全 文 ：文章编号:1674 － 5566(2012)03 － 0368 － 06
条斑紫菜藻红蛋白粗提方法比较
收稿日期:2011-10-12 修回日期:2012-01-10
基金项目:国家高技术研究发展项目(2007AA09Z406) ;国家科技支撑计划课题(2012BAC07B03) ;上海市教育委员会重点学科建设
项目(S30701)
作者简介:蔡春尔(1980—) ，男，博士，实验师，研究方向为海洋生物技术研究。E-mail:cecai@ shou． edu． cn
通讯作者:何培民，E-mail:pmhe@ shou． edu． cn
蔡春尔，李春霞，藤一悦，林子龙，顾碧莹，何培民
(上海海洋大学 水产与生命学院，上海 201306)
摘 要:研究了我国主要经济红藻之一条斑紫菜藻红蛋白各种粗
提方法。采用“溶胀 +组织捣碎”法破碎条斑紫菜叶状体细胞，依
次研究活性炭、利凡诺等化学试剂和等电点、溶液浓度、pH、温度、
差速离心等物理条件对条斑紫菜破碎液中藻红蛋白纯度和产率的
影响。结果显示:小量活性碳与利凡诺的结合使用不能提高藻红
蛋白纯度，单独使用活性碳，随用量提高，其纯度上升，在活性碳用
量是紫菜用量的 1 /10 时提纯效果最佳。藻红蛋白等电点沉淀后
纯度反而下降，但 pH调节与硫酸铵沉淀结合可显著提升纯度，且
与原溶液浓度成正比，藻红蛋白纯度最高达到 1． 35。此外，盐析
过程中差速离心还可继续提升纯度，达到 1． 42，而通过控制温度
来变性蛋白的方法不能达到提纯的效果。实验为进一步改进优化
条斑紫菜藻红蛋白粗提做了铺垫。
研究亮点:以我国主要经济海藻之
一条斑紫菜为原料，首次系统研究
多种化学方法(活性炭和利凡诺)
和物理方法(等电点、溶液浓度、
pH、温度、差速离心)粗提条斑紫菜
捣碎液中藻红蛋白的效果，为藻类
色素蛋白质的提取提供一定的参
考。
关键词:条斑紫菜;藻红蛋白;活性
碳;利凡诺;差速离心
中图分类号:Q 819;S 968． 43
文献标志码:A
藻胆蛋白包括藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白
(PC)和变藻蓝蛋白(APC)等，是部分藻类的天线
色素，水溶性好，颜色鲜艳，且具荧光特性［1］。条
斑紫菜(Porphyra yezoensis)是我国最主要的栽培
红藻之一，富含藻红蛋白。多年研究表明，藻红
蛋白用途广泛，可作为色素添加于食品、化妆品、
保健品、药品、纺织品、洗涤剂以及喷泉中［2 － 3］，或
制 成 荧 光 标 记 探 针［4］，已 在 Cyanotech
Corporation、Martek Bioscience、PROzyme Inc．等公
司出售，价格昂贵［5］，其对人大肠癌、乳腺癌、口
腔上皮癌、肝癌等细胞具光动力体外杀伤作
用［6 － 7］。藻胆蛋白还具抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、
消炎、护肝、护神经、抗紫外线、减缓动脉硬化、激
活表皮生长因子等保健功效［8 － 10］，甚至在光学信
息存储与处理、快速光电探测、人工神经网络等
方面也有潜在的用途［11 － 12］。
海藻在生长过程中除了培养条件如营养盐
会影响其藻胆蛋白含量外［13］，收割后的海藻体的
加工方法也会在很大程度上决定其内含物的得
失比例［14 － 15］，因此处理海藻体的工艺方法在藻
胆蛋白制备过程中很值得研究。海藻藻胆蛋白
常规制备包括藻体破碎，蛋白粗提和纯化 3 个步
骤［16］，其它制备方法有免疫吸附法和基因工程
法，免疫吸附法是先制备抗 PC 多克隆抗体，再用
亲和层析纯化 PC ［17］;基因工程法用寡聚作用、
生物特异识别功能域等重组 C － PC［18］，此外还有
一些小量快速制备蛋白用于检测的简单方
法［19 － 21］。免疫吸附和基因工程等方法成本高，
技术难度大。常规方法使用效果因材而异［22］，其
中纯化阶段成本高，时间长，产率低，是制备的瓶
颈。本实验在蛋白粗提阶段深入研究，从提高粗
提效果，减轻纯化压力的角度，来探讨藻红蛋白
制备方法。
3 期 蔡春尔，等:条斑紫菜藻红蛋白粗提方法比较
1 材料与方法
1． 1 材料
条斑紫菜(Porphyra yezoensis)叶状体于 2009
年 3 月采自江苏省吕泗紫菜栽培海区。藻体用
清洁海水洗净，10 ℃下阴干后，密封置于 － 20 ℃
冰箱保存备用。
利凡诺购自江西南昌白云药业有限公司;其
他试剂均购自国药集团，为分析纯。
高速冷冻离心机(Supra 22k)为 Hanil Science
