全 文 ：基金项目：安徽省质量工程项目（编号：２０１４ｚｙ０７８）；国家大学生创新
创业训练项目（编号：２０１４１２２１６００８）
作者简介：卫强（１９７７—），男，安徽新华学院副教授，硕士。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｅｉｑｉａｎｇ５０９＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
收稿日期：２０１５－１１－２３
第３２卷第４期
２　０　１　６年４月
Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．４
Ａｐｒ．２　０　１　６
ＤＯＩ：１０．１３６５２／ｊ．ｉｓｓｎ．１００３－５７８８．２０１６．０４．０３８
提取方法对木槿叶挥发油成分及其对肺癌Ａ５４９
细胞抑制作用的影响
Ｅｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｎ　ｖｏｌａｔｉｌｅ　ｏｉｌｓ＇ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｆｒｏｍ
ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｓｙｒｉａｃｕｓ　Ｌ．ａｎｄ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌ　Ａ５４９ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ
卫　强
ＷＥＩ　Ｑｉａｎｇ
　
鲁　轮
ＬＵ　Ｌｕｎ
　
龙先顺
ＬＯＮＧ　Ｘｉａｎ－ｓｈｕｎ
　
刘媛媛
ＬＩＵ　Ｙｕａｎ－ｙｕａｎ
（安徽新华学院药学院，安徽 合肥　２３００８８）
（Ｐｈａｒｍａｃｙ　Ｓｃｈｏｏｌ，Ａｎｈｕｉ　Ｘｉｎｈｕａ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｅｆｅｉ，Ａｎｈｕｉ　２３００８８，Ｃｈｉｎａ）
摘要：分别采用超临界ＣＯ２萃取（ＳＦＥ—ＣＯ２）和水蒸气蒸馏
法（ＳＤＥ）提取木槿叶中挥发油，利用气相色谱—质谱（ＧＣ—
ＭＳ）鉴定化合物，检测细胞凋亡指数和凋亡率评定挥发油抑
制肺癌Ａ５４９细胞作用。从ＳＦＥ—ＣＯ２挥发油中鉴定４０个
化合物，从ＳＤＥ挥发油中鉴定４７个化合物。结果表明：木
槿叶ＳＦＥ—ＣＯ２挥发油与ＳＤＥ挥发油对肺癌 Ａ５４９细胞抑
制率（浓度２５ｍｇ／Ｌ，作用４８ｈ）分别为８０．０８％，６２．７５％，说
明不同方法提取的挥发油抗肿瘤活性差异显著。验证实验
表明，雌甾－１，３，５（１０）－三烯－１７－醇、１－己基－６－羟基－４－甲基六
氢嘧啶－２－硫酮、６，６－二甲基－９－（３－环氧丙烷－２－基）－１，４－二氧
杂螺［４．５］癸烷、２，４－二叔丁基苯酚、丁香酚是抑制肺癌细胞
Ａ５４９的主要活性成分。
关键词：木槿叶；挥发油；超临界ＣＯ２萃取；水蒸气蒸馏法；化
学成分；肺癌
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｖｏｌａｔｉｌｅ　ｏｉｌｓ　ｆｒｏｍ　ｌｅａｆ　ｏｆ　Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｓｙｒｉａｃｕｓ　Ｌ．，ｗｈｉｃｈ
ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｂｙ　ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ　ｆｌｕｉｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｒｂｏｎ　ｄｉｏｘｉｄｅ（ＳＦＥ—
ＣＯ２）ａｎｄ　ｓｔｅａｍ　ｄｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ（ＳＤＥ）ｗｅｒｅ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ａｎｄ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＧＣ—ＭＳ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｔｈｅ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃ－
