全 文 ：第 33卷 第 2期
2008年 4月　 　
林　业　调　查　规　划
Forest　Inventory　and　Planning
Vol.33　No.2
　 Apr.2008
云南松菌根菌的分离培养条件筛选
苏红飞 ,万 杰 ,伍建榕 ,马焕成
(西南林学院国家林业局西南地区生物多样性保育重点实验室 ,云南 昆明 650224)
摘要:在对云南松的外生菌根菌进行分离的基础上 , 得到生长较好的外生菌根菌株.用不同培养基 、不同温度对分
离出的菌株进行培养 , 测定其生长量 , 从中筛选出最适合外生菌根菌生长的培养基和温度.结果认为 , 3个菌株适合
在马铃薯 、MMN和 PDA3种培养基中生长 ,适合在 27℃条件下生长.
关键词:云南松;菌根分离;菌根菌筛选
中图分类号:S791.257;S722.7　　文献标识码:A　　文章编号:1671-3168(2008)02-0135-04
CultureConditions SelectionfortheSeparationoftheMycorrhizalFungi
ofPinusyunnanensis
SUHong-fei, WANJie, WUJian-rong, MAHuan-cheng
(KeyLaboratoryofBiodiversityConservationinSouthwestChina(SouthwestForestryCollege),
StateForestryAdministration, KunmingYunnan6502254, China)
Abstract:TheresearchseparatedtheectomycorhizasofPinusyunnanensisandobtainedwel-grownmy-
copremnas, whichwereculturedunderdiferentmediaandtemperaturesrespectively.Thegrowthsof
thesemycopremnasweredeterminedtoscreentheoptimummediumandoptimumtemperature.Asare-
sult, therewerethreemycopremnassuitableforgrowinginpotatomedium, MMNandPDA, andunder
thebesttemperatureat27℃.
Keywords:Pinusyunnanensis;separationofmycorhiza;screeningofEctomycorhizalfungi
收稿日期:2007-08-28　　修回日期:2007-10-12
作者简介:苏红飞(1980-),男 ,云南富源人 ,在读硕士研究生 ,专业方向:森林培育.
通讯作者:马焕成(1962-),湖南人 ,教授 ,从事生物质能源开发和干热河谷植被恢复研究.
6.2生物措施
(1)在较缓石壁有较大平缓空间石坡花池内可
种植黄槐 、火棘 、清香木 、滇石楠 、刺栎 、女贞 、爬山
虎 、香根草 、芒草 、红叶石楠 、滇含笑 、多花木兰 、沙地
柏等.
(2)在陡峭石壁没有平缓空间石坡花槽内可种
植车桑子 、马桑 、苦刺 、爬墙虎 、香根草 、地石榴 、长春
藤 、芒草等.
(3)在平地面或平缓地面可种植速生树种如旱
冬瓜 、麻栎 、云南松 、华山松 、臧柏 、柳杉 、栾树 、冬樱
花 、滇朴 、银杏 、核桃 、柏木 、金竹 、慈竹 、波斯菊等.
参考文献:
[ 1] 昆明市林业局 , 昆明市森林资源管理总站.滇池流域采
石 、采砂 、采矿 、取土及砖瓦窑采区植被恢复规划设计
[ Z] , 2007.
[ 2] 吴长文 , 章梦涛 .裸露山体缺口生态治理 [ M] .北京:
科学出版社 , 2007.
　　菌根(Mycorhiza)是指土壤真菌与植物根系形
成的共生体 [ 1] .菌丝的一端侵入植物根系 ,镶嵌在
根的表皮层细胞 ,另一端延伸入土壤中.真菌从宿主
获取一些碳水化合物 ,从土壤中吸收无机物转运给
植物 ,供植物生长所需 [ 2, 3] .菌根依照菌根真菌在植
物体内的着生部位和形态特征分为内生菌根(En-
domyvcorhizas或 Endotropicmycorrhiza)、外生菌根
(Ectomvcorrhizas或 Ectotrophicmycorhiza和内外生
菌根 (Ectendomycorhizas)[ 3, 4] .内生菌根在根的表
面没有菌套 ,菌丝大多侵入根的表皮层组织内部 ,在
皮层组织的细胞间隙有纵向的胞间菌丝;外生菌根
主要特征是菌根真菌的菌丝在寄主植物的营养根表
林 业 调 查 规 划
面形成一个紧密交织的菌套 ,在根的皮层细胞间形
成哈氏蒂网 ,但菌丝一般不侵入到细胞内部.外生菌
根的结构主要有菌套 、外延菌丝 、菌索和哈氏帝网 .
