全 文 ：角叉菜诱导大鼠胸膜炎中环氧酶-2的生成及
NS-398对其选择性抑制作用
杨秋生＊ , 原田芳照1 , 鹿取信1
(首都医科大学药理学教研室 , 北京 100054;1 日本北里医科大学药理学教研室)
摘要　目的:检测角叉菜诱导的大鼠胸膜炎渗出细胞中 COX-2 的存在并观察 NS-398 对其活性的影响。方法:
用 SDS-PAGE 和Western blot分析及 PGHS-1 和 PGHS-2 抗血清 ,识别并检测胸膜炎渗出细胞中的 COX-2。酶活性
用 TLC 法测定。结果:致炎后 5 h , PGHS-2 出现 , 19 h 时消失 ,而 PGHS-1 在注射角叉菜前后均出现。此外 , 在胸膜
炎大鼠和正常大鼠的肺 、胃 、肾微粒体中 ,只检测到 PGHS-1 , 未检测到 PGHS-2。新的非甾体抗炎药 NS-398 , 可明显
抑制 COX-2 活性(IC50=4.5 μmol·L-1)。结论:COX-2 仅存在于角叉菜诱导的炎症部位;NS-398 可选择性抑制
COX-2 ,并呈剂量依赖性。
关键词　环氧酶-2(前列腺素 H 合成酶-2);胸膜炎;免疫印迹;NS-398[ N-(2-环己氧-4-硝基苯)甲烷磺胺]
　　环氧酶(COX)或称前列腺素 H 合成酶(PGHS)
是花生四烯酸(AA)代谢 、前列腺素(PGs)和血栓素
A2(TAX2)生物合成过程中重要的限速酶之一 。最
近的研究发现:COX有两种形式:COX-1 ,即通常所
指的环氧酶 ,存在于大多数组织细胞中 ,而它的异构
体COX-2 ,是一种被诱导的酶 , 仅存在于多种刺激
因子如 PMA , LPS 和 I L-1 等引起的炎症组织
中[ 1 ,2] ,并在一些组织中证实有 COX-2 mRNA 的存
在[ 3 ,4] ,然而在实验动物炎症模型上证据极少 。因
此为了证实炎症组织中 COX-2 的存在 ,我们以大鼠
胸膜炎模型检测了 COX-2的生成并在体外观察了
NS-398对两种酶催化的 AA 代谢产物 PGE2 的影
响。
材 料 和 方 法
1　大鼠胸膜炎渗出细胞 、肺 、胃 、肾微粒体的制备及
免疫印迹分析(Western blot analysis)
Sprague Daw ley(SD)大鼠(♂,9 ～ 10 周龄),胸
膜炎组胸膜腔内注射 2%角叉菜 0.2 ml ,对照组注
射等量生理盐水(n =6)。在一定时间内乙醚吸入
麻醉断头处死 , 收集胸腔渗出液 ,细胞分离后悬浮
于20 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液(pH 7.4 ,含色氨
酸 5 mmol·L-1)中 ,经超声震荡 5 min将细胞破碎 ,
收稿日期:1998-07-07
＊Tel:(010)63051452 , E-mail:ZhuJuny@publica.bj.CN info.net
于 700×g 离心 10 min , 4℃。取上清液加入 0.5%
Tw een 20 , 140 000×g 离心 1 h ,4℃,沉淀部分悬浮
于 20 mmol·L -1 Tris-HCl缓冲液于-20℃保存备
用 。
分离大鼠肺 、胃及肾 , 分别用 100 mmol·L-1
T ris-HCl缓冲液制成匀浆 。在12 000 ×g 离心 20
min ,取上清液于100 000×g 离心 1 h ,4℃。沉淀部
分按前述方法悬浮保存。所有操作均在 4℃下进
行 。用 Bio-Rad蛋白分析法(Bio-Rad Co.美国)测定
制备样品中蛋白含量 ,分别加样 10 μl(50 ～ 75 μg/
lane),进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
(sodium dodecy l sulfate polyacry lamide gel
elect rophoresis , 简称 SDS-PAGE)[ 5 ] 。开始电流 10
mA , 30 min。当待测样品进入分离胶后将电流调
至 20 mA , 30 min。电泳展开后转移到 Immobilon-
P 纤维膜(Millipore Co.日本)上 ,用 Block Ace(大日
本制药)封闭后 , 与 PGHS-1 和 PGHS-2(Calyman