ｅｒ　ｃｅｌ　Ａ５４９ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ｂｙ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｒａｔｅ　ａｎｄ　ｃｅｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ
ｒａｔｅ　ｆｏｒ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌ　Ａ５４９．Ｆｏｒｔｙ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ
ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ＳＦＥ—ＣＯ２ｖｏｌａｔｉｌｅ　ｏｉｌ．Ｆｏｒｔｙ－ｓｅｖｅｎ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉ－
ｆｉｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ＳＤＥ　ｖｏｌａｔｉｌｅ　ｏｉｌ．Ｔｈｅ　ＳＦＥ—ＣＯ２ａｎｄ　ＳＤＥ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｏｉｌｓ
ｏｆ　ｔｈｅ　ｌｅａｆ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈｅｉｒ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌｓ　Ａ５４９ｗｉｔｈ
ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ　ｏｆ　８０．０８％ａｎｄ　６２．７５％，ｗｈｉｃｈ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｖｏｌａｔｉｌｅ　ｏｉｌｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｂｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｈａｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ
ｔｈｅｉｒ　ａｎｔｉｔｕｍｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ｔｈｅ　ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ
ｅｓｔｒａ－１，３，５（１０）－ｔｒｉｅｎ－１７－ｏｌ，１－ｈｅｘｙｌ－６－ｈｙｄｒｏｘｙ－４－ｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｈｙｄｒｏ－
ｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２－ｔｈｉｏｎｅ，６，６－ｄｉｍｅｔｈｙｌ－９－（３－ｍｅｔｈｙｌｏｘｉｒａｎ－２－ｙｌ）－１，４－ｄｉｏｘ－
ａｓｐｉｒｏ［４．５］ｄｅｃａｎｅ，２，４－ｂｉｓ（１，１－ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｔｈｙｌ）－ｐｈｅｎｏｌ　ａｎｄ　ｅｕｇｅｎｏｌ
ｗｅｒｅ　ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ａｃｔｉｖｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｆ　ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ
ｃｅｌｓ　Ａ５４９．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｌｅａｆ　ｆｒｏｍ　Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｓｙｒｉａｃｕｓ　Ｌ．；ｖｏｌａｔｉｌｅ　ｏｉｌ；ＳＦＥ—ＣＯ２；
ＳＤＥ；ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ；ｌｕｎｇ　ｃａｎｃｅｒ
植物木槿（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｓｙｒｉａｃｕｓ　Ｌ．）别名荆条、藩篱草、篱
