全 文 ：大孔树脂分离纯化巴豆中木兰花碱工艺研究
曾 宝１，２，李生梅１，２，唐君苹１，２，刘常青１，２，林 吉１，２，赖小平１，２＊
（１．广州中医药大学，广东 广州５１０００６；２．东莞广州中医药大学中医药数理工程研究院，广东 东莞５２３８０８）
摘 要：目的：优化大孔树脂分离纯化巴豆中木兰花碱的工艺条件。方法：采用 ＨＰＬＣ法测定木兰花
碱，筛选ＡＢ－８，ＨＰＤ４００，ＡＤＳ－１７，ＮＫＡ－９，Ｄ１０１树脂对木兰花碱的吸附和解吸附能力，并优化分离纯化
条件。结果：优选出Ｄ１０１树脂，上样液浓度为生药１．５ｇ／ｍＬ，吸附流速１．５ＢＶ／ｈ，药材量：树脂量为６
∶１；分离纯化条件为：先用４ＢＶ水冲洗除去不吸附杂质，再用３ＢＶ ８％乙醇除去大极性干扰杂质，最后
用４ＢＶ ２３％乙醇冲洗收集目标滤液。结论：该方法简便易行，适用于巴豆中木兰花碱的精制与纯化。
关键词：巴豆；木兰花碱；大孔树脂；纯化
中图分类号：Ｒ２８４．１ 文献标识码：Ａ 文章编号：１６７３－２１９７（２０１２）０６－００２０－０３
收稿日期：２０１２－０２－２８
基金项目：国家科技部重大新药创制专项（２００９ＺＸ０９１０３－３８８）
作者简介：曾宝，男，广州中医药大学助理研究员，研究方向为中药新药与药代动力学。
通讯作者：赖小平，男，广州中医药大学教授，研究员，博士生导师。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｘｐ８８＠ｇｚｈｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ。
巴豆为大戟科植物巴豆的干燥成熟种子，主产于西南
及福建、湖北、湖南、广东、广西等地。性辛，热；有大毒，归
胃、大肠经。内服泻下寒积，逐水消肿，祛痰利咽，外用蚀
疮，可用于恶疮疥癣［１］。近年来，大量研究表明巴豆中生物
碱类成分具有显著的抗肿瘤作用，如能诱导人肝癌ＳＭＭＣ－
７７２１细胞、人胃腺癌ＳＧＣ－７９０１细胞等肿瘤细胞凋亡［２，３］
。
２．７ 稳定性试验
精密吸取新制备的供试品溶液，每隔２ｈ进样测定１
次，共测定６次。结果供试品中的大黄素的ＲＳＤ为０．８６％，
表明供试品溶液在１２ｈ内稳定。
２．８ 回收率试验
精密称取已知含量的供试品粉末（批号０７０１０１），分别
加入质量浓度为３７．６４μｇ／ｍＬ的大黄素对照品溶液３、４、
５ｍＬ，同“２．３”项下方法，制成供试品溶液，吸取１０μＬ，进样
分析２次，记录色谱图，计算回收率，结果见表１。
表１ 回收率试验
样品中含
量（ｍｇ／Ｌ）
加入量
（ｍｇ／Ｌ）
测得量
（ｍｇ／Ｌ）
回收率
（％）
平均回收
率（％）
ＲＳＤ
（％）
０．１５１２ ０．１１２９ ０．２６２９ ９８．９
０．１５１２ ０．１１２９ ０．２６３３ ９９．３
０．１５０４ ０．１５０６ ０．３００１ ９９．４
９９．４７ ０．３７０．１５０４ ０．１５０６ ０．３００７ ９９．８
０．１５１８ ０．１８８２ ０．３３８１ ９９．０
０．１５１８ ０．１８８２ ０．３３８９ ９９．４
２．９ 样品含量测定
参照“２．３”项下方法操作，制备供试品溶液，精密吸取
样品溶液，注入液相色谱仪，依法测定，结果见表２。
表２ 样品含量测定结果
批号
大黄素
含量（ｍｇ／粒）
平均含量
（ｍｇ／粒）
ＲＳＤ（％）
０６１２０３ ０．０４１３
０７０１０１ ０．０４２０
０７０２０３ ０．０４２５ ０．０４２２ １．３０