内外生菌根兼有外生和内生菌根的特点 [ 5] .云南松
是云南的主要造林树种 ,其林内真菌种类繁多 ,与云
南松形成典型的外生菌根.
菌根菌技术已广泛应用于树木引种驯化 、菌根
化育苗 、逆境造林 、经济林木栽培 、防治苗木根部病
害 、菌根食药用菌的生产等方面 [ 7] .目前 ,菌根菌造
林被认为是一个比较生态 ,不易带来负作用的造林
技术.菌根菌造林的前提是分离出适合的菌种 ,研究
出大规模繁殖菌种的方法.于富强 [ 7]等人从云南松
林里采集分离出 25种真菌 ,但没有研究其扩大繁殖
方法.本次研究是为了解决云南松外生菌根菌大量
扩繁的问题 ,为云南松栽培提供合适的菌株.
1 材料和方法
1.1外生菌根菌的野外采集
1.1.1采集地和采集时间
外生菌根菌采自云南昆明西南林学院后山.这
里的云南松林是纯天然林 ,人工干扰较少 ,林下地表
有较厚的腐质层 ,菌类丰富.树种以云南松为主 ,伴
生有杨梅 、栎类 、圣诞树等.
在 2006年雨季(7月)采集云南松菌根 ,在实验
室内对菌根菌进行分离培养.本次分离共得到 3个
菌种 ,即 I15 、I20和 M3.选取健壮的松树 ,截取菌根 ,
用纸包好 ,做好记录 ,拴上标签 ,放入纸袋中带回实
验室中做进一步的观察研究.用不同的培养基和培
养温度 ,筛选出最适合的培养方法.
1.1.2培养基
A　PDA培养基
配方:200g土豆;15 g葡萄糖;15 g琼脂;1 000
ml水.
B　综合马铃薯培养基
配方:20%马铃薯汁1 000 ml;KH2PO4 3 g;葡萄
糖 20 g;维生素 B1微量;MgSO4.7H2O1.5 g;琼脂
15 g;pH值 6.
C　改良 MMN培养基
配方:CaCl2 0.05 g;麦芽汁 3 g;NaCl0.025 g;
葡萄糖 10g;KH2PO4 0.5 g;牛肉膏和蛋白胨 15 g;
(NH4)2HPO4 0.25 g;维生素 B1微量;MgSO4.7H2O
0.15g;FeCl3 (1%溶液)1.2 ml;琼脂 20 g;加水至
1 000 ml.
D　PDMA培养基
配方:20%土豆汁 500 ml;葡萄糖 20 g;麦芽汁
(波美 2度)500 ml;琼脂 20 g;维生素 B1 0.05 g.
E　酸化麦芽汁培养基
配方:麦芽汁(1.0-1.5波美度)1 000 ml;柠檬
酸 0.15 g;琼脂 20g[ 11]
把 3种菌种分别接于以上 5种培养基中 , 3次
重复.为防止污染 ,每种培养基做 12份.
1.1.3 温度设定
设定温度范围为 25 ～ 31℃,梯度为 2℃.在无菌
条件下 ,将已经分离好的菌株用打孔器打出直径
0.5 cm的小园饼 ,接种到含有培养基平板的培养皿
里(培养皿直径 9cm).将接种好菌株的培养皿分别
放入 25℃、27℃、29℃、31℃的恒温培养箱中培养.
每个处理 3次重复.
1.2分析方法
每天对其生长情况作一次观察.记录直径 、生长
势 、颜色 ,用十字交叉法测量菌落直径.
