全 文 ：苦艾洗液微生物限度检查方法的验证
王纤汝1 , 闫柏琴1 , 李小燕2
(1新疆医科大学附属中医医院药学部 , 新疆　乌鲁木齐　830000;2新疆维吾尔自治区药品检验所 , 新疆　乌鲁木齐　830002)
中图分类号:R94;R915　　文献标识码:B　　文章编号:1009-5551(2009)02-0204-01
　　苦艾洗液为我院医院制剂。它是由苦参 、黄柏 、蛇床子 、
艾叶等药物组成的中药复方制剂 , 具有清热利湿 、杀虫止痒
的作用。根据《中国药典》(2005 年版)的要求[ 1] , 不同的药
品微生物限度中的细菌数 、霉菌数及酵母菌数测定 , 必须按
照经过验证的方法进行 ,以保证测定方法的可靠性。本研究
对我院苦艾洗液的微生物限度检查进行了方法验证 , 为规范
制剂的微生物限度检查提供依据。
1　材料与仪器
1.1　样品　苦艾洗液 , 批号:060811 , 生产厂家:新疆维吾
尔自治区中医院制剂室。
1.2　培养基　胆盐乳糖增菌液 , 批号:030912;虎红琼脂 ,批
号:030218;营养琼脂 ,批号:060329;营养肉汤 , 批号:060106。
1.3　菌种　枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63 501;金黄色葡萄球
菌 CMCC(B)26 003;大肠埃希菌 CMCC(B)44 102;铜绿假
单胞菌 CMCC(B)10 104;白色念珠菌 CMCC(F)98 001;黑
曲霉菌 CMCC(F)98 003。以上培养基和菌种由中国药品生
物制品检定所提供。
1.4　培养箱　HWS-250 型恒温恒湿培养箱(上海精宏实验
设备有限公司);HRNJ-Ⅱ 霉菌培养箱(海尔实验设备有限
公司)。
2　方法与结果
2.1　菌液制备[ 2] 　取经 37 ℃培养 18 ～ 24 h 金黄色葡萄球
菌 ,大肠埃希菌 、枯草芽孢杆菌 、铜绿假单孢菌营养肉汤培养
物标准比浊管比浊后 10 倍稀释成 50 ～ 100 cfu/ml , 备用。
取经 25 ℃培养 18 ～ 24 h 的白色念珠菌真菌液体培养物标
准比浊管比浊后 10 倍稀释成 50 ～ 100 cfu/m l , 备用。取经
25℃培养 1 周的黑曲霉菌斜面培养物 , 加 3 ml盐水洗下霉
菌孢子 ,取菌液 , 用标准比浊管比浊 , 10 倍稀释成 50 ～ 100
cfu/ ml ,备用。
2.2　供试品制备　称取样品 10 ml ,加 pH 7.0 氯化钠-蛋白
胨缓冲液 100 ml制成 1∶10 的供试液。
2.3　细菌 、霉菌及酵母菌计数方法验证　供试液分别污染
上述 5 种代表试验菌株 , 再加 15 ～ 20 ml规定的琼脂培养
基 ,待凝固后 , 置规定温度培养 24 ～ 72 h , 观察结果 , 平板计
数 ,测定回收率。平皿法:采用供试液 1 ml/皿 , 培养基稀释
法:0.2 m l/皿。
2.4　回收率测定　试验组:取 1∶10供试液 1ml置平皿中 ,
同时加入 50 ～ 100 cfu/ m l试验菌株于平皿中 ,立即倾注琼
脂培养基 , 待凝固后 , 置规定温度培养 24 ～ 72 h 观察结果。
菌液组:测定所加的试验菌数。供试液对照组:测定供试品
本底菌数。稀释剂对照组:方法同试验组。控制菌检查阴性
菌对照:大肠埃希菌。
2.5　结果判断　《中国药典》(2005 年版)规定在独立平行
试验中 ,稀释剂对照组的菌回收率不低于 70%;试验组的菌
回收率均不低于 70%, 则可按该药品供试液制备方法和计
数方法进行细菌 、霉菌及酵母菌数的测定;控制菌检查阴性
菌对照组不得检出阴性对照菌 ,试验组检出试验菌 , 则可按
该药品供试液制备方法和控制菌检查方法检查。
2.5.1　试验菌回收率测定结果　试验组采用平皿法测定污
染菌的回收率 , 显示为金黄色葡萄菌 100%, 枯草芽孢杆菌
40%, 白色念珠菌91%, 黑曲霉菌 93%,大肠埃希菌 96%, 该
样品对 5 株代表菌经验证对大肠埃希菌 、金葡菌 、白色念珠
菌 、黑曲霉菌无明显的抑菌作用 , 回收率均在 70%以上 , 但
对枯草芽孢杆菌有抑菌作用 , 回收率在 70%以下。 但在本
实验中样品经采用培养基稀释法(0.2 ml/皿)测定时 , 样品
对枯草芽孢杆菌无明显抑菌作用 , 回收率为 79%。
2.5.2　控制菌检查方法验证　参照文献[ 3] 对 2 组同时进
行试验 , 试验组:取供试液 10 ml和 50 ～ 100 cfu 试验菌加入
增菌培养基中 , 根据相应控制菌检查法检查 , 应检出试验
菌;阴性对照组:方法同试验组 , 验证铜绿假单胞菌 、金黄色
葡萄球菌检查法时阴性对照用大肠埃希菌 , 阴性对照菌应
不得检出 , 以验证该控制菌检查方法的专属性。试验结果表
明 , 按常规法可以检查抑菌作用较弱的苦艾洗液。 试验组
未检出试验菌的制剂品种 , 采用适宜的方法(如培养基稀释
法)能消除抑菌活性。
3　讨论
在对药品进行微生物限度检查方法验证时 ,采用预试验方
法对验证用菌株抑菌活性的强弱进行预测,可为正式试验提供
依据,同时减少工作量及试药 、试剂的浪费,提高工作效率。
根据《中国药典》微生物限度检查方法的规定 ,含抑菌成
分的中成药制剂 , 必须消除供试液的抑菌活性 , 然后再进行
微生物限度检查。苦艾洗液含有苦参 、黄柏 、蛇床子 、艾叶等
中药材 , 其有效成分对枯草芽孢杆菌有较强的抑菌作用 。用
常规法检查此类有抑菌作用的样品的微生物限度 , 其结果
的准确性将受到影响 , 需先消除供试液的抑菌活性。后采
用培养基稀释法 , 其菌回收率完全能达到验证回收率的要
求 , 说明培养基稀释法能消除供试液的抑菌活性。
控制菌检查方法验证中发现铜绿假单胞菌检查可按供
试液制备及控制菌检查法检查 , 而金黄色葡萄球菌样品检查
时宜取 10 ml(1∶20)的供试液再加 200 ml肉汤进行检查。
参考文献:
[ 1] 　国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部)[ S] .北京:化学
工业出版社 , 2005:70-75.
[ 2] 　中国药品生物制品检定所.中国药品检验标准操作规范[ S] .
北京:中国科学技术出版社 , 2005:325-358.
[ 3] 　高　婕 ,范义凤 ,李　丽,等.枸橼酸钾溶液微生物限度检查法
验证实验[ J] .现代医药卫生 , 2008 , 24(11):1716-1717.
[ 收稿日期:2008-07-04]
204 新疆医科大学学报　JOURNAL OF XINJIANG M EDICA L UNIVERSITY　2009 Feb., 32(2)