全 文 ：　文章编号：１６７４－１４８Ｘ（２０１３）０４－０２９５－０５
条斑紫菜ＴＰＳ基因０．６Ｋｂ片段的
原核表达及抗血清的制备
孟庆芹，王　斌，徐丽娟，孙牧君，郭宝太
收稿日期：２０１３－０５－０５
基金项目：山东省良种工程马铃薯番茄资源创新利用研究
作者简介：孟庆芹（１９８７－），女，山东日照人，硕士，研究方向：植物基因工程。
通讯作者：郭宝太，Ｅ－ｍａｉｌ：ｂｔｇｕｏ＠ｑａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
（青岛农业大学生命科学学院，山东 青岛２６６１０９）
摘要：以ｐＥＴ２２ｂ为起始载体，构建了条斑紫菜６－磷酸海藻糖合成酶基因（ＰｙＴＰＳ）０．６Ｋｂ片段的原核表达载体，
并命名为ｐＥＴ２２ｂ－ＰｙＴＰＳ０．６。重组菌ＢＬ２１（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｙＴＰＳ０．６）经ＩＴＰＧ诱导后，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示菌
体总蛋白的电泳图谱上有分子量约为２３ｋＤａ的特异性蛋白条带，即ＰｙＴＰＳ基因０．６Ｋｂ片段得到了原核表达。用
溶菌酶裂解细菌提取包涵体，再利用镍离子亲和层析柱从包涵体中纯化出ＴＰＳ重组蛋白。用获得的高纯度重组蛋
白作抗原免疫家兔获得了抗血清，间接ＥＬＩＳＡ测定显示一份抗血清的效价为１∶１６０００，另一份为１∶３２０００。本研
究制备的抗血清为进行转基因植物中ＰｙＴＰＳ基因翻译产物的免疫学检测奠定了基础。
关键词：ＰｙＴＰＳ基因；原核表达；镍离子亲和层析；重组蛋白；抗血清
中图分类号：Ｑ７８６，Ｓ８５２．４＋３ 文献标识码：Ａ　 ＤＯＩ：１０．３９６９／Ｊ．ＩＳＳＮ．１６７４－１４８Ｘ．２０１３．０４．０１３
Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　０．６Ｋｂ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｏｒｐｈｙｒａ　ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ　ＴＰＳ
Ｇｅｎｅ　ａｎｄ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｔｉｓｅｒｕｍ
ＭＥＮＧ　Ｑｉｎｇｑｉｎ，ＷＡＮＧ　Ｂｉｎ，ＸＵ　Ｌｉｊｕａｎ，ＳＵＮ　Ｍｕｊｕｎ，ＧＵＯ　Ｂａｏｔａｉ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｑｉｎｇｄａｏ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｑｉｎｇｄａｏ　２６６１０９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｓｉｎｇ　ｐＥＴ２２ｂａｓ　ｉｎｉｔｉａｌ　ｖｅｃｔｏｒ，ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ　ｏｆ　０．６Ｋｂ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｒｅｈａｌｏｓｅ－
６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅ（ＰｙＴＰＳ）ｆｒｏｍ　Ｐｏｒｐｈｙｒａ　ｙｅｚｏｅｎｓｉｓ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｎａｍｅｄ　ｐＥＴ２２ｂ－
ＰｙＴＰＳ０．６．Ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｓｔｒａｉｎ　ＢＬ２１（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｙＴＰＳ０．６）ｗａｓ　ｉｎｄｕｃｅｄ　ｗｉｔｈ　ＩＴＰＧ，ａｎｄ　ａ
ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂａｎｄ　ａｂｏｕｔ　２３ｋＤａ　ｗａｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔ
ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ＰｙＴＰｇｅｎｅ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｗａｓ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｓｔｒａｉｎ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｃｅｌｓ
ｗｅｒｅ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｌｙｓｏｚｙｍｅ　ａｎｄ　ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｉｅｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ．　Ｔｈｅ　ＴＰＳ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｐｕｒｉ－
ｆｉｅｄ　ｆｒｏｍ　ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ　ｂｏｄｙ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｙ　ｎｉｃｋｅｌ　ｉｏｎ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ａｎｄ　ｈｉｇｈ　ｐｕｒｉｔｙ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏ－
ｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅ　ｙｉｅｌｄｉｎｇ　ＴＰＳ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａｎｔｉｇｅｎ　ｔｏ　ｉｍｍｕｎｅ　ｔｗｏ　ｒａｂｂｉｔｓ　ａｎｄ
ｐｒｅｐａｒｅ　ａｎｔｉｓｅｒａ，ｉｎｄｉｒｅｃｔ　ＥＬＩＳＡ　ａｎａｌｙｓｅｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｔｉｔｅｒ　ｏｆ　ｏｎｅ　ａｎｔｉｓｅｒｕｍ　ｗａｓ　１∶１６０００，ａｎｄ　ａｎ－
ｏｔｈｅｒ　ｗａｓ　１∶３２０００．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｏｆ　ＰｙＴＰＳｇｅｎｅ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔ
ｗｉｌ　ｂｅ　ｆｅａｓｉｂｌｅ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ａｎｔｉｓｅｒａ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＰｙＴＰＳｇｅｎｅ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；ｎｉｃｋｅｌ　ｉｏｎ　ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｒｏ－
ｔｅｉｎ；ａｎｔｉｓｅｒｕｍ
　　海藻糖与麦芽糖都是含两个葡萄糖基的双糖，
但二者结构不同，海藻糖含α，α－１，１糖苷键，具有
特殊的功能。海藻糖可以提高复苏植物抗干旱与抗
脱水能力［１］。在细菌与酵母菌中，海藻糖可提高其
青岛农业大学学报（自然科学版）　３０（４）：２９５～２９９，２０１３
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｑｉｎｇｄａｏ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ （Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ）