2结果与分析
经过 10天的培养 , 3种外生菌根菌对不同培养
基和温度的适应表现出一定的差异.
2.1菌根菌在不同培养基中的生长量测定
2.1.1 I15菌种在不同培养基中生长量
表 1　I15菌种 27℃时在各培养基中的生长量 /cm
时间 PDA 综合马铃薯 MMN PDMA 酸化麦芽汁
第一天 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
第二天 2.07 2.12 1.98 1.90 1.50
第三天 3.17 4.30 3.90 4.05 3.35
第四天 5.30 6.56 5.25 5.97 4.47
第五天 6.60 7.10 6.50 7.50 6.00
第六天 7.42 8.40 8.15 9.00 7.74
第七天 8.91 9.00 8.98 死亡
第八天 9.00
由表 1可以看出 ,在开始的 4天里 ,在综合马铃
薯培养基中生长占优势 ,生长直径达 6.56 cm.其次
是 PDMA培养基中的 , 达到 5.97 cm.在 MMN和
PDA培养基中的相差不大 ,直径为 5.30 cm.生长最
差的是酸化麦芽汁培养基中的菌株 ,其生长直径为
4.47 cm.
第五 、六天 , PDMA培养基中的菌株生长超过了
综合马铃薯培养基中的 ,达到 9 cm,长满了整个培
养皿;综合马铃薯培养基中的菌株达到 8.40cm;在
PDA培养基中生长的菌株的直径为 7.42cm在酸化
麦芽汁培养基中的菌株直径为 7.74 cm,长势不好.
·136· 第 33卷
苏红飞等:云南松菌根菌的分离培养条件筛选
第七天 ,综合马铃薯和 MMN培养基中的菌株
生长直径分别为 9.00 cm和 8.98 cm.PDA培养基
中的菌株生长直径为 8.91 cm,而酸化麦芽汁培养
基中的菌株已死亡.
I15菌株在 27℃的条件下 ,生长最好的菌株是在
PDMA培养基中的菌株 ,在酸化麦芽汁培养基中生
长不良.
2.1.2 I20菌种在不同培养基中生长量
表 2　I
20
菌种 27℃时在各培养基中的生长量 /cm
时间 PDA 综合马铃薯 MMN PDMA 酸化麦芽汁
第一天 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
第二天 1.67 2.03 1.82 1.80 1.57
第三天 2.03 4.57 3.57 4.03 3.05
第四天 5.40 6.10 5.00 5.50 4.10
第五天 6.70 7.13 6.02 7.43 死亡
第六天 8.00 8.60 7.40 8.95
第七天 8.90 9.00 8.99
从表 2看出 , I20菌株在各培养基中的生长情况
和 I15菌株在各培养基中的生长情况大致相同.在开
始的 4天里 ,综合马铃薯培养基中的菌株生长最好 ,
其次是 PDMA培养基中的.MMN和 PDA培养基中
的菌株生长情况大致相同.酸化麦芽汁培养基中的
生长最差.
第五 、六天 , PDMA培养基中的菌株生长超过了
综合马铃薯培养基中的菌株.综合马铃薯培养基中
的菌株直径达到 8.60cm;在 PDA培养基中的菌株
直径为 8.00 cm.在酸化麦芽汁培养基中的菌株于
第五天死亡.
第七天 , PDA、综合马铃薯和 MMN培养基中的
菌株直径分别是 8.90cm、9.00 cm和 8.99 cm.
I20菌株在 27℃的恒温条件下 ,生长最好的是在
PDMA培养基中的 ,生长最差的是在酸化麦芽汁培
养基中的菌株.
2.1.3 M3菌种在不同培养基中生长量
从表 1,表 2看出 , I15菌株和 I20菌株在各个培养
基中的生长速度是:开始在综合马铃薯培养基中的
菌株生长快 ,后来在 PDMA培养基中的菌株生长
快.从表 3看出 , M3菌株是开始在 PDA培养基中生
长快.第二天 ,在综合马铃薯培养基中的菌株的生长
速度就超过了 PDA培养基.第三天 , PDMA培养基
里的菌株生长最好 ,并一直保持到第六天.到第七
天 , PDA、综合马铃薯和 MMN培养基中的菌株生长
大致相同;第八天 , PDA、综合马铃薯和 MMN培养基
中的菌株生长直径均达到了 9.00 cm.而 I15菌株和
I20菌株第七天就达到了 9.00cm.