障花、朝开暮落花、面花，为锦葵科落叶灌木或小乔木［１－２］，
由于其树木姿态优美，夏秋两季开放，花朵绚丽，古人称为
“美女花”［３－４］，为韩国国花。木槿有清热、解毒、利湿、杀虫
等功效，用于治疗痢疾、痔疮出血、疮疖痈肿、烫伤、阴囊湿疹
等症［５－６］。木槿叶偏于清热凉血，解毒消肿［７］，主肠风，痢后
热渴，能除诸热，滑利能导积滞，善治赤白积痢，干涩不通，下
坠欲解而不解，捣汁和白酒温饮［８］。国内外已有报道，木槿
花中氯化花翠素３－桑布双糖苷具有促进肺癌 ＨＬ－６０细胞凋
亡作用［９］，木槿根中三萜类化合物诱导凋亡和抑制乳腺癌细
胞的细胞迁移［１０］。从木槿叶可以分离出黄酮、萜类、醌类成
分，其中ｓｙｒｉａｃｕｓｉｎ　Ａ和异牡荆素抑制α－葡萄糖苷酶活性作
用较强［１１］。蔡定建等［１２］采用水蒸气蒸馏法（ｓｔｅａｍ　ｄｉｓｔｉｌ－
ｌａｔｉｏｎ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ＳＤＥ）提取和乙醚萃取从木槿花挥发油中分
离４３种化合物，其主要成分有十三烷酸、亚油酸、油酸、二十
一烷等，对木槿叶中挥发油成分研究未见报道。
挥发油是植物中重要的次级代谢产物，具有一定的生物
活性。ＳＤＥ提取挥发油，由于加热时间长，温度高，会导致挥
发油成分发生水解或降解［１３］。超临界ＣＯ２（ｓｕｐｅｒｃｒｉｔｉｃａｌ　ｆｌｕ－
ｉｄ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｒｂｏｎ　ｄｉｏｘｉｄｅ，ＳＦＥ—ＣＯ２）萃取技术是２０世
纪７０年代研究开发的一项新技术，可实现常温提取和保证
热敏性成分不被热分解，特别适合于热不稳定性天然产物和
生理活性物质的分离与精制［１４－１５］。挥发油抗肿瘤是目前研
０６１
究的热点，因其亲脂性可穿过细胞膜，破坏细胞膜的多糖、脂
肪酸和磷脂的结构，导致大分子泄露而诱导肿瘤细胞凋
亡［１６］。超临界萃取挥发油具有良好的适应性，同时也显示
优越的抗肿瘤作用，如定心藤挥发油抗人白血病细胞 Ｋ５６２
增殖［１７］，金边黄杨叶挥发油抑制肺癌细胞 Ａ５４９和胃癌细胞
ＳＧＣ－７９０１增殖［１８］，盾叶唐松草叶挥发油抑制胃癌细胞
ＭＧＣ－８０３增殖等［１９］。现代研究［２０］还发现，氧化分解前后的
白术挥发油对人类卵巢癌细胞（ＳＫＯＶ－３）周期的影响不同，
分解前挥发油可将细胞阻滞在Ｇ２／Ｍ期，分解后挥发油可将
细胞阻滞在Ｓ期，原因在于分解前后挥发油的主要成分不
同，导致其对肿瘤细胞周期的影响也不同。
本试验拟分别采用ＳＦＥ—ＣＯ２、ＳＤＥ提取木槿叶挥发
油，比较两种提取方法对其化学成分的影响，进而比较两种
挥发油总成分对肺癌 Ａ５４９细胞毒性的差异，旨为探索
ＳＦＥ—ＣＯ２的提取优势提供一定参考。通过验证挥发油中成
分抑制肺癌Ａ５４９细胞的作用，阐明其主要活性单体组成。
１　材料与方法
１．１　材料与仪器
１．１．１　材料与试剂　　
木槿叶：采集于２０１３年９月，来自安徽合肥大蜀山地
区，经鉴定为锦葵科木槿（Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｓｙｒｉａｃｕｓ　Ｌ．）的叶。
Ａ５４９细胞株：美国模式培养物集存库（ＡＴＣＣ）公司；
所有挥发油成分对照品：含量均＞９８％，美国 Ｓｉｇｍａ
公司；
其他试剂均为分析纯。
１．１．２　主要仪器设备 　
超临界萃取设备：ＨＡ２２１－５０－０１型，江苏南通华安超临
界有限公司；
挥发油测定器：２　０００ｍＬ，合肥三元化玻有限公司；
气相色谱—质谱联用仪：５９７５Ｂ／６８９０Ｎ型，美国安捷伦
公司；
超净工作台：ＳＷ－ＣＪ－２Ｇ型，苏州净化设备有限公司；
荧光显微镜：ＩＸ７１型，日本Ｏｌｙｍｐｕｓ公司；
全自动酶标仪：ＥＰＯＣＨ型，美国ＢｉｏＴｅｋ公司；
ＣＯ２培养箱：ＭＣＯ－１８ＡＩＣ型号，日本Ｓａｎｙｏ公司；
电子天平：ＦＡ１００４型，上海民桥精密科学仪器有限
公司。
１．２　方法　
１．２．１　挥发油的提取　称取干燥木槿叶药材２ｋｇ，粉碎成
粗粉，等分成两部分。一部分置于超临界ＣＯ２萃取釜，分次
萃取，每次２００ｇ，萃取条件为：压力３５ＭＰａ，温度２５℃，萃
取时间６０ｍｉｎ；分离釜Ⅰ压力１５ＭＰａ，温度２０℃，分离釜Ⅱ
压力１０ＭＰａ，温度１５℃。收集萃取液。另一部分以水蒸气
蒸馏法（以挥发油测定器进行测定）分次提取，每次２００ｇ，提
取５ｈ，收集上层油状液体。萃取液和水蒸气蒸馏得油状液
体均以无水硫酸钠脱水，得到挥发油，呈微黄色，以油重／样
品重计算得挥发油收率分别为０．２０％，０．５１％。
