全 文 ：文章编号:1674 － 148X(2011)03 － 0210 － 05
条斑紫菜 Rab1 基因的克隆与生物信息学分析
孙明业，郭宝太，隋炯明
收稿日期:2011 － 04 － 25
基金项目:国家转基因重大专项(2009ZX08009 － 100B)和江苏省植物功能基因组学重点实验室开放课题(K10004)资助。
作者简介:孙明业(1981 －) ，男，山东昌邑人，在读硕士，主要从事植物基因工程研究。
通讯作者:隋炯明，E － mail:suijiongming@ 163． com。
(青岛农业大学生命科学学院，青岛市主要农作物创新与应用重点实验室，山东 青岛 266109)
摘要:Rab蛋白是小分子量 GTP结合蛋白家族中的成员之一，它与植物抗逆性密切相关。以拟南芥 Rab基因序列
为探针，通过筛选条斑紫菜 EST数据库中的同源序列，拼接出了其 Rab1 基因的含有完整开放阅读框(ORF)的 cD-
NA序列。根据拼接的序列设计引物，利用 RT － PCR成功克隆了条斑紫菜 Rab1 基因的 cDNA。T － A 克隆后测序
结果显示其 cDNA含有长 615bp的完整 ORF，编码产物含 203 个氨基酸残基，分子量为 22． 5kDa。条斑紫菜 Rab1
与拟南芥 Rab1 聚为一类，它与多种生物的 Rab1 具有较高的序列一致性。
关键词:条斑紫菜;小 GTP结合蛋白;Rab1 基因;RT － PCR;聚类分析
中图分类号:Q78 文献标识码:A DOI:10． 3969 /J． ISSN． 1674 － 148X． 2011． 03． 010
Cloning and Bioinformatic Analysis of Rab1 Gene in Porphyra yezoensis
SUN Mingye，GUO Baotai，SUI Jiongming
(College of Life Science，QAU;Qingdao Key Lab of Germplasm Innovation and Application of Major Crops，Qingdao 266109，China)
Abstract:Rab protein belongs to small GTP － binding protein family，which is closely related to abiotic stress tol-
erance in plant． In this experiment，Rab genes of Arabidopsis were used as probe to screen homologous sequences
from Porphyra yezoensis EST database． According to the jointed EST sequences，a pair of specific primer was de-
signed，and the cDNA sequence of Porphyra yezoensis Rab1 gene (PyRab1 )was amplified sucessfully by RT －
PCR． After T － A cloning，sequencing result indicated that the cloned cDNA contained a continuous complete open
reading frame (ORF)of 615 bp encoding a polypeptide of 203 amino acids with a calculated molecular mass of 22．
5 kDa． Clusting analysis showed PyRab1 and Rab1 of Arabidopsis was one class of GTP － binding protein． Se-
quence comparison of the PyRab1 revealed high level amino acid sequence identity with Rab1 from other organisms．
Key words:Porphyra yezoensis;small GTP － binding protein;Rab1 gene;RT － PCR;clustering analysis
真核生物中，小分子量 GTP 结合蛋白家族是
一类能够结合 GTP 的单亚基蛋白质，该家族分为
Ras、Rho、Rab、Sar /Arf 和 Ran 5 个亚族，其中
Rab蛋白是数目最多的亚族［1］。Rab 亚族的不同成
员定位于细胞内与胞吞和胞吐相关的膜上，作为囊
泡运输的分子开关，Rab 蛋白在囊泡的形成、转
运、粘附和融合过程中起着重要作用［2］，还有一
些 Rab蛋白影响细胞的生长、分化和凋亡，调节
着植物的生长发育、形态建成。当植物受干旱、盐
碱、病害胁迫时，有许多 Rab 蛋白被诱导表达［3］，
小麦 TaRab2 是干旱胁迫的上调表达基因，在植物
适应环境胁迫过程中具有重要作用［4］。耐盐植物
冰花经 400mM的盐溶液处理后，Rab5 蛋白大量积
累。豌豆 Rab7基因的表达水平与干旱、低温、盐、
