其色素为花黄素 ( 又称黄酮素 ) , 花黄素除了用于食品特另! J
是糕点的着色外 , 其 中一大部分还具有维生素 P的功能 , 能够软化血.管 , 维持毛细 血管
的正常通透性 , 另外 , 花黄素具有多经基 , 表现有酚的性质 , 是一种很重 要 的 抗 氧化
剂 。
本研究旨在探讨利用玫瑰茄细胞生产花黄素的可行性 , 同时研究细胞生长及产物形
成的动力学规律 , 为生产花黄素打下 了理论基础 。
材扦与方法
植物细胞
切取玫瑰茄 ( H 击 i s o u 、 S ab da r if fa L in n) 花冠 、 幼果及嫩茎 , , 通过常规 组织培养
方法而获得 。
培养基
2
。
1 固体培养基
B
。 : 含2 %蔗糖 、 5件m o l / L Z , 4一 D , 0 . 5卜m o l / L K T 、 0 . 5% 琼脂 。
2
.
2 悬浮培养基
中国图书资料分类号 : Q 9 4 6 . 83 3
来稿日期 : 1 9 92年 1月 1 1日
竿 4期 蔡燕漩惊 : 丁班魁茄洲胞生决又其花黄素产生的研究
B : : 厂宁 3 %蔗糖 、 l 冬, ,飞1 0 1 / I J 2 . 4一 l〕 、 0 . 5 二 nr o l八子 K T 。 以上培 养 基 的 P H皆为
5
.
5
。
3 细胞培养方法与条件
1
.
3
.
1 同体培养方法 与条件
将经过消毒的玫瑰茄外 值体在无菌条件下接种于刀 5固体培 养 基 中 , 在 25 ℃ , 光照
1 5。。 l x 、 1 6 h / d 的 条件 下进行愈伤组织的诱 导培养 , 以后每隔大约 17 天 , 便 移 种 进行
继代培养 。
1
。
3
.
2 细胞悬浮培 养方法与条件
取 14 天种龄的疏松状愈伤组织 1克 , 悬浮于 2 5 m L 液体培养基中 , 于25 ℃ 、 光照强
度为 1 5 o o l x 、 光照时间为16 h cl/ 、 振荡速度为 1 2 o r / m in 的条件下振 荡培养 。
.
4 细胞浓度的测定方法
取 7个 1 0 毫升的三角瓶 , 各装入 25 毫升液体培养基 , 灭菌 , 放置冷却一定时间后 ,
分别接入 1 克经过一级培养的种龄为 5 一 7天的玫 瑰 茄 细 胞 , 于 25 ℃ 、 光 照 1 5 0 l x 、
1 6 h / d
、
1 2 o r / m in 下振荡培养 , 每隔 4 8小时 , 取出一瓶培养液 , 过滤收集细 胞 , 称取细
胞湿重 , 然后于 80 ℃下烘干 1 6小时 , 称取细胞干重 , 再换算为培养液中的细胞浓度 。
5 色素的测定方法
称取 1克湿细胞 , 浸泡于DI m l一 无水甲醇 中 , 用超声 波破碎仪 , 于 O℃冰浴 中 , 破碎三
次 , 每次 30 秒 , 间隔 1分钟 , 然后将溶液在 4 ℃下静置抽提 2 4小时 , 过滤 , 收集滤液 , 调
P H为 1 0 , 1J] 紫外分光光度计测定波长 2 7 5 n m 下的吸光度 A 2 7 : , 与标准曲线对 照 , 查得
色素浓度 。
6 标准曲线的绘制方法
取花黄素 ( 主要 含懈皮素 ) , 在 1 0 一 1 05 `C 下干燥 2小 }{寸, 配制 成 2 . 0 欠 l 。 一 ’ 。 p m
的贮存液 。 分另j}吸取 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 m I J定容至 s o m L , 在波长 2 7 5 n m 下测定 , 绘希!1
标准 曲线 。
2 结果与讨论
2
.