１．２．２　色谱条件　色谱柱 ＨＰ－５ＭＳ（３０ｍｍ×０．２５ｍｍ×
０．２５μｍ）；载气为高纯氮气，载气流速１ｍＬ／ｍｉｍ；进样量
１μＬ；分流比１０１；气化温度２８０℃；ＧＣ—ＭＳ接口温度
２８０℃；ＧＣ 升温程序：初始温度２００ ℃，恒温２ｍｉｎ，以
５℃／ｍｉｎ升至 ２００ ℃，恒温 ３ ｍｉｎ后以 ５ ℃／ｍｉｎ 升至
２８０℃。电离方式ＥＩ，电子能量６０ｅＶ，扫描范围ｍ／ｚ　２５～
５５０，离子源温度２２０ ℃，接口温度３００ ℃，全离子扫描。
ＧＣ—ＭＳ定性分析：通过面积归一化法测定化合物的相对含
量，检索为ＮＩＳＴ　２０１１数据库。
１．２．３　木槿叶挥发油对肺癌Ａ５４９细胞抑制作用试验设计
（１）细胞培养与增殖检测：人肺癌 Ａ５４９细胞以１０％胎
牛血清的ＲＰＭＩ　１６４０培养液（庆大霉素８万 Ｕ／Ｌ），条件为
３７℃和５％ ＣＯ２饱和湿度条件下培养。细胞密度８５％～
９０％时，以０．２５％胰蛋白酶消化、传代，取对数生长期细胞制
备成５×１０５　ｍＬ－１，按照每孔１００μＬ接种于９６孔板。培养
２４ｈ后，试验组加入以 ＤＭＳＯ 稀释的不同浓度木槿叶
ＳＦＥ—ＣＯ２和ＳＤＥ挥发油溶液各１００μＬ，于２４，４８ｈ后检
测，于波长５７０ｎｍ测定吸光度（Ａｍ）；对照组加入同体积的
培养基，按照以上操作测定吸光度（Ａｎ），根据式（１）计算抑
制率。
Ｉ＝Ａｎ－ＡｍＡｎ ×
１００％， （１）
式中：
Ｉ———抑制率，％；
Ａｍ———样品测定吸光度值；
Ａｎ———空白对照测定吸光度值。
（２）细胞凋亡指数检测：取浓度为２×１０４个／ｍＬ的肺癌
Ａ５４９细胞溶液，接种于９６孔培养板接种Ａ５４９单细胞悬液，
待细胞贴壁后弃掉培养基，加入木槿叶ＳＤＥ、ＳＦＥ—ＣＯ２挥发
油使终浓度分别为０，５，１０，１５，２０，２５ｍｇ／ｍＬ，２４，３２，４８ｈ后
以多聚甲醛进行细胞固定，再以 ＰＢＳ冲洗，加入 Ｈｏｅｃｈｓｔ
３３３４２（浓度１０μｇ／ｍＬ），室温染色３０ｍｉｎ。按式（２）计算凋
亡指数。
ＡＩ＝Ｎ１Ｎ２×
１００％， （２）
式中：
ＡＩ———凋亡指数，％；
Ｎ１———凋亡细胞数，个；
Ｎ２———总细胞数，个。
（３）ＳＦＥ—ＣＯ２挥发油中活性成分抑制肺癌 Ａ５４９细胞
的研究：选取木槿叶ＳＦＥ—ＣＯ２挥发油中含量＞１％的成分
（１，３－二硬脂酸甘油酯、十八醛、金合欢基丙酮、２，６，１０－三甲
基十四烷等）相应对照品，以５０％ ＤＭＳＯ 配制成浓度为
１０ｍｇ／ｍＬ的储备液，使用时用 ＰＢＳ稀释。分别将肿瘤细胞
以２×１０４个／ｍＬ接种于９６孔板中，每孔体积２００μＬ，在
ＣＯ２培养箱内培养８～１２ｈ。待细胞贴壁后，每孔加入不同
浓度药液２０μＬ，继续培养４４ｈ。每孔加入５０μＬ　ＭＴＴ溶液
（ＰＢＳ稀释成１ｍｇ／ｍＬ），继续培养４ｈ，吸取上清液倾去，每
孔加入１５０μＬ　ＤＭＳＯ，振荡１０ｍｉｎ后，使用酶联免疫检测仪
于５７０ｎｍ波长处测定各孔吸光度（Ａ值）。初筛以最大浓度
１６１
提取与活性 　 ２０１６年第４期
检测其抑制率，按式（１）计算。计算凋亡细胞与全部细胞数
之比等于５０％时所对应的浓度（ｈａｌｆ　ｍａｘｉｍａｌ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｃｏｎ－
ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ＩＣ５０）。
数据统计以ＳＰＳＳ　１７．０软件统计，组间数据进行Ｃｏｃｈ－
ｒａｎ　＆Ｃｏｘ近似ｔ检验。
２　结果与讨论
２．１　不同提取方法的木槿叶油ＧＣ—ＭＳ测定结果与分析
不同方法提取的木槿叶挥发油经 ＧＣ—ＭＳ测定，结果
见图１和表１、２。
　　由表１可知，从木槿叶ＳＦＥ—ＣＯ２挥发油中鉴定出４０个
化合物，占挥发油总量的８１．５８％。挥发油中相对含量＞５％
的化合物依次有：１，３－二硬脂酸甘油酯（１０．７２％）、十八醛
（９．９４％）、金合欢基丙酮（７．２５％）、２，６，１０－三甲基十四烷
（６．１９％）、雌甾－１，３，５（１０）－三烯－１７－醇（５．１０％）。从木槿叶
ＳＤＥ挥发油中鉴定 出 ４７ 个 化 合 物，占 挥 发 油 总 量 的
６６．６２％。其中相对含量＞５％的化合物有：ｃｉｓ－十八碳烯酸
（１０．７９％）、二十七烷（１０．２６％）、亚油酸（８．０１％）、正己醛
（６．３０％）。由表２可知，ＳＦＥ—ＣＯ２挥发油相对于ＳＤＥ挥发油，
其醇类、酯类成分比例分别由１０．７９％，１．４６％提高至２０．５６％，
图１　木槿叶ＳＦＥ—ＣＯ２挥发油、ＳＤＥ挥发油的总离子流图