对高渗透压、热激等胁迫的耐受性［２－３］。除了增强
生物的抗逆性外，海藻糖还具有调节糖代谢、调控基
因表达［４］等多种生物学功能。同时海藻糖可以作为
食品保鲜剂、化妆品保湿剂，有广泛的用途。
在海藻糖生物合成的 ＴＰＳ／ＴＰＰ途径中，６－
磷酸海藻糖合成酶（ＴＰＳ）与６－磷酸海藻糖磷酸酯
酶（ＴＰＰ）是两种关键酶。高等植物自身海藻糖含量
很低，起不到天然的抗逆保护作用。利用大肠杆菌
及酵母菌的ＴＰＳ基因转化植物，通过转化基因的
高水平表达实现海藻糖的积累，从而提高转基因植
物的抗旱、耐盐及抗寒等抗逆性，在水稻［５］、小麦［６］、
玉米［７］等作物中都已有报道。
ＴＰＳ基因转化植物时，以前采用的目的基因大
多来自大肠杆菌或酵母菌。本课题组克隆了条斑紫
菜的ＴＰＳ基因（ＰｙＴＰＳ）［８］，并将该基因导入水稻
获得了耐盐、抗旱性提高的转基因株系。条斑紫菜
是食用海藻，ＰｙＴＰＳ基因的来源是安全的，它作为
目的基因用于作物的转基因改良更适合。本研究目
的是实现该基因片段的原核表达，并利用重组蛋白
作抗原制备出抗血清，为进行转基 因 植 株 中
ＰｙＴＰＳ基因翻译产物的免疫学检测奠定基础。
１　材料与方法
１．１　质粒与菌株
克隆有ＰｙＴＰＳ基因０．６Ｋｂｐ片段的重组质粒
ｐＭＤ－ＰｙＴＰＳ０．６及该基因原核表达载体ｐＥＴ２２ｂ
－ＰｙＴＰＳ由本课题组在前期研究中构建，大肠杆
菌ＢＬ２１菌株由本实验室保存。
１．２　主要试剂与试剂盒
限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自大连宝生
物公司，ＤＮＡ回收及蛋白定量试剂盒为上海生工产
品。蛋白酶抑制剂（ＰＭＳＦ）、溶菌酶、咪唑及去氧胆
酸钠为 Ｓｉｇｍａ公司产品。蛋白纯化柱（ＨｉＴｒａｐ
Ｃｈｅｌａｔｉｎｇ　ＨＰ）为 ＨＥ　Ｈｅａｃｔｈｃａｒｅ产品。
１．３　基因片段原核表达载体的构建
用 Ｎｄｅ Ⅰ 和 Ｈｉｎｄ Ⅲ 双 酶 切 ｐＭＤ －
ＰｙＴＰＳ０．６，回收小的基因片段；用同样的酶双酶切
原核表达载体ｐＥＴ２２ｂ－ＰｙＴＰＳ，回收大的载体片
段。将回收的两个ＤＮＡ片段用Ｔ４ＤＮＡ连接酶连
接，连接产物转化感受态ＢＬ２１细胞，涂布氨苄青霉
素平板，获得抗性菌落。从抗氨苄菌落提取质粒进
行酶切验证，筛选出阳性克隆，并进行测序确认，其
重组质粒命名为：ｐＥＴ２２ｂ－ＰｙＴＰＳ０．６。
１．４　基因片段原核表达的诱导
挑取重组菌ＢＬ２１（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｙＴＰＳ０．６）的单
菌落接种于含１００μｇ／ｍＬ　Ａｍｐ的ＬＢ液体培养液，
３７℃培养过夜。将培养物按１％的比例接种于
２０ｍＬ含相同浓度Ａｍｐ的ＬＢ培养液，３７℃培养２ｈ
左右。当ＯＤ６００达０．６～０．９时，加１％培养液体积
的１００ｍｍｏｌ／Ｌ　ＩＰＴＧ，至终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ，３７℃
诱导培养４ｈ左右，离心收集菌体，－２０℃保存备用。
诱导前，取出１ｍＬ菌液作为０ｈ对照。用１２％ＳＤＳ
－ＰＡＧＥ电泳检测诱导结果。
１．５　包涵体的提取与重组蛋白的纯化
用溶菌酶裂解细菌后提取包涵体，用尿素溶解
包涵体，并用镍离子亲和层析柱从包涵体蛋白中纯
化出基因片段表达出的重组蛋白。蛋白纯化时，用
蛋白结合缓冲液（０．０２ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＨ２ＰＯ４，０．５ｍｏｌ／Ｌ
ＮａＣｌ，８ｍｏｌ／Ｌ尿素，２０ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑）溶解包涵体，
上柱后用此溶液洗涤纯化柱，最后采用蛋白洗脱缓
冲 液 （０．０２ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＨ２ＰＯ４，０．５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ，
８ｍｏｌ／Ｌ尿素，０．５ｍｏｌ／Ｌ咪唑）从纯化柱上洗脱重
组蛋白。
１．６　蛋白的透析、浓缩与定量