M3菌株在 27℃的条件下 , PDMA培养基里的菌
株生长较好 ,生长较差的是酸化麦芽汁培养基中的
菌株.
表 3　M3菌种 27℃时在各培养基中的生长量 /cm
时间 PDA 综合马铃薯 MMN PDMA 酸化麦芽汁
第一天 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50
第二天 2.40 1.78 2.05 1.80 1.67
第三天 3.13 4.02 3.60 3.93 3.60
第四天 5.20 5.30 5.10 5.63 5.07
第五天 6.53 6.26 6.37 7.40 6.40
第六天 7.45 8.03 7.90 8.93 7.90
第七天 8.76 8.90 8.60 死亡
第八天 9.00 9.00 9.00
在菌根菌的分离 、纯化培养中 ,培养基的选择是
非常重要的.筛选出短时间就可以培养出质量较好
的菌株的培养基是现代生产的需要.从以上 3个表
中可以看出 3种菌株可以在 PDA、综合马铃薯 、
MMN、PDMA培养基中生长.刚开始时可以在酸化
麦芽汁培养基中生长 ,但质量不好 ,从第三天开始菌
株在酸化培养基中就相继死亡.I15菌株在开始的 4
天里在综合马铃薯培养基中生长较好 ,第五 、六天是
在 PDMA培养基中生长较好 , I20菌株在综合马铃薯
培养基中生长最好.M3菌株在开始的 5天里在 PDA
培养基中生长较好 ,第六 、七 、八天是在 PDMA培养
基中生长较好.选择培养基的时候并非看其开始时
的生长势头 ,而是看能否在最短时间里培养一定有
用的量.
2.2菌根菌在不同温度条件下的生长培养测定
2.2.1 I15菌种在不同温度下的生长量测定
表 4　I15菌种在不同温度下的生长量 /cm
时间 25℃ 27℃ 29℃ 31℃
第一天 0.50 0.50 0.50 0.50
第二天 2.13 3.50 2.53 2.50
第三天 3.53 5.30 3.67 3.53
第四天 5.63 6.60 5.50 5.10
第五天 6.50 7.40 6.90 6.33
第六天 8.53 9.00 8.90 7.20
第七天 9.00 8.93
从表 4可以看出:I15菌种在 27 ～ 29℃的温度范
围生长较好 ,在相对较低的 25℃和相对较高的 31℃
的温度生长较差.在 27℃和 29℃这 2个温度条件
·137·第 2期
林 业 调 查 规 划
下 , 6天就长满了整个培养皿 ,而 25 ～ 31℃要 7天才
长满.
2.2.2 I20菌种在不同温度下的生长量测定
从表 5中可以看出:I20菌种在 27 ～ 31℃的温度
范围生长较好 ,在相对较低的 25℃的温度条件下生
长速度最慢 , 9天时才达到 7.80 cm;在 27 ～ 31℃温
度条件下 , 7天时生长直径达到 9.00 cm.
表 5　I
20
菌种在不同温度下的生长量 /cm
时间 25℃ 27℃ 29℃ 31℃
第一天 0.50 0.50 0.50 0.50
第二天 1.93 1.63 2.50 2.40
第三天 2.60 2.03 2.95 3.63
第四天 3.35 5.40 5.15 5.20
第五天 4.05 6.70 6.45 6.50
第六天 4.40 8.00 7.55 7.60
第七天 5.80 9.00 8.90 9.00
第八天 6.70
第九天 7.80
2.2.3 M3菌种在不同温度下的生长量
从表 6中可以看出:M3在 25 ～ 27℃的温度范
围生长最好 , 7天时生长直径为 9.00 cm;在相对较
高的 31℃温度条件下生长最差 ,在 29 ～ 31℃温度条
件下 8天时生长直径才达到为 9.00cm.