Ｆｉｇｕｒｅ　１　Ｔｏｔａｌ　ｉｏｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ　ｏｆ　ｖｏｌａｔｉｌｅ　ｏｉｌ　ｏｆ　ＳＦＥ—
ＣＯ２ａｎｄ　ＳＤＥ　ｆｒｏｍ　Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｓｙｒｉａｃｕｓ　Ｌ．
表１　木槿叶ＳＦＥ—ＣＯ２和ＳＤＥ挥发油化学成分
Ｔａｂｌｅ１　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏｎｓｉｔｕｔｕｅｎｔｓ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ＳＦＥ—ＣＯ２ａｎｄ　ＳＤＥ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｏｉｌｓ　ｏｆ　ｌｅａｆ　ｆｒｏｍ　Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｓｙｒｉａｃｕｓ　Ｌ．
化合物
种类
保留时间／
ｍｉｎ
化合物
ＳＦＥ—ＣＯ２挥发油
相似度／％ 相对含量／％
ＳＤＥ挥发油
相似度／％ 相对含量／％
醇类
４．９４１ （Ｚ）－２－戊烯－１－醇 ９２　 ０．２６ － －
７．００３ （Ｚ）－３－己烯－１－醇 ９６　 ２．９５ － －
４．９１９ 正戊醇 － － ９８　 １．２２
７．３１６ ｃｉｓ－２－甲基－环戊醇 ９９　 ０．２７ － －
７．４８４　 １－己醇 ９５　 ０．２６　 ９５　 ３．５２
１０．３７５ 正庚醇 － － ９４　 ０．５５
１０．６７３　 １－辛烯－３－醇 － － ９４　 ０．２６
１０．８２０ （１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，５Ｓ）－（＋）－蒎烷二醇 － － ９７　 ０．２９
１１．９５８　 １－（１－亚甲基－２－丙烯基）－环戊醇 － － ９３　 ０．１５
１２．３７６ 苯甲醇 ９７　 ２．１６ － －
１２．４７４　 ３，５－辛二烯－２－醇 － － ９２　 ０．５９
１２．９６７　 ４，７－二甲基－４－辛醇 － － ９７　 ０．４７
１３．４８８ 正辛醇 － － ９７　 ２．４４
１３．４８８ α－甲基－α－［４－甲基－３－戊烯基］环氧丙醇 ９８　 ０．１７ － －
１３．８７６　 １－壬烯－４－醇 － － ９８　 ０．５８
１４．７２４　 ２，６－二甲基环己醇 ９６　 ０．８７ － －
２０．７６３　 ４，４，６－三甲基－环己－２－烯－１－醇 － － ９７　 ０．７２
２５．２４４ 正三十七醇 ９８　 １．３０ － －
２５．６６２　 １－己基－６－羟基－４－甲基六氢嘧啶－２－硫酮 ９２　 ２．０７ － －
２５．５８４　 ２－亚甲基胆甾－３－醇 ９４　 ３．１９ － －
２８．３５９ 雌甾－１，３，５（１０）－三烯－１７－醇 ９４　 ５．１０ － －
２８．７５５ 香叶基芳樟醇 ９９　 ０．５２ － －
２８．８９９ 叶绿醇 ９５　 １．４４ － －
２６１
第３２卷第４期 卫　强等：提取方法对木槿叶挥发油成分及其对肺癌Ａ５４９细胞抑制作用的影响 　
　　续表１
化合物
种类
保留时间／
ｍｉｎ
化合物
ＳＦＥ—ＣＯ２挥发油
相似度／％ 相对含量／％
ＳＤＥ挥发油
相似度／％ 相对含量／％
醛类
３．１６２　 ３－甲基丁醛 － － ９７　 １．０７
３．６８３ 戊醛 － － ９７　 ０．７３
５．６８４ 正己醛 － － ９９　 ６．３０
６．４２１／６．４４９ 糠醛 ９４　 ０．２３　 ９２　 １．３９
６．９９１ （Ｅ）－２－己烯醛 － － ９４　 １．１６
８．３５２ 庚醛 － － ９８　 ０．１３
１０．００６ （Ｚ）－２－庚烯醛 － － ９３　 ０．６９
１０．２０１ 苯甲醛 － － ９６　 １．２６
１１．０１８ 辛醛 － － ９６　 ０．３０
１１．６６０ （Ｅ，Ｅ）－２，４－庚二烯醛 － － ９９　 ０．１８
１２．６９６ 苯乙醛 ９４　 ０．９２　 ９６　 １．２１
１３．０９２ （Ｅ）－２－辛烯醛 － － ９５　 ０．７３
１４．１８２ （Ｅ）－２－壬烯醛 － － ９４　 ０．５５
１７．７８３　 ２，４－壬二烯醛 － － ９７　 ０．５１
２０．４７３ （Ｅ，Ｅ）－２，４－癸二烯醛 － － ９７　 ０．３３
２３．９１５ ｃｉｓ－２－甲基－３－氧环己烷正丁醛 ９６　 ０．１８ － －
２６．１９２ 肉豆蔻醛 ９６　 １．６６ － －
２６．６４２ 十八醛 ９６　 ９．９４ － －
烷烃类
３．３３６ 丙二醇甲醚 ９７　 ２．１０ － －