植物激素等密切相关［5］。在转基因烟草中超量表
达豌豆的 Rab7 蛋白，能显著提高其抵抗非生物胁
迫的能力［6］。
条斑紫菜为潮间带大型经济藻类，对温度、盐
度、光照的剧烈变化和失水等环境胁迫具有极强的
耐受能力，它是研究藻类分子生物学的理想材料，也
是耐盐抗旱等抗逆基因的重要来源。本研究目的是
克隆条斑紫菜 Rab1 基因并进行序列测定、分析，为
研究该基因的表达规律及利用该基因进行作物的基
因工程改良奠定基础。
青岛农业大学学报(自然科学版) 28(3) :210 ～ 214，2011
Journal of Qingdao Agricultural University (Natural Science)
书1 材料与方法
1． 1 材料
条斑紫菜叶状体由青岛海洋大学戴继勋教授提
供。pMD18 － T载体、Taq DNA 聚合酶、限制性内
切酶、提取植物总 RNA的 RNAisoTM Plus 试剂盒和
cDNA第一条链反转录的试剂盒均购自大连 TaKa-
Ra公司，Ultrafree － DA DNA 回收试剂盒为 Milli-
pore产品。
1． 2 方法
1． 2． 1 总 RNA的提取
取条斑紫菜叶状体 0． 05g，液氮速冻并研磨成
粉末状，用 RNAisoTM Plus 试剂盒抽提，具体操作按
试剂盒说明书进行，DNaseⅠ消化去除残留的 DNA。
1． 2． 2 引物设计
以拟南芥 Rab 基因 cDNA 序列为信息探针，运
行 BLAST程序搜索条斑紫菜 EST 数据库，并对部分
重叠的 EST进行拼接。用 ORF Finder 程序分析其
中的开放阅读框，推测其编码的氨基酸序列。根据
拼接的条斑紫菜 Rab1 基因的 EST 序列设计出一对
引物并由上海生物工程公司合成。
P1:5’－ CGTGGTCACCATGAACGCGGA －3’
P2:5’－ CGATCATTAACAGCAGCCGCCC －3’
1． 2． 3 RT － PCR的扩增
取条斑紫菜总 RNA 5μl，进行反转录 以 Oligo
(dT)为引物，用 TaKaRa 的第一链 cDNA 合成试剂
盒，按说明书的反应条件合成 cDNA 第一链。以
cDNA第一链产物为模板进行 RT － PCR 反应，反应
体系 25μl，包含 10mmol /L Tris － HCl (pH8． 3)、
50mmol /L KCl、1． 5mmol /L MgCl2、1 U 的 Taq 酶、
4nmol /L dNTP、10pmol /L 引物和 20ng 模板 cDNA。
PCR 扩增程序如下:95℃、5min;95℃、30s，55℃、
40s，72 ℃、50s，35 个循环;72℃、10min。
1． 2． 4 基因的克隆及序列测定
PCR 产物经回收纯化后与 pMD18 － T 载体连
接，连接产物经热击法转化 E． coli 菌株 DH5α 感受
态细胞，挑取单菌落提取质粒，经 PCR 和双酶切鉴
定后，送交上海生物工程公司利用通用引物进行序
列测定。
1． 2． 5 生物信息学分析
测序结果利用生物信息学数据库和互联网上的
软件进行分析，编码蛋白的氨基酸序列的预测用
Protparam，氨基酸序列多重比对分析采用 Clustal W
软件。
2 结 果
2． 1 条斑紫菜 Rab基因的克隆与序列测定
电泳显示提取的条斑紫菜叶状体总 RNA 中
5S、18S和 28S 3 条 rRNA 条带清晰(图 1) ，表明总
RNA质量符合要求。
图 1 条斑紫菜总 RNA
以拟南芥 Rab基因作为查询序列，在条斑紫菜
的 dbEST 中进行 BLAST 分析，获得了 AU194771、
AU189541、AV432952、AU188199 等多条高度相似
并且彼此重叠的 EST 序列，并拼接产生一条长
643bp的序列。根据此序列设计出了 DNA引物，RT
－ PCR扩增产物为长约 600bp 的特异性条带，大小
符合预期 (图 2)。
图 2 条斑紫菜 Rab基因的 RT － PCR扩增
M． Marker DL2000;1． 对照;2 ～ 5． RT － PCR产物
回收扩增的目的片段，连接到 pMD18 － T 载体
上，将连接产物通过热激法转化 E． coli 菌株 DH5α
感受态细胞，挑取白斑菌落进行 PCR鉴定。对 PCR
检测呈阳性的抗性菌落，提取质粒用 XbaⅠ和 PstⅠ
(酶切位点在 T 载体的多克隆位点)进行双酶切鉴
定(图 3)。由图 3 可知，重组质粒能够切出载体片
段和大约 600bp 的目的片段。上述结果表明，条斑
紫菜 Rab基因已经连接到克隆载体 pMD18 － T 上。
从阳性克隆提取质粒，测序结果显示 cDNA 序列长
628bp，含有完整的 ORF(图 4)。该 ORF编码产物
1123 期 孙明业，等:条斑紫菜 Rab1基因的克隆与生物信息学分析
图 3 重组质粒的酶切鉴定
M1． Marker DL15000;1 ～ 4． 重组质粒的双酶切
含 203 个氨基酸残基，分子量大小为 22． 5kDa。
2． 2 条斑紫菜 Rab基因的生物信息学分析
拟南芥中至少有 93 小 GTP 结合蛋白，其中 57
个是 Rab 蛋白。拟南芥 Rab 蛋白又可细分为 8 个
亚家族，不同亚家族的成员之间同源性较低。选取
这 8 个家族的多个成员同条斑紫菜 Rab蛋白的氨基