收集洗脱液并装入透析袋中，于４℃用 ＰＢＳ
（ｐＨ　７．４）透析２４ｈ，期间换透析液３次。用２０％
ＰＥＧ－６０００浓缩蛋白，蛋白的定量采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ
法，获得的蛋白溶液于－２０℃保存备用。
１．７　抗血清的制备
将蛋白样品的浓度调整至１ｍｇ／ｍＬ，由上海生
工公司免疫家兔制备抗血清。用重组蛋白包被酶标
板，采用间接ＥＬＩＳＡ法测定抗血清效价。
重组蛋白的制备及其电泳检测、抗血清效价的
测定等具体步骤参照本实验室采用的方法［９］。
２　结果与分析
２．１　基因片段原核表达载体的构建
质粒ｐＭＤ－ＰｙＴＰＳ０．６经ＮｄｅⅠ和ＨｉｎｄⅢ双
酶切后回收０．６Ｋｂ片段（图１，泳道３），ｐＥＴ２２ｂ－
ＰｙＴＰＳ经同样的双酶切后回收５．４Ｋｂ的载体片段
（图２，泳道３），两个片段的连接产物转化大肠杆菌
ＢＬ２１菌株后获得了抗氨苄的菌落。从抗性单菌落
提取质粒进行 ＮｄｅⅠ和 ＨｉｎｄⅢ双酶切，产生了
６００ｂｐ的基因片段和５３９７ｂｐ的载体片段（图３，泳
道３），酶切产物大小与理论预期相符，该重组质粒
就是ＰｙＴＰＳ基因０．６Ｋｂ片段的原核表达载体，命
名为ｐＥＴ２２ｂ－ＰｙＴＰＳ０．６。本次构建的结果就是
用 ＰｙＴＰＳ 基因 ０．６Ｋｂ 片段取代了 ｐＥＴ２２ｂ－
６９２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　青岛农业大学学报（自然科学版）　　　　　　　　　　　　　　　　３０卷　
ＰｙＴＰＳ中的ＰｙＴＰＳ基因，测序结果显示载体构建
正确（图４）。
图１　质粒ｐＭＤ－ＰｙＴＰＳ０．６的酶切图谱
Ｍ：ＤＬ５０００ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；１：质粒ｐＭＤ－ＰｙＴＰＳ０．６；
２：ｐＭＤ－ＰｙＴＰＳ０．６／ＮｄｅＩ；
３：ｐＭＤ－ＰｙＴＰＳ０．６／ＮｄｅＩ＋ＨｉｎｄⅢ
图２　质粒ｐＥＴ２２ｂ－ＰｙＴＰＳ的酶切图谱
Ｍ：λ－ＥｃｏＴ１４Ｉｄｉｇｅｓｔ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；
１：质粒ｐＥＴ２２ｂ－ＰｙＴＰＳ；２：ｐＥＴ２２ｂ－ＰｙＴＰＳ／ＮｄｅＩ；
３：ｐＥＴ２２ｂ－ＰｙＴＰＳ／ＮｄｅＩ＋ＨｉｎｄⅢ
２．２　基因片段的原核表达与重组蛋白的制备
重组菌ＢＬ２１（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｙＴＰＳ０．６）菌液中加
ＩＰＴＧ至１ｍｍｏｌ／Ｌ，３７℃诱导培养４～５ｈ。ＳＤＳ－
ＰＡＧＥ电泳结果显示经诱导后蛋白图谱中有一条分
子量约２３ｋＤａ的特异性的蛋白条带（图５箭头所
示），其大小和理论值相符，且蛋白表达量很大（图
５，泳道２～３），未经诱导的菌体蛋白中无此条带（图
５，泳道１）。
先提取包涵体，然后用镍离子亲和层析柱从包
涵体溶解液中纯化出重组蛋白，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳
显示纯化后的蛋白在电泳图谱上呈现单一蛋白条带
图３　质粒ｐＥＴ２２ｂ－ＰｙＴＰＳ０．６的酶切图谱
Ｍ：λ－ＥｃｏＴ１４Ｉｄｉｇｅｓｔ　ＤＮＡ　ｍａｒｋｅｒ；
１：质粒ｐＥＴ２２ｂ－ＰｙＴＰＳ０．６；２：ｐＥＴ２２ｂ－ＰｙＴＰＳ０．６／ＮｄｅＩ；
３：ｐＥＴ２２ｂ－ＰｙＴＰＳ０．６／ＮｄｅＩ＋ＨｉｎｄⅢ
图４　插入片段的测序结果（斜体部分为载体序列）
图５　基因片段原核表达的诱导
Ｍ：蛋白ｍａｒｋｅｒ；１：对照（未经诱导）；２－３：ＩＰＴＧ诱导
（图６，泳道２～３），结果表明已获得了高纯度重组蛋
白。对纯化的蛋白进行透析、浓缩后，用Ｂｒａｄｆｏｒｄ
蛋白定量法进行了定量。本次提取包涵体蛋白
６０．０８ｍｇ，纯化后得到１２．０１ｍｇ目的蛋白，蛋白溶
液的浓度为１．７５ｍｇ／ｍＬ。
７９２　４期　　　　　　　　　　孟庆芹，等：条斑紫菜ＴＰＳ基因０．６Ｋｂ片段的原核表达及抗血清的制备　　　　　　　　　
图６　重组蛋白的纯化
Ｍ：蛋白ｍａｒｋｅｒ；１：包涵体蛋白（未纯化）；２－３：纯化的重组蛋白
２．３　抗血清的制备及效价测定