１１．９０４　 ２－甲硫基－２，３－二甲基丁烷 ９３　 ０．１４ － －
１３．７５９　 ２－乙基－１，６－二氧杂螺［４．４］壬烷 － － ９７　 ０．５６
１３．９５９ α，α－５－三甲基－ｃｉｓ－５－乙烯基四氢化呋喃 ９４　 ０．３１ － －
１４．４５３　 ３，５，５－三甲基环己烯 ９７　 ０．１６ － －
１８．４２９　 ２，６，１０－三甲基十四烷 ９８　 ６．１９ － －
２１．９３７　 ３－溴癸烷 － － ９９　 ０．３６
２３．５８８ ｃｉｓ，ｃｉｓ－２－甲基－１－硫杂十氢萘 ９７　 ０．１３ － －
２４．７６６　 ８－丙氧基－柏木烷 － － ９４　 ０．５５
２５．４９１
６，６－二甲基－９－（３－环氧丙烷－２－基）－１，４－二氧杂螺
［４．５］癸烷
９７　 １．５１ － －
２６．３０２ 喇叭烯氧化物－（ＩＩ） ９９　 １．７１　 ９７　 ０．７１
２７．７８４ 亚麻酰氯 ９７　 ３．０３ － －
２８．６５２ 二十七烷 － － ９２　 １０．２６
酚类
１９．５４１ 丁香酚 ９４　 １．１２ － －
２０．１２９／２０．１２０　４－乙烯基－２－甲氧基苯酚 ９６　 ０．５０　 ９４　 ０．４７
２０．９３０ 异丁香酚甲醚 ９５　 １．３９ － －
２３．８１１　 ２，４－二叔丁基苯酚 ９０　 １．４９ － －
酮类
４．７５０　 ３－戊烯－２－酮 － － ９６　 ０．２１
７．９７８　 ４－甲基－２－已酮 － － ９６　 ０．１２
２１．７９７／２１．７９３大马士酮 ９６　 ０．４０　 ９８　 ０．３２
２２．１７２　 ４－（２，６，６三甲基－１，３－环己二烯）－３－丁烯－２－酮 ９８　 ０．２２ － －
２７．４１６　 ６，１０，１４－三甲基－２－十五烷酮 ９８　 １．７７ － －
２３．７２０
４－［２，２，６－三甲基－７－氧杂二环［４．１．０］庚－１－基］－３－
丁烯－２－酮
９２　 １．４６ － －
２８．０８８ 金合欢基丙酮 ９２　 ７．２５ － －
３６１
提取与活性 　 ２０１６年第４期
　　续表１
化合物
种类
保留时间／
ｍｉｎ
化合物
ＳＦＥ—ＣＯ２挥发油
相似度／％ 相对含量／％
ＳＤＥ挥发油
相似度／％ 相对含量／％
酯类
１７．１４３ 水杨酸甲酯 － － ９５　 ０．５６
２１．２５６ 二氢－５－戊烯基－２（３Ｈ）－呋喃内酯 － － ９６　 ０．３１
２４．６９５ 新戊酸－６－烯酯 ９８　 ０．１２ － －
２５．６６０ γ－十二内酯 － － ９７　 ０．５９
２７．６６２ 邻苯二甲酸二异丁酯 ９７　 ３．２６ － －
２９．２４３　 １，３－二硬脂酸甘油酯 ９３　 １０．７２ － －
２８．４０３　 ７－甲基－Ｚ－十四碳烯－１－乙酸酯 ９６　 ３．１１ － －
酸类
１６．１５６ 正辛酸 － － ９５　 ０．５３
２２．２５７ 正十二酸 － － ９７　 ０．２０
２６．８２５ 肉豆蔻酸 － － ９６　 ０．４６
２７．０４１ 十五酸 － － ９８　 ２．５５
２７．７３２ 十六烷酸 － － ９９　 １．４０
２９．０４７ 亚油酸 － － ９４　 ８．０１
２９．４２２ ｃｉｓ－十八碳烯酸 － － ９５　 １０．７９
苯类
８．０８１ 间二甲苯 － － ９６　 ０．１１
１０．０８８　 １，２，４－三甲基苯 － － ９５　 ０．２２
表２　ＳＦＥ—ＣＯ２和ＳＤＥ挥发油中不同成分的数目
和含量对比
Ｔａｂｌｅ　２　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｅｎｔ　ｏｆ
ＳＦＥ—ＣＯ２ａｎｄ　ＳＤＥ　ｖｏｌａｔｉｌｅ　ｏｉｌｓ
成分
ＳＦＥ—ＣＯ２挥发油
数目／种 含量／％
ＳＤＥ挥发油
数目／种 含量／％
醇类 １３　 ２０．５６　 １０　 １０．７９
醛类 ５　 １２．９３　 １５　 １６．５４
烷烃 ８　 １５．２８　 ５　 １２．４４
酚类 ４　 ４．５０　 ３　 ０．４７
酮类 ６　 １１．１０　 ３　 ０．６５
酯类 ３　 １７．２１　 ３　 １．４６
酸类 ０　 ０．００　 ８　 ２３．９４
１７．２１％，酸类成分由２３．９４％下降至０％，在一定程度上说
明ＳＤＥ高温对挥发油成分的氧化可能导致醇氧化、酯水解、
酸生成。
木槿叶ＳＦＥ—ＣＯ２、ＳＤＥ挥发油中共有成分为：糠醛、正
己醇、苯乙醛、４－乙烯基－２－甲氧基苯酚、大马士酮、喇叭烯氧
化物（ＩＩ）。
２．２　Ａ５４９细胞抑制肺癌试验
２．２．１　细胞培养与增殖检测　由表３可知，不同浓度木槿
叶ＳＦＥ—ＣＯ２、ＳＤＥ挥发油对肺癌Ａ５４９细胞作用２４ｈ后即