０７０２０５ ０．０４２３
０７０３０１ ０．０４２７
本品每粒以大黄素计算，暂定为：不得少于０．０３８３ｍｇ。
３ 讨论
大黄素是分布最广泛的一种蒽醌类物质，具有保肝利
胆、降脂消炎等多种生物活性，是虎杖和大黄主要有效成分
之一［３］。ＨＰＬＣ测定肝脂消胶囊中大黄素含量的方法学考
察结果表明，在２５４ｎｍ检测波长下，以甲醇－０．１％磷酸（８０：
２０）为流动相，该方法在４．１２２μｇ／ｍＬ～４１．２２μｇ／ｍＬ间线性
关系良好，重复性和稳定性良好，加样回收试验回收率达
９９．４７％，ＲＳＤ值为０．３７％。该方法准确，稳定可靠，可作为
大黄素的定量控制方法。
本研究参照《中华人民共和国药典》２０１０版一部虎杖项
下大黄素含量测定方法制订肝脂消胶囊的含量测定方法，
通过５个批次大黄素的含量测定，得到足够数据表明各批
样品大黄素含量均处于０．０３８３ｍｇ／粒以上，且各批样品含
量均高于这一数据，据此确定本品含大黄素不少于
０．０３８３ｍｇ／粒。经过上述 ＨＰＬＣ试验，为肝脂消胶囊的质
量标准的提高提供了大量实验数据，在生产中能更好地控
制本制剂的质量。
参考文献：
［１］ 王娟，袁绍莉．ＨＰＬＣ法测定护肝宁胶囊中大黄素的含量［Ｊ］．
亚太传统医药，２０１０，６（１０）：２５－２６．
［２］ 金鑫，曲佳，李时放．ＨＰＬＣ法测定麻仁胶囊中大黄素及大黄
酚的含量［Ｊ］．天津药学，２０１１，２３（４）：１７－１９．
［３］ 裴莲花，吴学，金光洙．虎杖化学成分及药理作用研究现状
［Ｊ］．延边大学医学学报，２００６，２９（２）：１４７－１４９．
（责任编辑：姜付平）
—０２—
木兰花碱是巴豆总生物碱的重要生物碱，也是重要的活性
物质成分，具有抑制α－葡萄糖苷酶活性［４］，抑制ＨＥＲＧ钾通
道蛋白表达［５］，值得深入研究及进一步开发。我们首次从
巴豆中分离得到木兰花碱，并建立了 ＨＰＬＣ方法测定巴豆
中木兰花碱含量（另文报道）。本文为利用大孔树脂分离纯
化巴豆中木兰花碱的工艺研究，优选出切实可行的方法分
离纯化巴豆中木兰花碱，得到高纯度的生物碱样品，以便开
展进一步的试验研究。
１ 仪器与试剂
巴豆药材购于成都五块石药材市场，经广州中医药大
学赖小平研究员鉴定为巴豆Ｃｒｏｔｏｎ ｔｉｇｌｉｕｍ Ｌ．。实验用树
脂购于安徽三星树脂科技有限公司。对照品为木兰花碱
（实验室分离得到，纯度＞９８％）。
Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－２０ＡＴ高效液相色谱仪（配ＳＩＬ－２０Ａ自动
进样器，ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ二极管阵检测器，ＣＴＯ－２０Ａ柱温箱，
Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ色谱工作站，日本Ｓｈｉｍａｄｚｕ公司），
Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８色谱柱（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ）。
ＭＥＴＴＬＥＲ ＴＯＬＥＤＯ ＡＢ２０４－Ｎ电子分析天平，甲醇、
乙腈液相为色谱纯（Ｍｅｒｃｋ），其它试剂均为分析纯。
２ 试验与结果
２．１ 木兰花碱含量测定
