全 文 ：验则对实验进行二次优化，通过实验得出砂炒苍耳子
的最佳条件是炒制温度 140 ℃，药砂比 1 ∶ 15
(g·g －1) ，时间 12 min。砂炒苍耳子色泽均匀，毒性
成分含量小。
参考文献
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DOI 10． 3870 /yydb． 2014． 01． 027
离子液体作为流动相添加剂在高效液相色谱法
分离黄柏碱和木兰花碱中的作用机制*
杨勇1，边敏2，李伟2
(1．南京中医药大学药学院，南京 210046;2．南京工业大学理学院，南京 210009)
摘 要 目的 建立黄柏碱与木兰花碱的色谱分离方法，并通过考察各影响因素，探讨离子液体在分离过程中的作
用机制。方法 以离子液体 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐为流动相添加剂，用高效液相色谱法分离黄柏碱和木兰花
碱，并分别考察流动相 pH、离子强度、缓冲溶液种类、离子液体的种类、柱温等影响因素，探讨离子液体在整个分离过程
中的作用机制。结果 以 20 mmol·L －1离子液体作为流动相添加剂等度洗脱即能达到两种生物碱的基线分离。两组分
的保留值、分离度及理论板数随着流动相条件的改变而不同。结论 离子液体在黄柏碱与木兰花碱的分离过程中以生
成中性离子对的作用为主。
关键词 离子液体;黄柏碱;木兰花碱;色谱法，高效液相;添加剂;流动相
中图分类号 Ｒ282． 71;Ｒ927． 2 文献标识码 A 文章编号 1004 － 0781(2014)01 － 0096 － 04
Mechanism of Ionic Liquids as a Mobile Phase Additives on the Separation of
Phellodendrine and Magnoflorine by HPLC
YANG Yong1，BIAN Min2，LI Wei2(1． College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing
210046，China;2． College of Science，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China)
ABSTＲACT Objective The chromatographic separation of phellodendrine and magnoflorine was established，and the
mechanism of ionic liquid in the process was studied by investigating influencing factors． Methods Phellodendrine and
magnoflorine were isolated by HPLC with 1-butyl-3 -methyl imidazole four fluorine boric acid as a mobile phase additive，and
mobile phase pH，ionic strength，buffer solution，ionic liquids and column temperature were all studied by investigating the effect
of ionic liquid in the process． Ｒesults It was shown that the analytes were separated at baseline with a mobile phase
containing ionic liquid under 20 mmol·L －1 isocratic elution． The retention value，separation and number of theoretical plates
varied with the change of mobile phase． Conclusion It is clarified that ionic liquid mainly acts as neutral ion pair in the
separation of phellodendrine and magnoflorine．
KEY WOＲDS Ionic liquids;Phellodendrine;Magnoflorine;Chromatography，high performance liquid;Additive;Mobile
phase
黄柏碱与木兰花碱是黄柏的主要活性成分，在黄
柏药材及相关剂型的鉴别及含量测定中，两者常作为
考察的主要指标，要求同时分离测定。用高效液相色
谱法(HPLC)同时分离测定两种生物碱的研究报道较
·69· Herald of Medicine Vol. 33 No. 1 January 2014
少，且采用的方法以梯度洗脱为主［1-2］。这种方法分析
周期短，峰型对称，灵敏度好。但基线易漂移，重复性
较差，对所用试剂的纯度、黏度、色谱柱等实验条件要
求较高。因此在保证分离度、灵敏度的前提下，简便易
行的等度洗脱仍然是首选的分离测定方法。采用离子
液体 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐 (1-Butyl-3-