用ＰＢＳ缓冲液将目的蛋白稀释至１ｍｇ／ｍＬ，家
兔的免疫与抗血清制备由上海生工公司完成。按的
Ａ／Ｃ值为２．０的标准判断，间接ＥＬＩＳＡ法测定抗
血清效价，一份抗血清的效价为１∶１６０００（表１）；另
一份抗血清的效价由生工测定，效价为１∶３２０００。
３　讨论
Ｐａｎ等克隆了结核分支杆菌的ＴＰＳ基因（Ｍｔ－
ＴＰＳ），该基因在大肠杆菌中可顺利表达，用镍离子
亲和层析法可纯化出重组蛋白，并确认重组蛋白具
有ＴＰＳ酶活性［１０］。Ｓｈｉｍａ等在大肠杆菌中表达了
水稻ＯｓＴＰＰ１与ＯｓＴＰＰ２基因，结果表明两个基因
表１　抗血清效价的测定结果
吸收值
（ＯＤ４５０）
抗血清稀释度
１∶５００　 １∶１０００　 １∶２０００　 １∶４０００　 １∶８０００　 １∶１６０００　 １∶３２０００　 １∶６４００
Ａ　 １．１４６　 １．０９３　 １．００８　 ０．８９３　 ０．７４７　 ０．５７０　 ０．４４９　 ０．３９３
Ａ／Ｃ　 ４．９９　 ４．７７　 ４．４０　 ３．７７　 ３．２６　 ２．４９　 １．９６　 １．７２
　　注：Ａ为反应孔测定值的平均值，Ｃ为阴性对照的平均值（０．２２９）。
表达的重组蛋白都具有ＴＰＰ酶活性，且重组蛋白不
稳定，５０℃处理４ｍｉｎ便失活，与天然ＴＰＰ酶有相似
的特点［１１］。ＴＰＳ、ＴＰＰ 基因的编码产物是 ＴＰＳ、
ＴＰＰ酶，研究表明通过测定ＴＰＳ或ＴＰＰ 基因原核
表达产物的酶活性阐述其编码功能是可行的。另
外，异源的ＴＰＳ基因在受体大肠杆菌的表达可以
导致其海藻糖含量的提高，从而导致菌体抗逆性的
提高，通过原核表达体系可以初步确定ＴＰＳ基因
的生物学功能。
ＰｙＴＰＳ基因在大肠杆菌中可表达出分子量约
１００ｋＤａ的特异蛋白［８］。本实验室的研究结果表明
ＰｙＴＰＳ基因可顺利进行原核表达，但重组蛋白的
纯化困难。带有Ｈｉｓ×６标签的ＰｙＴＰＳ重组蛋白很
难与杂蛋白区分开来，只靠调节洗涤与洗脱液中咪
唑的浓度不能获得高纯度重组蛋白。ＰｙＴＰＳ重组
蛋白纯化困难可能是由于该蛋白分子量大、结构复
杂，Ｈｉｓ×６标签很难外露引起的。
本研究构建了ＰｙＴＰＳ基因０．６Ｋｂ片段的原
核表达载体，表达出的重组蛋白在总蛋白中占的比
例很高，表达结果符合预期。同样采用镍离子亲和
层析柱，可以顺利纯化出０．６Ｋｂ片段表达出的产
物，获得了高纯度蛋白。结果表明上述ＴＰＳ重组蛋
白纯化困难的分析是成立的。本研究用获得的重组
蛋白制备出了抗血清，为进行转基 因 植 物 中
ＰｙＴＰＳ基因翻译产物的ＥＬＩＳＡ及 Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ－
ｔｉｎｇ检测奠定了基础。制备抗血清时，基因片段的
表达产物作抗原就可以达到要求，全长基因的表达
蛋白并不是必需的。
参考文献：
［１］Ｇｏｄｄｉｊｎ　Ｏ　Ｊ　Ｍ，ｖａｎ　Ｄｕｎ　Ｋ．Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｉｎ　ｐｌａｎｔｓ
［Ｊ］．Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，４（８）：３１５－３１９
［２］Ｈｏｔｔｉｇｅｒ　Ｔ，Ｓｃｈｍｕｔｚ　Ｐ，Ｗｉｅｍｋｅｎ　Ａ．Ｈｅａｔ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ａｃｃｕｍｕｌａ－
ｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｕｔｉｌｅ　ｃｙｃｌｉｎｇ　ｏｆ　ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　ｉｎ　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
［Ｊ］．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８７，１６９（１２）：５５１８－５５２２
［３］Ｓｔｙｒｖｏｌｄ　Ｏ　Ｂ，Ｓｔｏｒｍ　Ａ　Ｒ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ，ａｎｄ　ｅｘｃｒｅ－