Chem美国)抗血清反应 。再与羊抗兔 IgG 作用。
以 70-ku 分子标记蛋白(Molecular mark pro tein ,
LKB ,瑞典)定位[ 6] ,进行蛋白印迹分析[ 7] 。免疫染
色的具体步骤按厂家(Konica Co.日本)试剂说明书
进行。
2　体外 AA代谢产物的 TLC分离和放射性强度测
定
将 COX-1和 COX-2(Calyman Co.美国)分别加
入 50 mmol·L-1 Tris-HCl缓冲液中 ,其中含血红蛋
白 1 μmol·L-1和色氨酸 5 mmol·L-1 。在此反应系
·181·药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 1999 , 34(3)∶181～ 184
DOI :10.16438/j.0513-4870.1999.03.006
统中加入不同浓度吲哚美辛(Merck Co.)和 NS-398
[ N-(2-cyclohexyloxy-4-nitrophenyl)methane sulfon-
amide , Taisho 制药 ,日本] ,以等量缓冲液为对照 ,
于 37℃温 育 4 min。 然 后 加 入 3H-AA (74
kBq·ml-1)20 μl 继续反应 2 min。用 1 mol·L-1
HCl终止反应 ,经乙酸乙酯提取 2次 。合并提取液
经旋转蒸发后溶于乙酸乙酯中进行 T LC 分离(20
cm×20 cm硅胶板 ,Whatman Co.美国)。展开剂为
乙酸乙酯 —异辛烷—乙酸 —水(90∶50∶20∶100)。经
γ-放射色谱摄影仪定位后将样品分别刮下 ,加入
ASC-II闪烁液 6 ml进行放射性强度测定。以产物
PGE2生成量 ,计算药物对 COX-1 和 COX-2活性的
抑制作用。抑制率(%)=(对照放射性计数-给药
放射性计数)/对照放射性计数×100%。
实验数据经统计学 t-检验处理 。
实 验 结 果
1　大鼠胸腔渗出细胞及肺 、胃 、肾微粒体的免疫印
迹分析
胸腔渗出细胞免疫印迹图谱如图 1所示。按文
献[ 6] 报道 , 70 ku 标准分子量蛋白质 , 与人的
PGHS-1和 PGHS-2的分子量相似 。本实验中 ,正常
大鼠胸腔渗出细胞中只有 PGHS-1蛋白染色区带 ,
其存留在5 h和 19 h保持于同一水平 。而在角叉菜
诱导的大鼠胸膜炎渗出细胞(92%为多形核白细胞 ,
少量单核细胞),致炎前无 PGHS-2 区带 , 致炎后 5
h出现 , 19 h消失。这与培养的人脐索静脉内皮细
胞中所测结果[ 8]相一致。以前的实验[ 9]证实:角叉
菜致胸膜炎 1 ～ 7 h , PGE2 和 TXB2 明显升高并可
被阿斯匹林抑制 。PGHS-2印迹的时间过程与胸膜
炎渗出细胞中PGs水平相吻合 。图 2显示:PGHS-1
染色区带存在于正常大鼠和胸膜炎 5 h 后大鼠的
肺 、胃 、肾中 ,而在这些组织中 PGHS-2区带均未出
现 ,明显低于检测水平 ,这表明即使动物有炎症感染
时 ,PGHS-2(COX-2)也仅存在于炎症部位 ,而不存
在于感染动物的其它组织。
Fig 1　Immunoblot analysis of pleural cells.lane 1:
pleural lavage cells f rom normal rats;lane 2:pleural
exudate cells at 5 h of pleurisy;lane 3:pleural
exudate cells at 19 h of pleurisy.The position of 70-
ku molecular marker protein is indicated.
Fig 2　Immunoblot analy sis of microsomal f ractions
of the lung(lane 1), stomach(lane 2)and kidney
(lane 3).Panel A , f rom normal control rats;panel
B , f rom rats of 5 h of pleurisy.The position of 70-ku
molecular marker protein is indicated.