（１）色谱条件：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｅｃｌｉｐｓｅ ＸＤＢ－Ｃ１８（２５０ｍｍ×４．６
ｍｍ，５μｍ）色谱柱；木兰花碱含量测定时方法按表１进行梯
度洗脱，柱温３０℃，体积流量：１．０ｍＬ·ｍｉｎ－１；检测波长：
２２０ｎｍ，记录时间４５ｍｉｎ，进样量１０μＬ。理论塔板数按木兰
花碱计算不低于６ ０００。
表１ 木兰花碱含量测定梯度条件
ｔ／ｍｉｎ Ａ（甲醇） Ｂ（０．１％磷酸）
０ ５ ９５
２０ ５０ ５０
３０ ９５ ５
（２）对照品溶液的配制：精密称取木兰花碱对照品适
量，加水制成每１ｍＬ含木兰花碱４８９μｇ的溶液，作为对照品
母液溶液。
（３）标准曲线的绘制：精密吸取对照品溶液０．２５、０．５、
１．０、２．０、３．０、４．０、５．０ｍＬ分别置于１０ｍＬ容量瓶中，用水
定容至刻度，照高效液相色谱法测定，进样量为１０μＬ。以峰
面积Ｙ为纵坐标，以样品进样量 Ａ为横坐标，绘制标准曲
线，并计算回归方程。Ｙ＝５×１０９ Ａ＋６８８３７。ｒ＝０．９９９６，Ａ
在０．１～２．４５μｇ／ｍＬ范围内呈良好线性关系。
（４）供试品溶液的制备：取巴豆种子药材１０ｇ，打粉过二
号筛，后用乙醚索氏提取去油后，药渣用１０倍量４０％乙醇
回流提取２次，每次４０ｍｉｎ，合并滤液；过微孔滤膜，即得液
相样品，进样量为１０μＬ。
２．２ 工艺条件与参数优化
（１）木兰花碱的提取工艺：取巴豆种子药材１ ０００ｇ，打
粉过二号筛，用乙醚索氏提取３ｈ去油后，药渣用１０倍量
４０％乙醇回流提取２次，每次４０ｍｉｎ，过滤，合并提取液后回
收溶剂，浓缩至１．５ｇ生药／ｍＬ，即得木兰花碱提取液，备用。
（２）树脂型号的选择：取５种处理好的大孔吸附树脂
（ＡＢ－８，ＨＰＤ４００，ＡＤＳ－１７，ＮＫＡ－９，Ｄ１０１）各 ５ｇ，分别置
１００ｍＬ锥形瓶中，精密加入“（１）”中样液，每份２５ｍＬ，静置
２４ｈ，时时振摇，使其吸附达到平衡后滤过。ＨＰＬＣ法测定
滤液中木兰花碱含量，按下式计算吸附率和解析率：
比吸附量＝（上样液木兰花碱质量－吸附后剩余液木
兰花碱质量）／干树脂质量
吸附率＝（上样液木兰花碱质量－吸附后剩余液木兰
花碱质量）／上样液木兰花碱质量×１００％
解析率＝解析液木兰花碱质量／（上样液木兰花碱质量
－吸附后剩余液木兰花碱质量）×１００％
表２ 工艺条件与参数优化比较
树脂型号
比吸附量
（ｍｇ／ｇ）
吸附率
（％）
解析质量
（ｍｇ）
解析率
（％）
ＡＢ－８ ２．１０ ８６．４４ ０．０３ ０．２５
ＨＰＤ－４００ ２．１６ ８９．２９ ９．０９ ８４．０１
ＡＤＳ－１７ ０．０７ ３．０６ ０．３４ ９２．１１
ＮＫＡ－９ ０．８２ ３４．１１ ４．０５ ９８．１２
Ｄ１０１ ２．３２ ９５．７９ ９．９８ ８５．９２
结果分析：比较５种不同型号的树脂，非极性的Ｄ１０１
树脂对木兰花碱的吸附能力最好，ＡＤＳ－１７、ＮＫＡ－９的解析
能力虽然较好，但是由于其低吸附能力故不能采用，而Ｄ１０１
的解析能力也较优；故选择Ｄ１０１大孔吸附树脂作为木兰花
碱纯化的专用树脂。
（３）上样浓度考察：将“（１）”中样品溶液，分别稀释或浓
缩为含药材量０．２５、０．５、１．０、１．５、２．０ｇ／ｍＬ的水溶液进行
吸附 试 验，比 吸 附 量 分 别 为 ２．０７、２．１２、２．３７、２．４０、
２．３８ｍｇ／ｇ，结果分析：当上样浓度相当于生药１．５ｇ／ｍＬ时
药液的比吸附量最高，且药液的体积和浓度比较合适。