表现出明显抑制作用（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１），其中ＳＦＥ—
ＣＯ２挥发油抑制作用明显优于ＳＤＥ挥发油（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜
０．０１）。当浓度达到２５ｍｇ／Ｌ时，作用４８ｈ，木槿叶ＳＦＥ—
ＣＯ２、ＳＤＥ 挥 发 油 对 肺 癌 Ａ５４９ 细 胞 抑 制 率 分 别 达 到
８０．０８％，６２．７５％。
表３　木槿叶ＳＦＥ—ＣＯ２、ＳＤＥ挥发油对肺癌Ａ５４９细胞的抑制率
Ｔａｂｌｅ　３　Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ　ｒａｔｅ　ｆｏｒ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌ　Ａ５４９ｆｒｏｍ　ＳＦＥ—ＣＯ２ａｎｄ　ＳＤＥ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｏｉｌ　ｏｆ　ｌｅａｆ　ｏｆ　Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｓｙｒｉａｃｕｓ　Ｌ．（ｎ＝３）
样品
浓度／
（ｍｇ·Ｌ－１）
Ａ５７０ｎｍ
２４ｈ ４８ｈ
抑制率／％
２４ｈ ４８ｈ
对照组 ０　 ０．４０９±０．００８ 　 ０．５０２±０．０１２ 　
ＳＦＥ—ＣＯ２
挥发油
５　 ０．３３２±０．００８＊＊ ０．３７１±０．０１３＊＊ １８．８３　 ２６．１０
１０　 ０．２８９±０．００７＊＊△ ０．３０１±０．００８＊＊△△ ２９．３４　 ４０．０４
１５　 ０．２２１±０．０１２＊＊△ ０．２２４±０．００９＊＊△ ４５．９６　 ５５．３８
２０　 ０．１６５±０．０１０＊＊△ ０．１４６±０．０１１＊＊△△ ５９．６６　 ７０．９２
２５　 ０．１３２±０．０１０＊＊△ ０．１００±０．０１０＊＊△△ ６７．７３　 ８０．０８
ＳＤＥ挥发油
５　 ０．３５２±０．０１０＊＊ ０．３９６±０．００６＊＊ １３．９４　 ２１．１１
１０　 ０．３２１±０．００６＊＊ ０．３２２±０．００７＊＊ ２１．５２　 ３５．８６
１５　 ０．２７６±０．０１１＊＊ ０．２７５±０．０１０＊＊ ３２．５２　 ４５．２２
２０　 ０．２３４±０．００９＊＊ ０．２２９±０．００９＊＊ ４２．７９　 ５４．３８
２５　 ０．２０２±０．０１０＊＊ ０．１８７±０．０１１＊＊ ５０．６１　 ６２．７５
　　与对照组比较，＊表示Ｐ＜０．０５，＊＊表示Ｐ＜０．０１；ＳＦＥ—ＣＯ２挥发油与ＳＤＥ挥发油比较，△表示Ｐ＜
０．０５，△△表示Ｐ＜０．０１。
４６１
第３２卷第４期 卫　强等：提取方法对木槿叶挥发油成分及其对肺癌Ａ５４９细胞抑制作用的影响 　
２．２．２　细胞凋亡指数检测　由表４可知，在２４～４８ｈ内，随
着作用时间的延长，木槿叶ＳＦＥ—ＣＯ２、ＳＤＥ挥发油浓度为
１５，２５ｍｇ／Ｌ时，肺癌 Ａ５４９细胞凋亡率明显升高（Ｐ＜０．０５
或Ｐ＜０．０１）。当浓度达到２５ｍｇ／Ｌ时，木槿叶ＳＦＥ—ＣＯ２、
ＳＤＥ挥发油最大促 Ａ５４９细胞凋亡率分别为 ２９．３６％，
１２．０５％。当浓度大于１５ｍｇ／Ｌ时，木槿叶ＳＦＥ—ＣＯ２挥发
油促Ａ５４９细胞凋亡率明显高于ＳＤＥ挥发油（Ｐ＜０．０５或
Ｐ＜０．０１）。
表４　木槿叶ＳＦＥ－ＣＯ２、ＳＤＥ挥发油对肺癌Ａ５４９细胞凋亡率的影响
Ｔａｂｌｅ　４　Ｃｅｌ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｒａｔｅ　ｆｏｒ　ｃａｎｃｅｒ　ｃｅｌ　Ａ５４９ｆｒｏｍ　ＳＦＥ－ＣＯ２ａｎｄ　ＳＤＥ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｏｉｌ　ｏｆ
Ｈｉｂｉｓｃｕｓ　ｓｙｒｉａｃｕｓ　Ｌ．（ｎ＝３） ％
样品 浓度／（ｍｇ·Ｌ－１） 培养２４ｈ 培养３２ｈ 培养４８ｈ
对照组 ０　 ４．２４±１．０６　 ４．６２±１．１２　 ４．８１±２．０１
ＳＦＥ—ＣＯ２
挥发油
５　 ５．５２±１．１７　 ６．８９±１．６５　 ８．７９±１．０９
１０　 １０．２１±２．００　 １３．８２±１．５５＊ １５．０３±１．７３＊
１５　 １４．１１±１．６７＊△ １７．２６±１．８６＊＊△ １９．７２±１．１５＊＊△
２０　 １６．０７±２．５０＊△ ２１．５８±１．７６＊＊△ ２４．６４±２．３６＊＊△