酸序列进行聚类分析，结果表明条斑紫菜 Rab 同拟
南芥 Rab1 亚家族聚为一类，因此将条斑紫菜的编
码基因命名为 PyRab1 (图 5)。
以条斑紫菜 Rab1 氨基酸序列为探针对 Gen-
Bank中的非冗余蛋白质数据库进行 Blastp分析，结
图 4 条斑紫菜 Rab基因的序列及推导的氨基酸序列
图 5 条斑紫菜和拟南芥 Rab蛋白的同源性分析
212 青岛农业大学学报(自然科学版) 28 卷
果发现裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕
赤酵 母 (Pichia angusta)、 链 孢 霉 (Neurospora
crassa)、晚疫病菌(Phytophthora infestans)、莱茵衣
藻 (Chlamydomonas reinhardtii)、 小 立 碗 藓
(Physcomitrella patens)、 假 微 型 海 链 藻
(Thalassiosira pseudonana)、江南卷柏(Selaginella
moellendorffii)、秀丽隐 杆 线 虫 (Caenorhabditis
elegans)、黑猩猩(Pan troglodytes)、斑马鱼(Danio
rerio)、小鼠(Mus musculus)、人类(Homo sapiens)、
烟草(Nicotlana tabacum)、水稻(Oryza sativa)和玉
米(Zea mays)等多种生物的 Rab1 与其高度相似。
将上述生物的 Rab1 和条斑紫菜 Rab1 进行多重序
列比对(图 6) ，并用 neighbour － joining(NJ)法构建
系统发生进化树(图 7) ，结果表明在进化上 PyRab1
与酵母的 Rab1 亲缘关系最近，与细菌和其它藻类
的亲缘关系次之，与高等植物的亲缘关系最远。其
中条斑紫菜 Rab1 与裂殖酵母、链孢霉、莱茵衣藻、
拟南芥和玉米的序列一致性分别为 73． 4%、
73. 1%、71． 5% 、69． 5%和 64． 5%。
为了进一步揭示 PyRab1 蛋白的功能，对其保
守结构域进行了分析。结果显示编码蛋白 N 端 15
～21 残基(序列为 GDSSVGK) ，63 ～ 66 残基(序列
为 DTAG) ，119 ～ 123 残基(序列为 VGNKC) ，149 ～
152 残基(序列为 ETSA)是 4 个保守的 GTP /GDP结
合区域，28 ～ 35 残基(序列为 FADDTYTE)是一个效
应子区，是各种 GTP酶活性蛋白的识别位点。该蛋
图 6 条斑紫菜与其他物种 Rab1 氨基酸序列的同源比较
3123 期 孙明业，等:条斑紫菜 Rab1基因的克隆与生物信息学分析
图 7 不同生物 Rab1 蛋白的进化树分析
白定位在在细胞质中的可能性为 60%。
3 讨 论
Rab 蛋白在囊泡运输中扮演重要角色，是囊泡
运输重要调节因子。Rab 蛋白具有保守的与 GTP
结合有关的高度保守的序列，和高度可变的 N 端和
C端。N 端具有 4 个保守的 GTP /GDP 结合区域，C
端为高变区域，但末端均有 C、CC、CCX 或 CXXX 基
序［7］。该序列为异戊二烯基转移酶的识别修饰位
点，它可把十五碳法尼基或二十碳香叶基转移至末
端半胱氨酸残基上，修饰后 Rab 蛋白利用高度变化
的 C 末端插入细胞内膜或质膜上，该基序是一种膜
定位信号，效应子区域和羧基末端的多样性使它们
成为不同的囊泡运输者［8］。例如，据 Rab1 和 Rab2
负责囊泡从内质网到高尔基体的运输，Rab5 调节从
质膜到早期内涵体的运输，Rab6 则调节蛋白质从高
尔基体到内质网的逆向运输［2］。
拟南 芥 Rab 基 因 被 分 为 AtRab1、AtRab2、
AtRab5、AtRab6、AtRab7、AtRab8、AtRab11、AtRab16
等 8 个亚家族，其中 AtRab1 基因有 4 个，分别是
AtRab1A1、AtRab1B1、AtRab1B2、AtRab1C1［9］。 对
Rab1 功能的研究表明，拟南芥、哺乳动物的 Rab1 及
酵母 Ypt1 蛋白，都是在细胞内质网到高尔基体的囊
泡运输中起调节作用的，而且大豆 Rab1基因被证明
同酵母的 Ypt1 基因功能互补，单子叶植物玉米的
Rab1B基因也与酵母的 Ypt1 基因功能互补［10 － 11］。
利用基因工程技术手段改良农作物的抗逆性，是植
物育种的一条快速有效途径［12］。研究表明，Rab 基
因除了受多种非生物胁迫的诱导表达外，超表达
Rab蛋白还可以提高转基因植物的抗低温、干旱和
耐盐能力。Rab基因至少可通过清除活性氧和在囊
泡中积累钠离子两条途径，在植物的胁迫应答中发
挥作用［13］。条斑紫菜是海洋生物学研究的模式植
物，在长期进化过程中形成了适应极端环境的抗逆
基因和生理生化机制，其功能基因特别是抗逆基因
的克隆与研究具有重要意义。另外，条斑紫菜是食
用藻，来源于它的基因用于作物转基因改良可以更
好地消除转基因作物及食品的安全顾虑。本研究克
隆了条斑紫菜 Rab1 基因的 cDNA序列，为研究该基
因的表达规律、与抗逆性的关系及利用该基因进行
作物的转基因改良奠定了基础。
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