methylimidazolium tetrafluoroborate，Bmim BF4)作为流
动相添加剂可成功分离生物碱，减少试样的拖尾峰，改
善峰形，提高分离效率。与三乙胺(triethylamine，
TEA)体系相比，生物碱的保留值降低幅度较小，在相
同浓度下，分离效能较高［3］。此外，由于生物碱具有
不同的结构及碱性，离子液体作为流动相添加剂在分
离过程中的色谱行为不同，分离机制也有所不同。笔
者以木兰花碱、黄柏碱为分离研究对象，建立 HPLC 等
度洗脱的分离测定方法，通过考察分离条件及影响因
素，探讨离子液体在此分离过程中的作用机制。
1 仪器与试药
1． 1 仪器 Shimadzu高效液相色谱系统:LC-20AD泵，
SPD-20A检测器，7125进样器，Class-VP色谱工作站。
1． 2 试药 标准品黄柏碱(批号:E-0638，纯度 ＞
99%)和木兰花碱(批号:E-0306，纯度 ＞ 99%)均由上
海同田生物技术有限公司提供;离子液体 1-丁基-3-甲
基咪唑卤化盐［BminX，X =氯(Cl)、溴(Br)、碘(I) ］，
Bmim BF4，1-丁基-3-甲基眯唑六氟磷酸盐(1-butyl-3-
methylimidazolium hexafluorophosphate，Bmim PF6)根据
文献报道合成［4-5］，经莫尔法、分光光度法测定纯度 ＞
97%;乙腈(色谱纯，天津康科德公司) ;磷酸(优级纯，
国药集团化学试剂公司) ;实验用水为三蒸水(自制) ;
黄柏药材购于药材市场，经南京中医药大学药学院刘
圣金老师鉴定。
2 方法与结果
2． 1 标准溶液的配制 精密称取黄柏碱和木兰花碱标
准品适量，置 10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，
摇匀，即得含黄柏碱 10． 1 μg· mL －1，木兰花碱
10． 7 μg·mL －1的混合标准溶液，保存于 4 ℃冰箱内。
使用前用流动相稀释 10倍，经孔径 0． 45 μm滤膜过滤。
2． 2 色谱条件 色谱柱:ODS 柱(4． 6 mm × 150 mm，
5 μm，Agilent TC-C18) ，流动相:20 mmol·L
－1磷酸盐
缓冲液-乙腈(75∶25，pH4． 5) ，另向流动相中添加
收稿日期 2013 － 05 － 07 修回日期 2013 － 07 － 29
基金项目 * 国家自然科学基金资助项目(81073023)
作者简介 杨勇(1979 －) ，男，陕西韩城人，讲师，硕士，主
要从事中药质量控制与管理工作。电话: (0)13770794523，E-
mail:leaoyang@ 163． com。
2． 6 mmol·L －1 1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐，流动
相使 用 前 经 孔 径 0． 45 μm 滤 膜 过 滤;流 速:
1． 0 mL·min －1，检测波长:280 nm。色谱图见图 1。
图 1 两种生物碱的色谱分离图
1．黄柏碱;2．木兰花碱
Fig． 1 Chromatographic of two kinds of alkaloids
1． phellodendrine;2． magnoflorine
可见，两种生物碱在给定的色谱条件下得到很好
的分离，经计算分离度 ＞ 1． 5，满足分离测定要求。
2． 3 影响因素的考察
2． 3． 1 pH 黄柏碱、木兰花碱属于弱碱［6］，而一般液
相色谱柱使用的 pH范围为 3 ～ 7 之间。即在工作 pH
范围内，此类生物碱的一部分以质子化酸为主要存在
形式，pH越小，质子化酸的比例越高。
分别调节流动相的 pH为 3． 0，3． 5，4． 0，4． 5，5． 0，
5． 5，6． 0，6． 5，7． 0，考察组分容量因子(k)变化。流动
相在不同 pH 条件下，两组分的保留及变化趋势见图
2。
图 2 pH对组分保留因子的影响
Fig． 2 Effect of pH on the retention factors
2． 3． 2 缓冲溶液的浓度 由于生物碱易质子化，这种
质子化过程可能在某一瞬间的局部区域即可发生，质
子化过程的不确定性可导致在分离过程中色谱峰的失
真。所以，生物碱的液相分离大多在一定浓度的缓冲
溶液中进行，且保留行为与缓冲液的浓度相关。实验
·79·医药导报 2014 年 1 月第 33 卷第 1 期
中分别配制浓度为 10 ～ 60 mmol·L －1缓冲溶液作流
动相，考察组分分离效果。
结果显示，不同浓度的缓冲溶液作流动相，离子强
度不同，分离效率亦不同。当浓度为 20 mmol·L －1
时，各组分即可达到基线分离，且峰型良好。随着缓冲
溶液浓度的增大，离子强度的增大，各组分的分离效率
显著提高。造成这种现象的原因是由于离子强度的增
大，使生物碱极性基团之间的作用力减弱，产生促溶效
应，导致色谱柱饱和容量增加，改善分离效果及色谱峰
型［7-8］。
但同时也需要注意，离子强度过高，对液相系统的
腐蚀损坏程度也随之增大。因此当分离度达到要求
时，离子强度不宜过高。故实验采用的缓冲溶液浓度
为 20 mmol·L －1。
2． 3． 3 缓冲溶液的种类 分别配制 20 mmol·L －1醋
酸铵与磷酸二氢钠缓冲溶液作流动相，考察缓冲溶液
种类对分离的影响。结果显示在相同条件下，醋酸铵
缓冲液的分离效果较差，见图 3。
图 3 以醋酸铵缓冲溶液作流动相的 HPLC色谱图
1．黄柏碱;2．木兰花碱
Fig． 3 HPLC chromatogram of alkaloids with mobile