·182· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 1999 , 34(3)∶181～ 184
2　NS-398对 AA代谢产物的影响
在环氧酶作用下 , AA 代谢产物主要为 6-keto-
PGF1α, PGE2 和 PGD2 。给药后 3 种产物的生成都
受到不同程度抑制 , 仅以与炎症密切相关的 PGE2
作图(图 3)。结果表明:在体外 NS-398可明显抑制
COX-2 ,并呈剂量依赖性 , IC50=4.5 μmol·L-1 。相
同剂量对 COX-1的影响很小 , 剂量增至 100 μmol·
L
-1时 ,对COX-1的抑制率约为 30%。在本实验剂
量范围内 ,未得出 IC50 。说明 NS-398 对 COX-2 的
抑制作用具有较强选择性。吲哚美辛对 COX-1 和
COX-2 活性的抑制程度近似 , IC50分别为 0.75
μmol·L -1和 1μmol·L-1 。
Fig 3　Effects of NS-398(★)and indomethacin (○)
on COX-1 and COX-2 activity ( x ± s , n =6.
＊P<0.05 , ＊＊P <0.01 vs control).
讨 论
COX(PGHS)催化AA转变成 PGs ,是阿斯匹林
及其它非甾体抗炎药(NSAIDs)作用的靶位 。许多
炎症介质可以使 COX-2 mRNA和酶蛋白含量升高 ,
而对 COX-1无影响。目前 ,很多环氧酶抑制剂如阿
司匹林 、吲哚美辛正广泛用于临床 。由于其对各部
位选择性不高 ,在发挥抗炎作用的同时 ,对抗了
PGE2对胃粘膜的保护作用 ,引起胃粘膜及其它组
织严重不良反应。本文的研究表明:角叉菜所致胸
膜炎 5 h 时确有 COX-2 的检出。研究组其他学者
的测定证实:地塞米松(3 ～ 30 mg·kg-1 ip), NS-398
(3 mg·kg -1 ip)可以抑制 COX-2和 PGE2的生成及
炎性渗出[ 10] ,这表明 COX-2参与了炎症部位 PGs
的生物合成。此外 ,近年的研究表明:COX-1 和
COX-2对各种抑制剂的敏感性不同[ 11] ,大多数环氧
酶抑制剂对 COX-1 的抑制作用比对 COX-2的作用
强[ 12] 。本观察证实在胸膜炎大鼠的肺 、胃 、肾中只
检测到 COX-1 , 未检测出 COX-2 , 这可为选择性
COX-2抑制剂作为无胃 、肾副作用的新抗炎药提供
一个合理依据。
据报道 , 新的非甾体抗炎药 NS-398 , 0.3 ～ 5
mg·kg-1可以发挥抗炎止痛作用 , 一次口服给药
1 000 mg·kg-1对胃肠道无明显损害[ 13] 。本实验在
体外直接检测了 NS-398 对 COX-1 和 COX-2 催化
的 AA代谢主要产物 PGE2生成的影响 , 可以合理
解释 NS-398与炎症有关的选择性抑制作用机制。
致谢　本工作得到日本内藤纪念科学振兴财团奖学金
资助。
参 考 文 献
　1　O′Sulliv an MG , Huggins EM , Meade EA , et al.
Lipopolysaccharide induces prostag landin H synthase-2 in
alveolar macrophages.Biochem Biophys Res Commun ,
1992 , 187∶1123
　2　Jones DA , Carlton DP , McInty re TM , et al.Molecular
cloning of human prostag landin endoperoxide synthase
type II and demonstration of expression in response to
cy tokines.J Biol Chem , 1993 , 268∶9049
　3　Kujubu DA , Fletcher BS , Varnum BC , et al.T IS10 , a
pho rbol ester tumor promoter-inducible m RNA from
Swiss 3T3 cells , encodes a novel prostag landin synthase/
cyclooxygenase homologue.J Biol Chem , 1991 , 266∶
12866
　4　O′Banion MK , Sadowski HB , Winn V , et al.A serum-
and glucocor ticoids-regulated 4-kilobase m RNA encodes a
cyclooxygenase related pro tein.J Biol Chem , 1991 , 266∶
23261
　5　东京大学医学研究所癌研究部编.细胞工学实验プロ
トコÅル.东京:秀润出版(株), 1992.161
　6　Ishimura K , Suzuki T , Fukui K , et al.Immunocyto-
chemical localization of prostaglandin endopero xide syn-
thase in the bovine intestine.Histochemistry , 1993 , 99∶
485
　7　Mitchell JA , Belvisi MG.Induction of cyclooxygenase-2
by cy tokines in human pulmonary epithelial cells:
regulation by dexamethasone.Br J Pharmacol , 1994 ,
113∶1008
　8　Hla T , Neilson K.Human cycloo xygenase-2 cDNA.
Proc Natl Acad Sci US A , 1992 , 89∶7384
　9　Harada Y , Tanaka K , Uchida Y , et al.Changes in the