（４）树脂最大吸附量的考察：将１．５ｇ（生药）／ｍＬ的提取
液加入预处理好的１０ｇ Ｄ１０１树脂柱（装柱直径１．５ｃｍ），以
０．５ＢＶ／ｈ的流速动态吸附，水自上而下冲洗，收集流出液，
测定木兰花碱的含量，计算无泄漏流出的体积并观察从泄
漏开始到饱和吸附之间流出液的浓度变化，确定树脂的最
大吸附量，见图１。结果分析：提取液自上样后流出液颜色
变淡，从图１可知，从上样量为４５ｍＬ时开始有泄露的趋势，
当上样量为５０ｍＬ以后时，泄露已很明显，故初步确定树脂
的最佳吸附比为药材量∶树脂量＝６∶１。
图１ 大孔树脂对木兰花碱的动态吸附曲线
（５）药液上柱的流速考察：取５份１．５ｇ／ｍＬ的提取液，
分别通过装有已处理好的 Ｄ１０１树脂柱，流速分别控制为
０．５、１．０、１．５、２．０、３．０ＢＶ／ｈ，收集流出液，按上述方法测定
木兰花碱含量。理论上流速越小，树脂的相对吸附量越大。
试验也显示了这种趋势，但同时也表明在流速低于２．０时
成分损失并无显著的差别，从缩短时间周期考虑，以流速
１．５ＢＶ／ｈ为宜。
（６）洗脱剂的筛选：按上述条件已吸附好样品的树脂依
—１２—
次用水，８％乙醇，２３％乙醇，３０％乙醇，４０％乙醇，５０％乙
醇，６０％乙醇，７０％乙醇，８０％乙醇，９０％乙醇洗脱，分别收
集洗脱液，按上文方法测定木兰花碱含量。结果见图２。结
果分析：水洗、８％乙醇洗脱液中几乎检不出木兰花碱，
１５％、２３％乙醇洗脱液中木兰花碱的含量最高，基本全部可
以洗脱出来。大于３０％乙醇洗脱的量很少且杂质含量增
高。故选择先用水、８％乙醇洗脱除杂后，再用２３％乙醇冲
洗柱体积，收集目标成分。
图２ 木兰花碱不同溶剂洗脱曲线
（７）洗脱溶剂用量的考察：①除杂溶剂用量考察：用预
处理好的树脂装柱，取“（１）”项下提取液，按照上述最佳纯
化工艺上树脂柱，再用不同倍量（柱体积）的８％乙醇洗脱，
洗脱体积流量为１．５ＢＶ／ｈ，收集洗脱液，测定木兰花碱的含
量。结果表明水洗脱倍量在４ＢＶ 时，已经最大程度去除了
不吸附性杂质；３ＢＶ ８％乙醇时可除去大极性成分，故确定
先用４ＢＶ水除去不吸附的杂质，后用３ＢＶ ８％乙醇除去大
极性成分。②收集溶剂用量考察：取上述除好杂质的树脂，
用２３％乙醇以１．５ＢＶ／ｈ的流速冲洗柱子，按１个柱体积为
１个收集量，分段收集，测定木兰花碱的含量。结果表明第
５段流出的木兰花碱的量已经较低，不需要继续收集，所以
确定２３％乙醇洗脱倍量为４ＢＶ。
３ 验证试验
大孔树脂纯化工艺验证试验：称取３批巴豆药材每份
１００ｇ，按“２．２”提取工艺提取，选取Ｄ１０１大孔树脂，按上述
优化条件进行分离纯化，进行验证实验，结果见表３。结果
分析：本方法简便可行，可用于木兰花碱的分离纯化。
表３ 大孔树脂纯化木兰花碱工艺验证
批号 上样质量（ｍｇ）吸附率（％） 洗脱率（％） 纯度（％）
１１００００１ ８０８．２ ９４．５６ ８０．０３ ４３．７
１１００００２ ８０５．６ ９５．７１ ７９．４４ ４２．４
１１００００３ ８０９．６ ９６．０１ ８０．１９ ４５．０
４ 讨论
巴豆生物碱因其显著的抗肿瘤活性，越来越受到学者
们的重视，但却鲜有报道其具体的化学成分，分离出的有异
鸟嘌呤和巴豆苷。笔者首次从巴豆中分离得到木兰花碱，
本文皆在探讨一种大孔树脂纯化分离木兰花碱的方法，为
进一步分离得到较高纯度的木兰花碱提供前期工艺路线及
工艺优化条件参考。实验通过对不同类型不同型号树脂的
筛选，证明Ｄ１０１对木兰花碱具有良好的吸附和解析性能。