phase containing ammonium acetate buffer
1． phellodendrine;2． magnoflorine
2． 3． 4 离子液体的种类 分别加入离子液体
BmimX、BmimBF4、BmimPF6作添加剂，考察不同种类
离子液体对两种生物碱组分分离的影响。结果显示，
离子液体种类不同，两种生物碱组分的保留及分离效
率不同。各组分的色谱参数(保留因子:k，理论板数:
N，分离度:Ｒs)见表 1。可见，不同种类的离子液体作
添加剂对分离有较大影响，其中高离液序列的阴离子
(BF －4 、PF
－
6 )可得到更好的分离效率。
2． 3． 5 柱温 分别设定柱温为 298，303，308，313 ℃，
考察柱温与组分保留的关系。结果柱温为 298，303，
308，313 ℃时，黄柏碱 lgk分别为 0． 709 3，0． 698 2，
0． 691 4，0． 672 3;木兰花碱的 lgk分别为 0． 841 4，
0． 835 5，0． 829 7，0． 811 1。
表 1 不同离子液体作添加剂分离黄柏碱与木兰花碱的色
谱参数
Tab． 1 Chromatographic parameters for separating
phellodendrine and magnoflorine with different ionic liquid as
additives
阴离子
黄柏碱
k N
Ｒs
木兰花碱
k N
Cl- 4． 37 2 664 3． 31 5． 49 2 775
Br- 3． 93 2 564 3． 82 5． 43 2 815
I- 4． 59 2 579 3． 32 5． 58 2 736
BF －4 5． 12 3 178 6． 16 6． 94 3 457
PF －6 7． 17 4 375 6． 78 9． 73 4 479
由范特霍夫方程可得容量因子的温度效应符合如
下线性关系:
lgk = － ΔHＲT +
ΔS
Ｒ + lgφ。
2． 4 黄柏药材中两组分的分离 将流动相流速调至
0． 7 mL·min －1，其他同“2． 2”项色谱条件，对黄柏药材
中的两组分进行分离，进一步验证该分离方法的可行
性。精密称定黄柏药材粉末 2 g，加甲醇 50 mL，超声处
理30 min，冷却后摇匀静置，取上清液，使用前经孔径
0． 45 μm滤膜过滤，即得供试液，分离色谱图见图 4。
图 4 黄柏的色谱分离图
1．黄柏碱;2．木兰花碱
Fig． 4 Chromatograms of phellodendron amurense
1． phellodendrine;2． magnoflorine
可见，两组分在该色谱条件下能够达到基线分离，
能够满足分离测定的要求。
3 讨论
3． 1 pH 由图 2 可见，随着 pH 逐渐升高，各组分的
保留均显著增大。造成这种现象的原因可能有两种:
第一，随着 pH的降低，生物碱质子化酸存在形式的比
例逐渐升高，极性增大，在反相柱的保留也在逐渐减
·89· Herald of Medicine Vol. 33 No. 1 January 2014
小。第二，Bmim BF4在此分离过程中真正的作用机制
尚未完全明确，但有研究表明，可能是高离液序列阴离
子 BF －4 在分离过程中破坏了生物碱的溶剂化分子层，
并形成电中性的离子对，增大组分的保留。当 pH 减
小时，BF －4 会与 H 结合生成 HBF4，进而导致 BF
－
4 离子
在分离体系中的作用减弱，组分保留值减小［9-10］。由
此，初步判断离子液体在此分离过程中的作用以中性
离子对试剂为主。
3． 2 缓冲溶液的种类 由图 3 可见，当以醋酸铵溶液
作流动相时，组分的峰型不对称，分离度降低，两组分
未达到基线分离。这是因为两种缓冲溶液在不同的酸
度范围具有不同的缓冲容量。在分离条件的弱酸性
pH区域，磷酸盐缓冲液(pH3 ～ 6)的缓冲容量较低，有
利于生物碱的质子化，因此质子化组分能更好地与离
子液体阴离子 BF －4 形成疏水性中性离子对，减少在残
余硅羟基上的吸附，峰型良好。而醋酸铵在此酸度下，
缓冲容量较好，但不利于生物碱质子化酸的形成，使生
物碱与残余硅羟基的吸附作用增大，产生拖尾峰。同
时形成中性离子对的比例下降，各组分保留减弱，分离
度降低。因此为了保证良好的分离度，应采用磷酸盐
缓冲液作流动相分离苦参类生物碱。同时，该现象进
一步证明了离子液体的离子对试剂作用。
3． 3 离子液体种类 由表 1 可见，高离液序列的阴离
子(BF －4 、PF
－
6 )可得到更好的分离效率。这是因为离
液序列高的阴离子，可以与质子化生物碱组分形成离
子对，增大组分保留，提高分离度［11］。而对于不同的
卤素阴离子，由于离液序列相当，故对分离的影响相
近，无明显规律。综合考虑本课题选定离子液体 Bmim
BF4为流动相添加剂。
总之，以离子液体为流动相添加剂，等度洗脱即能
实现两种生物碱的基线分离。影响因素的考察结果表
明，随着流动相 pH 升高，组分的保留值增大;流动相
的离子强度增强、缓冲溶液的缓冲能力降低，组分的分
离度增大;离子液体的离液序列升高，柱效增大;组分
的保留值与柱温满足范特霍夫线性方程，且此法使黄
柏药材中的两种生物碱达到基线分离，满足分离测定
要求。以上结果均一致表明，在此类生物碱的分离过
程中，离子液体在此分离过程中的作用以中性离子对
试剂为主。当分离条件不同，组分的保留与分离效果
也会相应改变。
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