表 6　M
3
菌种在不同温度下的生长量 /cm
时间 25℃ 27℃ 29℃ 31℃
第一天 0.50 0.50 0.50 0.50
第二天 2.63 2.40 2.20 2.13
第三天 4.00 3.20 3.27 3.63
第四天 5.20 5.20 4.50 4.60
第五天 7.10 6.47 5.87 5.50
第六天 8.50 7.45 7.23 7.20
第七天 9.00 9.00 8.05 8.06
第八天 9.00 9.00
温度是影响外生菌根菌生长的重要生态因子 ,
在对外生菌根菌进行分离培养时 ,温度的选择很重
要.从表 4 ～表 6看 ,虽然都是云南松的内生菌根 ,
但每个菌株的最适温度范围不一样.I15菌株在 27 ～
29℃温度条件下生长较快较好;I20菌株最适温度范
围是 29 ～ 31℃;M3菌株在 25 ～ 27℃温度条件下生
长较好.3种外生菌根菌在 25 ～ 31℃温度条件下都
能很好地生长 ,说明这些菌株的适应能力较强 ,在较
大的温度范围内能够很好地生长.这大概也是云南
松能够分布在高海拔的一个重要原因.
3讨论
在菌根菌的生长条件测定中 ,对 3种外生菌根
菌的最佳生长温度和最佳培养基作了初步测定.
PDA不是最佳的培养基 ,但是 3种外生菌根菌都能
生长良好.栾庆书等(8)发现 MMN培养基和 PDA培
养基培养菌根菌较好;毕国昌等(9)对 38种 44个菌
株的适应温度进行了测定 ,得到 25℃为绝大多数菌
根菌的最适温度 ,少数为 22℃.有人对马尾松菌根
菌褐环乳牛肝菌培养条件进行研究发现 , S.L菌体
生长最适温度为 25℃、pH值为 4 ～ 4.5(10).从本次
试验来看 , I15 、I20、M3这 3种菌株的最适温度范围不
一样 ,和毕国昌的研究结果有差异.造成结果差异的
原因可能是由于菌株产地不同造成的 ,在今后的研
究工作中应注意到菌株的来源.本次研究是为了寻
找最适合的培养方法 ,没有将温度梯度拉开 ,未研究
外生菌根菌生长的温度上下限 ,这些还有待进一步
研究.
参考文献:
[ 1] Harley, JL, SmithSE.Mycorrhizalsymbiosis[ M] .London:
AcademicPress, 1983:1-483.
[ 2] AlenMF.Theecologyofmycorrhizae[ M] .NewYork:
CambridgeUniversityPress, 1991:1-8, 113-118.
[ 3] 李晓林 , 冯 固 .丛枝菌根生态生理 [ M] .北京:华文出
版社 , 2001:2-6.
[ 4] 朱教君 , 徐慧 ,许美玲 , 等.外生菌根菌与森林树木的相
互关系 [ J] .生态学杂志 , 2003, 22(6):70-76.
[ 5] 郭秀珍 , 毕国昌 .林木菌根及应用技术 [ M] .北京:中
国林业出版社 , 1989:201-205.
[ 6] 吴征镒.云南植被[ M].北京:科学出版社 , 1987:417-419.
[ 7] 于富强 , 纪大干 ,刘培贵 .云南松外生菌根真菌分离培
养研究 [ J] .植物研究 , 2003(1):66-71.
[ 8] 栾庆书 , 王淑清 ,韩瑞兴 , 等 .外生菌根菌的采集 、分离
与培养初探 [ J] .辽宁林业科技 , 1998(2):43-45.
[ 9] 毕国昌 , 郭秀珍 ,藏穆 .在纯培养条件下温度对外生菌
根真菌生长的影响 [ J].林业科学研究 , 1989:247-253.
[ 10] 陈连庆 ,裴致达 .马尾松优良菌根真菌(s.l)液培条件
的研究.林业科学研究 [ J] , 1998, 11(4):443-446.
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