1 玫瑰茄悬浮细胞的生长规律测定
细胞的生长 曲线及色素产生曲线如下图 1所示 :
由上图可见 , 悬浮细胞的生长曲线呈 S型 , 从接种到第 4天 , 细胞分裂很少 , 而在经
机 华 南 理 工 大 学 学 报 第 0 2卷
禅妖的瀑滞期后 , 细胞迅速生长 , 于第1 0天达到最大量 , 为7 . s m g / L , 即对数 生长期
持续 6天 , 接着是细胞增殖减慢的平衡期和停止生长的衰老 期。
为求出细胞的比生长速率 , 将对数生长期的细胞干重的对数对时间作图 2 , 如下 :
1 0 x 10
刁32
袂.一
(曰飞日)侧倪铁司
160280
8 x 1 0一 ,
6 x l o
一 ,
(闷、.巴械堪十侧
2 X 10一 ,
0 2 4 6 8 10 1 2 1 4
墙养时间《d)
图1 细胞生长反色素产生曲线
x — x 细胞生长曲线O— O 色素产生曲线
O匕一一一 J- J ~ ~ ~ ~ 山 .4 6 忿 1 0 1 2培养时问《d)
图 2 细胞生长对数曲线
在指数生长期间 , 细胞的生长速率可以写为 :
d x
一不犷 二 产X
Q 乙 (
1 )
其中x 为细胞浓度 ( g / L )
1为细胞比生长速率 ( d 一 ` )
将 ( 1 ) 式两边对时间 t积分 :
r 二 t l
}
, 一 d x = 产` 一 〔 X
In x , 一 I n x 。 = 产t
In x
, = 产t + I n x 。 ( 2 )
小 1 X t月凡 1 1 1— = 拼 r万 o ( 3 )
对图 2用最小二乘法进行回归 , 得方程 :
In x
, = 0
.
0 0 1 + 0
.
2 8 2 t
对比式 ( 2 ) , 可知拼 = o . Z s Z d 一 `
若在枯时间内细胞量增加一倍 ( 与称为倍增时间 ) , 则根据式 ( 3 ) 有
( 4 )
1 x t , _
I n — = i n 乙 = 产子d
所 以倍增时间
I n Z I n Z
`“ 二不厂 “ 瓦丽百二 2 · 4 5 8 ( d ) = 5 9 · o h
由此可见 , 玫瑰茄细胞在上述 B 。悬浮培养基 中的比生长速率 为 。 . 2 82 d 一 ` , 细胞倍
第 4期 蔡燕漩等 : 玫瑰茄细胞生长及其花黄素产生的研究
增时间为 59 . 0小时 。
2
.
2 色素产生动力学方程的建立
色素产生曲线如图 1所示 。
由图可见 , 色素从第四天起便明显产生 , 第六天起产 生速率增大 , 于第十二天达到
最高量 , 为1 72 m 好 L , 并有延续保持这个产量的趋势。
比较色素产生曲线及细胞生长曲线 , 可知色素随着细胞的生长而产生 , 但当细胞的
生长达到平衡期时 , 仍有大量色素产 生 , 表明色素的产生并没有与细胞的生长呈偶联关
系 , 因此可建立色素产生的动力学方程为:
d P d劣
一丫甲 = a es ; t we + 拼x
a 艺 a T
( 5 )
d P / d x
. 、 , 。 、
一下二一 = 、 a 竹丁丁 + 卢 J x = 吸a 产+ 夕) x
Q r ` X U 不 ,
( 6 )
d P 二 _
. , . 、 一 ~ ,其甲 竹了 , -一 巴系王取迷度 气g /七 O)
U 不
拌一 细胞比生长速率 ( d一 ` )
a — 化学计量常数口— 比例常数 ( d 一 ’ )
x 一 细胞干重浓度 ( g / L )
在细胞生长平衡期 , 有拌 = 。 , 代入 ( 6 ) 式 ,
J
_ dP
得 . 了尸 = 口x
U 不
d P即 口= 一 , ( 7 )。 一 尸 x d t
根据式 ( 7 ) , 由细胞的生长曲线及色素的产生 曲线用计算机回归 , 可求得 口= 3 . 3 3 d “ ’
代 入式 ( 6 ) 中 , 有
d P
一 ~二- = 气“ 拌 + 3 。 3 3 3 ) X
d t
或 a 二 d P「黑 一 3、 X U 不 · 3 3 3 〕/ , ( 8 )
由前面知道 , 在细胞的对数生长期 , 产 = 0 . 2 82 d 一 ` , 代入式 ( 8 ) 中 , 同样 由 细胞
的生长曲线及色素的产生曲线可求得 a = 0 . 1 8 3 0
所以 , 最后得色素产生的动力学方程为 :
d P
1广 二 ( 3 。 3 3 3 + O。 1 8 3 0拌 ) x
U 不
华 南 理 工 大 学 学 报 第 20 卷
. . . . . . . . . . . . . . . .