２５　 １８．７９±１．２３＊＊△△ ２５．２６±２．２５＊＊△ ２９．３６±１．３２＊＊△△
ＳＤＥ挥发油
５　 ４．３３±１．５２　 ５．６０±１．２５　 ６．０７±１．２４
１０　 ７．０２±１．４７　 ８．１１±２．１２　 １０．２０±０．９６
１５　 ７．６６±１．７１　 ９．０８±１．９０　 １１．１４±１．８２
２０　 ８．２９±１．８１　 ９．６２±１．７５　 １１．８３±１．４９＊
２５　 ８．７２±１．０３＊ １０．０１±１．６１＊ １２．０５±１．６８＊
　　与对照组比较，＊表示Ｐ＜０．０５，＊＊表示Ｐ＜０．０１；ＳＦＥ—ＣＯ２挥发油与ＳＤＥ挥发油比较，△表示Ｐ＜
０．０５，△△表示Ｐ＜０．０１。
２．３　ＳＦＥ—ＣＯ２挥发油中活性成分对肺癌 Ａ５４９细胞的抑
制作用
　　天然药物分子广泛存在于自然界，具有抗菌、抗肿瘤等
多种药物活性。以天然药物分子为导向，是寻找优良先导化
合物和候选药物分子的重要途径［２１］。由表６可知，雌甾－１，
３，５（１０）－三烯－１７－醇、１－己基－６－羟基－４－甲基六氢嘧啶－２－硫
酮、６，６－二甲基－９－（３－环氧丙烷－２－基）－１，４－二氧杂螺［４．５］癸
烷、２，４－二叔丁基苯酚、丁香酚可能是抑制肺癌细胞Ａ５４９的
主要活性成分，其ＩＣ５０分别为３９．９２，１８．１７，２６．０１，３５．０６，
２２．０９μｇ／ｍＬ。
３　结论
（１）木槿叶ＳＦＥ—ＣＯ２、ＳＤＥ挥发油中成分组成、含量差
别明显，ＳＦＥ—ＣＯ２挥发油相对于ＳＤＥ挥发油，其醇类、酯类
成分比例上升，酸类成分下降，反映不同提取方法对挥发油
成分影响明显。木槿叶 ＳＦＥ—ＣＯ２、ＳＤＥ 挥发油对肺癌
Ａ５４９细胞抑制率及凋亡率差异显著。初步显示ＳＦＥ—ＣＯ２
挥发油在抑制肺癌细胞 Ａ５４９上有一定的优势，反映不同方
法提取的挥发油存在明显的抗肿瘤活性差异。
（２）根据文献［２２］，１－己基－６－羟基－４－甲基六氢嘧啶－２－硫
酮属嘧啶硫酮结构，具有抗突变作用。雌甾－１，３，５（１０）－三
烯－１７－醇类成分可阻止苯并［ａ］芘导致的肺癌小鼠肺组织凋
亡，减少细胞色素Ｃ由线粒体向胞浆释放，降低Ｂａｘ基因表
达量，提高Ｂｃｌ－２蛋白及基因表达量，使 Ｂｃｌ－２／Ｂａｘ比值升
高［２３］。２，４－二叔丁基苯酚抑制肺癌活性较强，与瞿麦石油醚
萃取物中成分相似［２４］。丁香酚可通过清除 ＮＯ自由基而产
生抗癌作用［２５］。而本试验初步得出这４种成分对肺癌细胞
Ａ５４９具有较强的抑制作用，进一步证明该类成分具有抗肿
瘤活性，其作为先导化合物的可能性有待进一步深入研究。
表５　ＳＦＥ—ＣＯ２挥发油活性成分研究
Ｔａｂｌｅ　５　Ｓｔｕｄｙ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｅ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ｏｆ　ＳＦＥ—ＣＯ２
ｖｏｌａｔｉｌｅ　ｏｉｌ（ｎ＝３）
对照品
抑制肺癌Ａ５４９细胞
ＩＣ５０／（μｇ·ｍＬ－１）
１，３－二硬脂酸甘油酯 ８０．３４±１．１１
十八醛 ７６．５２±１．１５
金合欢基丙酮 ７０．２５±１．１５
２，６，１０－三甲基十四烷 ８９．８１±１．３２
雌甾－１，３，５（１０）－三烯－１７－醇 ３９．９２±１．１６
邻苯二甲酸二异丁酯 ８０．２６±１．３３
２－亚甲基胆甾－３－醇 ９９．１６±１．４２
７－甲基－Ｚ－十四碳烯－１－乙酸酯 １１０．７４±１．０１
亚麻酰氯 ７３．３５±０．９２
（Ｚ）－３－己烯－１－醇 １０９．８１±０．６８
苯甲醇 ９５．１９±１．０２
丙二醇甲醚 ８４．１６±１．２１
１－己基－６－羟基－４－甲基六氢嘧啶－２－硫酮 １８．１７±０．８８
６，１０，１４－三甲基－２－十五烷酮 ５９．４４±１．３８
喇叭烯氧化物－（ＩＩ） ７７．２３±１．２６
肉豆蔻醛 ５０．１５±１．１２
６，６－二甲基－９－（３－环氧丙烷－２－基）－１，４－二
氧杂螺［４．５］癸烷
２６．０１±１．０２
２，４－二叔丁基苯酚 ３５．０６±１．３２
４－［２，２，６－三甲基－７－氧杂二环［４．１．０］庚－
１－基］－３－丁烯－２－酮
７０．２９±１．７６
异丁香酚甲醚 １００．０１±１．２９
正三十七醇 ９０．５６±１．３１
叶绿醇 １２０．５１±１．５２
丁香酚 ２２．０９±０．９６
５６１
提取与活性 　 ２０１６年第４期
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第３２卷第４期 卫　强等：提取方法对木槿叶挥发油成分及其对肺癌Ａ５４９细胞抑制作用的影响