利用大孔树脂进行木兰花碱的分离纯化，重现性好，成本可
控，污染少，易于实践。
在巴豆大孔树脂纯化的基础上，利用制备型液相分离
得到纯度分离大于９８％的木兰花碱，实验结果为巴豆的活
性作用提供了重要的物质基础，也为巴豆药材质量提高提
供了重要依据。
参考文献：
［１］ 国家药典委员会．中国药典［Ｓ］．一部．北京：化学工业出版
社，２００５：７４．
［２］ 陈武，陈鹏英，刘鹏，等．巴豆生物碱对人肝癌ＳＭＭＣ－７７２１
细胞凋亡及Ｂａｘ，Ｂｃｌ－２蛋白表达的影响［Ｊ］．中华中医药学
刊，２００９，２７（７）：１４５０－１４５２．
［３］ 王明艳，瞿融，许冬青．巴豆生物碱诱导人胃腺癌ＳＧＣ－７９０１
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１１９－２０１．
［４］ 瞿庆喜，朱庆亚，喻凯，等．凹叶厚朴中具有α－葡萄糖苷酶抑
制活性的成分［Ｊ］．应用与环境生物学报，２００９，１５（６）：７９６－
７９８．
［５］ 沈国平，龙启福．木兰花碱对 ＨＥＲＧ钾通道蛋白表达的影响
［Ｊ］．山东医药，２０１１，５１（３１）：３６－３７．
（责任编辑：王尚勇）
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Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ５２３８０８，Ｃｈｉｎａ）
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ｉｎｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅ ＨＰＬＣ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｍａｇｎｏｆｌｏｒｉｎｅ，ｔｈｅ ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｓ ｏｆ ＡＢ－８，ＨＰＤ４００，
ＡＤＳ－１７，ＮＫＡ－９，Ｄ１０１ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ ｒｅｓｉｎｓ ｗｅｒｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｄ１０１ｒｅｓｉｎ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｅ－
ｃａｕｓｅ ｉｔ ｇａｖｅ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ａｓ ｆｏｌｏｗｓ：ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
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Ｋｅｙ Ｗｏｒｄｓ：Ｃｒｏｔｏｎ Ｔｉｇｌｉｕｍ；Ｍａｇｎｏｆｌｏｒｉｎｅ；Ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ Ｒｅｓｉｎ；Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
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