公司产品。
紫 外 分 光 光 度 计 (Ultrospec2000 )为
Pharmacia Biotech公司产品。
1． 2 活性炭、利凡诺等化学试剂粗提藻红蛋白
称取 20 g 冻干条斑紫菜，用 400 mL 50
mmol /L 磷酸盐缓冲液(pH 6． 8，含 1 mmol /L
EDTA，10 mg 溶菌酶)浸泡过夜，捣碎，4 ℃在
10 000 r /min离心下 20 min，取上清。
1． 2． 1 活性炭与利凡诺正交实验
取 1． 2 中制备的上清 150 mL，分成 5 组，每
组 30 mL，分别加入 2、1． 5、1、0． 5、0 mg 活性炭，4
℃放置 4 h，纱布过滤，离心取上清。将每组上清
各取 20 mL，平均分装成 5 管，每管加入 1． 6、1． 2、
0． 8、0． 4、0 mL 的 0． 1%利凡诺试剂溶液，4 ℃放
置 4 h，离心取上清。
1． 2． 2 活性炭单因素实验
取 1． 2 中制备的上清 108 mL，分成 2 个平行
组，每组设 9 个梯度，分别加入 300、240、120、60、
30、24、12、6、0 mg 活性炭，4 ℃放置 4 h，纱布过
滤，离心取上清。
1． 3 pH、温度等物理方法粗提藻红蛋白
称取 200 g 冻干条斑紫菜，用 1 L 磷酸盐缓
冲液浸泡，过夜，捣碎，离心取上清。
1． 3． 1 等电点梯度
取 1． 3中制备的上清 120 mL，分成 6 组，每组
20 mL，分别调节 pH至 3． 9、4． 0、4． 1、4． 2、4． 3、4． 4，
静置 3 h，离心，沉淀用适量 50 mmol /L 磷酸盐缓
冲液溶解，上清和沉淀分别扫描吸收光谱。
1． 3． 2 浓度梯度
取 1． 3 中制备的上清，倍比稀释，即用 50
mmol /L磷酸盐缓冲液分别稀释至原溶液的 1 /2，
1 /4，1 /8，1 /16，1 /32，连同原液共 6 组，每组 13． 5
mL，均加至 45%硫酸铵饱和度，调节 pH 至 6． 8，
静置 2 h，离心取沉淀，用 5 mL 磷酸盐缓冲液溶
解，测量吸光值。
1． 3． 3 pH梯度
取 1． 3 中制备的上清 90 mL，分成 6 组，每组
15 mL，均加至 45%硫酸铵饱和度，调 pH至10． 3、
9． 8、9． 3、8． 8、8． 3、7． 8、7． 3、6． 8、6． 3、5． 8、5． 3、4．
8，静置 2 h，离心取沉淀，用 5 mL 50 mmol /L磷酸
盐缓冲液溶解，测吸光值。
1． 3． 4 温度梯度
取 1． 3 中制备的部分上清加至 45%硫酸铵
饱和度，离心后沉淀用缓冲液溶解。量取 30 mL
溶解液，分装成 10 管，于 25 ℃、30 ℃、35 ℃、40
℃和 45 ℃下分别放置 15 min 和 30 min，离心取
上清，测吸光值。
1． 3． 5 差速离心梯度
取 1． 3 中制备的上清 30 mL，分成 2 个平行
组，每组 15 mL，均加至 45%硫酸铵饱和度，调 pH
至 6． 8，静置过夜，均分别用 1 000、3 000、5 000、
7 000、9 000 和 11 000 r /min 在 4 ℃下依次离心
取沉淀，用 5 mL缓冲液溶解，测吸光值。
1． 4 蛋白纯度与含量计算方法
藻红 蛋 白 吸 收 光 谱 纯 度 计 算 参 考
SIEGELMAN等的方法［23］。藻红蛋白含量计算参
考高洪峰的方法［24］。
2 结 果
2． 1 活性炭与利凡诺正交效果
破碎液用活性炭与利凡诺共同处理后，溶液
中 PE纯度变化在 0． 20 ～ 0． 50 之间，与原液纯度
(0． 45)相比效果不明显。经 F检验，不同质量活
性碳处理对纯度影响无显著性差异，经 q 检验
(α = 0． 05) ，不同含量利凡诺处理对纯度影响具
显著性差异，只有 0． 4 mL 与 0 mL(即对照组)两
组无显著性差异(图 1)。
2． 2 活性炭单因素效果
破碎液单独用活性碳处理后，溶液中 PE 纯
度随活性碳量增加先降后升，在 30 mg 处理量时
达到与处理前同样纯度，此后纯度逐渐上升，且
每组结果经 q检验(α = 0． 05)均与前后有显著性
差异。产率变化差异很大，在 120 mg处理量时最
高，该最高值与对照组，60 mg和 240 mg结果经 q
检验(α = 0． 05)无显著性差异，因此理想处理量
为 60 mg活性碳(图 2)。
963
上 海 海 洋 大 学 学 报 21 卷