-
` 门. . . . 曰. . . . . . . .
其 中 , 在细胞的对数生长期 , 拼 = o . 28 2 d 一 ’ , 在细胞的生长平衡期 , 拜 = 0 。
2
.
3 蔗糖浓度对细胞生长及色素产生的影响
实验结果如下图 3所示 :
可见 , 兼顾细胞生长及色素产生两方面 , 采用浓度为3 %的蔗糖是适宜的 。
2
.
4 培养基中的F +e 十对色素产生的影响
F e
十 + 可与花黄素结构中 3 ` 、 4` 位的轻基结合 , 因此本文试验 了培养基 中 含 F e 十 + 及
不 含 F e 十 十两种情况 , 实验结果如下图所示 :
几口.`Un甘ōO自`它上
ē闷、砧日à侧锐暇口反幽ǎ闷、切`)侧胜司俄
几口ù比ù已“弓自n甘t二,二吕!
曰.lr胜日
!
.
J` Ileses产J.. L
I
8 火 1 0 一 ,
XX`O月勺粗山
二、罗)姗冷理挤
0 2 一` - _ . 一 一 J~ ~ . 一 ~~ J一 ~ ~ `0 2 4 6 8 10 12 14
蔗摘浓度 ( % )
图 3 不同浓度的蔗糖对细胞生长及色素产生的影响
培养时间 ( d )
图 4 F “ 小 + 对色素产生的影响
O — O 培养基中含 F e + +x — 义培养基中不含F “ + `
八曰、四`à侧妊孤旧
20
、御18Q40.`!一l. .1ìló l卜l1 0 x 10一
ǎ司\罗à侧十盈寡
可见影响作用极其微弱 , 证明了培养基
中的 F e + 十不会改变花黄素 的 结 构 , 对其产
量也不影响 。
2
.
5 光照的影响
本实验比较了光照 1 5 0 0 l x 、 1 6丘/ d 以及
黑暗条件下的细胞在含 1林m ol / L Z , 4一 D及
0
.