lev els of prostaglandins and thromboxane and their roles
in the accumulation of exudate in rat car rag eenin-induced
pleurisy-A profile analysis using gas chromatography-mass
spectrometry.Prostaglandins , 1982 , 23∶881
·183·药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 1999 , 34(3)∶181～ 184
10　Katori M , Harada Y , Hatanaka K , et al.Induction of
pro staglandin H synthase-2 in rat carrageenin-induced
pleurisy and effect of a selective COX-2 inhibito r.Adv
Prostaglandin Thromboxane Leukotriene Res , 1995 , 23∶
345
11　Meade E , Smith WL , Dewitt DL , et al.Differential
inhibition of prostag landin endoperoxide synthase
(cyclooxygenase) isozymes by aspirin and other non-
steroidal anti-inflammatory drug s.J Biol Chem , 1993 ,
268∶6610
12　Mitchell JA.Selectivity of non-steroidal antiinflammatory
drug s as inhibito rs of constitutive and inducible
cyclooxygenase.Proc Natl Acad Sci US A , 1993 , 90∶
11693
13　Futaki N , Yoshikawa K , Hamasaka Y , et al.NS-398 ,
a novel non-steroidal anti-inflammato ry drug with po tent
analgesic and antipyretic effects , w hich causes minimal
stomach lesions.Gen Pharmacol , 1993 , 24∶105
INDUCTION OF CYCLOOXYGENASE-2 IN RAT CARRAGEENIN-INDUCED
PLEURISY AND ITS SELECTIVE INHIBITION BY NS-398
Yang Qiusheng(Yang QS), Harada Yoshiteru1 , Kato ri M akoto1
(Capital University of Medical Science , Beijing 100054 ;1Kitasato Universi ty , Japan)
ABSTRACT　AIM:To detect cy clooxygenase-2(COX-2)/prostag landin H synthase-2(PGHS-2)in cells of
pleural exudate and investigate the effect of NS-398 on its activity.METHODS:COX-2 w as tested by SDS-
PAGE and Western blot in cells of the pleural exudate induced in rats by int rapleural injection of 0.2 ml of 2%
carrageenin.TLC was used to analyze the act ivity of COX-2.RESULTS:The examination using PGHS-1 or
PGHS-2 antiserum show ed that PGHS-2 appeared at the 5th hour af ter carrageenin injection , and vanished at
the 19th hour.While , PGHS-1 appeared in cells before and after carrageenin injection.Furthermore , only
PGHS-1 , but not PGHS-2 , was detected in the microsomal f raction of the lung , stomach and kidney of pleurisy-
affected and normal control rats.NS-398 , a novel nonsteroidal anti-inf lammatory agent , suppressed the activity
of COX-2 with IC50 =4.5μmol·L-1 .CONCLUSION:COX-2 is only present in inf lammatory site induced by
carrageenin.NS-398 may selectively inhibit COX-2 activi ty in a dose-dependent manner.
KEY WORDS 　 cyclooxygenase-2(prostaglandin H synthase-2);pleurisy ;Western blot; N-(2-
cyclohexyloxy-4-nit ropheny l)methane sulfonamide
·184· 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 1999 , 34(3)∶181～ 184