图 1 活性炭与利凡诺共同处理对条斑紫菜
破碎液中藻红蛋白纯度的影响
Fig． 1 Purity of phycoerythrin from Porphyra
yezoensis crude extract after being treated with
combining of activated carbon and rivanol
图 2 活性炭处理对条斑紫菜破碎液中
藻红蛋白纯度的影响
Fig． 2 Purity of phycoerythrin from Porphyra
yezoensis crude extract after being treated
with activated carbon
2． 3 等电点梯度效果
等电点梯度沉淀后，沉淀和上清中藻红蛋白
纯度均有下降，溶液中最高纯度出现在 pH为 4． 2
和 4． 4 时，均为 0． 41，沉淀中最高纯度出现在 pH
为 4． 1 时，也为 0． 41(图 3)。
图 3 等电点沉淀对条斑紫菜藻红蛋白
粗提液纯度的影响
Fig． 3 Purity of phycoerythrin from Porphyra
yezoensis crude extract after being treated
with isoelectric precipitation
2． 4 浓度梯度效果
盐析所得藻红蛋白纯度和产率随盐析前溶
液浓度降低而降低，未稀释溶液盐析后纯度为
1． 35，得率为 81． 7%(图 4)。
图 4 不同溶液浓度对条斑紫菜藻红蛋白
粗提液硫酸铵盐析纯度的影响
Fig． 4 Purity of phycoerythrin from Porphyra
yezoensis in different comcentration of crude
extract after ammonia sulphate precipitation
●圆点大小代表藻红蛋白产率，纵坐标值代表藻红蛋白纯度。
2． 5 pH梯度
在不同的 pH下盐析，藻红蛋白纯度大致呈抛
物线变化，最高值出现在 pH 6． 8，为 1． 35(图 5)。
图 5 不同 pH对条斑紫菜藻红蛋白
粗提液硫酸铵盐析纯度的影响
Fig． 5 Purity of phycoerythrin from Porphyra
yezoensis crude extract after ammonia sulphate
precipitation in different pH conditions
2． 6 温度梯度
藻红蛋白盐析液经不同温度处理后，纯度反
而下降，且与温升成反比(图 6)。
2． 7 差速离心梯度
硫酸铵沉淀后，通过不同转速可把不同纯度
的藻红蛋白分离。低转速可得到较高纯度的藻
红蛋白，最高达到 1． 42，但得率有所损失(图 7)。
073
3 期 蔡春尔，等:条斑紫菜藻红蛋白粗提方法比较
图 6 不同温度对条斑紫菜藻红
蛋白粗提液纯度的影响
Fig． 6 Purity of phycoerythrin from Porphyra
yezoensis crude extract after dealing with
different temperature conditions
图 7 差速离心对条斑紫菜藻红
蛋白粗提液纯度的影响
Fig． 7 Purity of phycoerythrin from Porphyra
yezoensis crude extract after dealing
with differential centrifugation
3 讨 论
条斑紫菜藻红蛋白粗提最常用的试剂是硫
酸铵［5］，但应用于其他藻胆蛋白的沉淀剂还有丙
酮、活性炭和利凡诺等。丙酮用于螺旋藻藻胆蛋
白特殊处理［25 － 26］，活性炭是良好的吸附剂可去
除水中的毒素和重金属，但其对藻胆蛋白的作用
效果尚无报道，本实验显示活性碳的使用可部分
提高条斑紫菜破碎液中藻红蛋白的纯度，但其强
力吸附作用会使蛋白得率有所下降。利凡诺在
纯化藻红蛋白中的使用更为广泛，可沉淀
Porphyridium cruentum［27］和 Nostoc sp．［28］的藻胆
蛋白，经过分步沉淀，甚至能获得高纯度的
Spirulina (Arthrospira)fusiformis CPC(3． 90)［29］和
Arthronema africanum CPC(3． 00)［30］。可本实验
中尽管设置了广泛的利凡诺梯度，却使藻红纯度
有降无升，这与 Porphyridium cruentum 中描述现