5 件m ol / L K T 的 B 。 培 养 基中的悬浮培养
结果 , 细 胞 的 生 一民及色素的产生情况示于
下图 :
在黑暗条件下 , 植物细胞生长缓慢 , 增
殖很少 , 色素产量非 常低 。 而 光照 下 的细
胞 , 其生长及色素产生均较理想 。
8 x 1 0
一 ,
6 又 10 一 3
4 x 1 0 一 3
0 2 4 6 8 10 1 2 1 4
培养时间 ( d )
图 5 光照对细胞生长及 色素产生的影响
· — · 光照条件下的细胞生长曲线
O — O 黑暗条件下的细胞生长曲线△— △光照下的色素产生曲线x — x 黑暗下的色素产生曲线
参 考 文 献
〔 i 〕 C a P l a n , A . e t a l . S e i e n e e , 1 9 8 3
〔 2 〕 B e v a n , M . e t a l . N a t u r e . 1 9 5 3 ,
2 2 2
,
8 1 5
3 0 4
,
1 8 4
第 J期 蔡燕漩等 : 玫瑰茄细胞生长及其花黄素产生的研究 9 g
〔 3 〕 S a l a . C 。 et a l 。 P l a n t P h y s io l .5 9 8 1, 11 8 , 4 09
〔 4 〕 H a j i m e M i z u k a m i e t a l . P l a n t C e l l R e p o r t 1 9 8 8 , 7 : 5 5 3 一 5 56
〔 5 〕 郭勇 . 鼠尾草细胞生产迷迭香酸工业生化杂志 , 19 91 , ( 1 ) : 8
〔 6 〕 M . W . F o w l e r ` T r e n d s i n B i o t e e h n o l o g ; 1 9 8 6 v o l . 4 , N o . 8 , 2 1 4一 2 1曦`
〔 7 〕 M 。 M i s a w a e t a l 。 A p p l . B i o e h e m . B i o t e e h . v o l . 7 N o 。 3 2 0 5一 2 1 5
〔 s 〕 N i e k e l l , L . G . 1 0 5 0 : P l a n t T i s s u e C u l t u r e a s a S o u r e e o f B i o e h e m i a l s 。
E
.
J
.
S t a b a ( e d
.
) P P
.
2 3 5
一
2 6 9 C R C P r e s s
,
I n e
. ,
B o e a R a t o n
,
F l
.
S T U D IE S O N T H E G R OW T H O F R O S E L L E C E L L S
A N D T H E F O M A T IO N O F F L A V O N O ID S F R O M T H E M
C a i Y a n x u a n ; G u o Y o n g ; P e n g Z i y i n g
( D e p t
.
o f F o o d E n g
. ,
S o u t h C h i n a U n i v
.
o f
`
r e c h
.
)
A七s t r a c t T h i s t h e s i s 15 a b o u t t h e p r o d u e t i o n o f f l a v o n o i d s f r o m
t h e e u l t i v a t i o n o f r o s e l l e e e l l s
.
T h e r e s u j t s a r e a s f o l l o w s : B o t h
e a l l u s g r o w t h a n d f l a v o n o i d s y n t h e s i s a r e r e m a r k a b l y s t i m u l a t e d
w h e n l 卜m o l / L Z , 4 一 D a n d o 。 5卜m o l / L K T a r e s u P p l e m e n t e d t o t h e
B
。
m e d i u m
.
I n l h e e a s e
,
t h e s p e e i f i e g r o w t h r a t e o f e e l 之5 15 0 。 2 8 2
d a y
一 ` , t h e d o u b l e t i m e f o r e e l l g r o w t h 15 5 9
.
0 h r
,
t h e y i e ld o f f l a v o
-
n o i d s 15 1 7 2 m g / L w h i
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.
1%
e o m p a r e d w i t h t h e e e l l d r y w e i g h t
,
二 d t h · k `二 t`二 q二 t `。一“ ,一 i d p一 d一 t i。 · 15 : 祭= ( 3 . 3 3 3 +
0
。
2 8 3 0拼 ) x . H i g h e o n e e n t r a t i o n s o f Z , 或一 D h a v e i n h i b i t o r y e f f e e t s o n
f 1 a v o n o id f o r m a t i o n
.
T h e m o s t s u i t a b l e e o n e e n t r a t i o n o f s u e r o s e 15
3 %
.
W h
e t h e r t h e r e 15 F e
+ +
i n t h e c u l t u r e t h e e f f e e t s a r e n e x t t o
n o t h i n g b u t l i g h t 15 n e e e s s e r y f o r t h e g r o w t h o f e e l l s a r d t h e f o r m a
-
t i o n o f f l e v o n o id s
.
K e y w o r d s
: p l a n t t i s s u e s ; f l a v o n id e o m p o u n d s ; H i b i s e u s ; /
r o s e l l c