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　ｉｎ　ｏｓｍｏｔｉｃａｌｙ　ｓｔｒｅｓｓｅｄ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　Ｋ－１２
ｓｔｒａｉｎｓ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ａｍｂｅｒ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ　ａｎｄ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ
ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ　ｔｒｅｈａｌａｓｅ［Ｊ］．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９１，１７３：１１８７－１１９２
［４］Ａｇｈｄａｓｉ　Ｍ，Ｓｍｅｅｋｅｎｓ　Ｓ，Ｓｃｈｌｕｅｐｍａｎ　Ｈ．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ
ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ｉｎ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ　ｕｎｄｅｒ　ｔｒｅｈａ－
ｌｏｓｅ，ｓｕｃｒｏｓｅ　ａｎｄ　ｓｏｒｂｉｔｏｌ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，２００８，２（４）：２０９－２３０
［５］Ｊａｎｇ　Ｉ　Ｃ，Ｏｈ　Ｓ　Ｊ，Ｓｅｏ　Ｊ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｆｕ－
ｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｇｅｎｅｓ　ｆｏｒ　ｔｒｅｈａｌｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
ｓｙｎｔｈａｓｅ　ａｎｄ　ｔｒｅｈａｌｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎ－
ｉｃ　ｒｉｃｅ　ｐｌａｎｔｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｓ　ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｂｉｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓ
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｓｔｕｎｔｉｎｇ　ｇｒｏｗｔｈ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２００３，
１３１：５１６－５２４
８９２　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　青岛农业大学学报（自然科学版）　　　　　　　　　　　　　　　　３０卷　
［６］康旭升，刘立科，刘根齐，等．小麦中Ｐｒｄ２９Ａ启动子的诱导表
达活性及大肠杆菌海藻糖合成酶基因的转化［Ｊ］．农业生物技
术学报，２００７，１５（３）：４３４－４３８
［７］Ｄｏｎｇ　Ｃ　Ｌ，Ｚｈａｎｇ　Ｍ　Ｌ，Ｚｈａｎｇ　Ｙ　Ｑ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｔｒｅｈａｌｏｓｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅ（ＴＰＳｇｅｎｅ）ｉｎｔｏ　ｃｏｒｎ　ｉｎｂｒｅｄ　ｌｉｎｅ　ａｎｄ　ｉ－
ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．Ａｆｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏ－
ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１１，１０：１５２５３－１５２５８
［８］Ｗａｎｇ　Ｇ　Ｌ，Ｚｈａｏ　Ｇ，Ｆｅｎｇ　Ｙ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ
ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ｓｅａｗｅｅｄ　ｔｒｅｈａｌｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．
Ｍａｒｉｎｅ　Ｄｒｕｇｓ，２０１０，８：２０６５－２０７９
［９］隋炯明，何心凤，郭真，等．马铃薯卷叶病毒缺失突变ＣＰ基因
的原核表达及抗血清的制备［Ｊ］．园艺学报，２０１２，３９（１０）：
１９４９－１９５７
［１０］Ｐａｎ　Ｙ　Ｔ，Ｃａｒｒｏｌ　Ｊ　Ｄ，Ｅｌｂｅｉｎ　Ａ　Ｄ．Ｔｒｅｈａｌｏｓｅ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｓｙｎ－
ｔｈａｓｅ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ
ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｅｎｚｙｍｅ［Ｊ］．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，
２００２，２６９：６０９１－６１００
［１１］Ｓｈｉｍａ　Ｓ，Ｍａｔｓｕｉ　Ｈ，Ｔａｈａｌａ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ－
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｒｉｃｅ　ｔｒｅｈａｌｏｓｅ－６－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｓ　ｓｕｐｐｏｒｔｓ
ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｓｅ　ｐｌａｎｔ　ｅｎｚｙｍｅｓ．ＦＥＢＳ　Ｊｏｕｒｎａｌ，
２００７，２７４：１１９２－１２０１
（上接２８５页）
值，苗期至花针期是一级侧根发育的重要时期；在
结荚期至饱果期，花生发育及营养主要转向荚果或
转向多级侧根的发育，一级侧根发育迟缓直至停止。
　　各株型花生在苗期，侧根主要进行略向下接近
水平生长，花生根系形态为倒立的圆锥体型结构。
从苗期末期一直到饱果期，花生根系形态上部为钝
圆锥体结构；中间为近似圆柱体型的立体网状结
构；下部为不规则的倒圆锥体结构。
参考文献：
［１］禹山林，闵平．花生高产优质实用新技术［Ｍ］．北京：台海出版
社，２００３：３－６
［２］封海胜，徐宜民，万书波．花生育种与栽培［Ｍ］．北京：农业出版
社，１９９３：１９７－２００
［３］刘朝荣．试验的设计与分析［Ｍ］．武汉：湖北科学技术出版社，
１９９０：２６５－３１７
［４］洪彦彬，周桂元，李少雄，等．花生根部特征与地上部分性状的
相关性分析［Ｊ］．热带作物学报，２００９，３０（５）：６５７－６６０
［５］任小平，姜惠芳，王圣玉，等．花生根部性状的遗传分析［Ｊ］．植
物遗传资源学报，２００７，８（４）：３９２－３９５
［６］任小平，姜惠芳，廖伯寿．不同类型花生根部性状的初步研究
［Ｊ］．中国油料作物学报，２００６，２８（１）：１６－２０
［７］贾立华，赵长星，王月福，等．不同质地土壤对花生根系生长、分
布和产量的影响［Ｊ］．植物生态学报，２０１３，３７（７）：６８４－６９０
［８］丁红，张智猛，戴良香，等．干旱胁迫对花生根系生长发育和生
理特性的影响［Ｊ］．应用生态学报，２０１３，２４（６）：１５８６－１５９２
［９］徐亮，王月福，程曦，等．施磷对花生根系生长发育和产量的影
响［Ｊ］．花生学报，２００９，３８（１）：３２－３５
９９２　４期　　　　　　　　　　孟庆芹，等：条斑紫菜ＴＰＳ基因０．６Ｋｂ片段的原核表达及抗血清的制备