象相反，表明利凡诺法不适合条斑紫菜藻红蛋白
粗提。
汤朝辉等将钝顶螺旋藻破碎液的 pH 调至
3． 5，经搅拌、离心得到了天蓝色的藻胆蛋白
膏［31］。本文实验显示藻红蛋白确实对 pH 敏感，
但单独通过等电点沉淀无法提纯，而在硫酸铵盐
析过程中辅以 pH 调节才能获得高的纯度和产
率。
笔者以往研究中对条斑紫菜设置了 1 ∶ 40，
1∶ 20，1∶ 10，1∶ 5(g /mL)四个物液比梯度，虽然在
1∶ 40时藻红蛋白的产率显著增高，但由此导致粗
提过程中会消耗更多的硫酸铵和缓冲液，并增加
仪器投入和人力成本，故非最佳选择，而采用物
液比 1 ∶ 5 相对在成本核算和纯度上有一定优
势［32］。本文中设置的盐析物液比(g /mL)梯度为
1∶ 5，1∶ 10，…，1∶ 160，结果显示 1∶ 5 时的 45%盐
析纯度和产率远高于其它组，与之前研究结果一
致。
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3 期 蔡春尔，等:条斑紫菜藻红蛋白粗提方法比较
Comparison of crude extraction methods of phycoerythrin from Porphyra
yezoensis
CAI Chun-er，LI Chun-xia，TENG Yi-yue，LIN Zi-long，GU Bi-ying，HE Pei-min
(College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)
Abstract:We compared the methods of crude phycoerythrin extraction from Porphyra yezoensis，a main
economic red alga in China． Porphyra yezoensis thallus was broken with“swelling ＆ smash”method，and
crude extract was dealed in sequence with chemical reagent such as activated carbon，rivanol or physical
condition such as isoelectric point，concentration，pH，temperature and differential centrifugation． It showed
that the purity of phycoerythrin increased when activated carbon was heavily applied alone． When usage of
activated carbon achieved two percent of that of Porphyra，the effect was best． And this method was much
better than combined using of activated carbon and rivanol on a small scale． On the other hand，ammonium
sulfate precipitation combined with pH regulating increased the purity，which was in line with concentration of
solution and arrived at topmost purity of 1． 35，which achieved 1． 42 after differential centrifugation followed．
While isoelectric precipitation or temperature control decreased the purity． This research laid the groundwork
for preparation of phycoerythrin from Porphyra yezoensis．
Key words:Porphyra yezoensis;phycoerythrin;activated carbon;rivanol;differential centrifugation
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