全 文 ：第 33卷　增刊 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) Vol. 33 Suppl.
2005年 8月 Jour. of No rthw est Sci-Tech Univ . o f Ag ri. a nd Fo r. ( Na t. Sci. Ed. ) Aug. 2005
海南省香草兰上病毒病的病原检测
张永江 ,李桂芬 ,施宗伟
(中国检验检疫科学研究院 动植物检疫研究所 ,北京 100029)
　　 [摘　要 ]　采用双抗体夹心酶联 ( DAS-ELISA)检测法和反转录 PCR( RT-RC R)扩增法对海南省送检的香草
兰叶片样品进行病毒病的病原检测 ,结果在香草兰叶片样品上发现了建兰花叶病毒。
[关键词 ]　香草兰 ;病原 ;检测
[中图分类号 ]　 S435. 73　　　　 [文献标识码 ]　 A [文章编号 ]　 1671-9387( 2005) S0-0135-02
　　香草兰是名贵的多年生热带藤本香料植物 ,素
有“香料之王”的称誉。其鲜豆荚经生香加工后 ,为商
品香草兰豆荚 ,可广泛应用于食品、卷烟、高档化妆
品和医药产品等方面 ,在国内外市场上十分紧俏 ,是
高效益的外向型产品。 危害香草兰的病毒主要为建
兰花叶病毒 (Cymbidium mosaic v irus, CymMV )和
齿 兰 环斑 病毒 (Odontoglossum ringspot vi rus,
O RSV ) ,虽然目前尚没有这 2种病毒对香草兰生产
造成严重影响的报道 ,但考虑到香草兰的高经济价
值及这 2种病毒对其潜在的影响 ,已有生产单位提
出对这 2种病毒进行检测的要求。本试验对来自海
南省的送检样品进行了 DAS-ELISA和 RT-PCR
检测 ,结果显示样品中带有建兰花叶病毒。
1　材料与方法
1. 1　材　料
　　香草兰叶片为海南省送检样品 ,共 8份 ,依次编
号为 1～ 8。 核酸提取试剂 Trizol为 Invi trog en产
品 , CymMV抗体为美国 ADI公司产品。
1. 2　 DAS-ELISA检测 CymMV
双抗体夹心酶联法检测按魏梅生等 [1 ]的方法操
作。样品中加入 5倍体积的抽提缓冲液研磨 , 4 000
r /min离心 5 min,取上清液作为待检样品。 阳性对
照由 ADI公司提供。
1. 3　 RT-RCR检测 CymMV
1. 3. 1　引物设计合成　引物参照潘俊松等 [2 ]的方
法设计 ,由北京赛百盛公司合成 ,其碱基序列如下:
CymMV f: 5′- ACC ATG GGA GAG CCC ACT
CCA ACT CCA GCT -3′;
CymMVr: 5′- T TA TTC AG T AGG GGG TGC
AGG CAG AGC G TA G -3′。
1. 3. 2　核酸提取和反转录　用 Trizol试剂提取样
品中叶片总 RNA。反转录体系 20μL, DEPC-H2O
10μL、 10 mmo l /L dN T P 1μL、 20μmol /L反向引
物 2μL, RN A模板 1μL, 70℃反应 5 min,冰上放
置 5 min,加入 M-MLV酶 5倍 Buf fer 4μL, 200
U /μL M-M LV 1μL, 40 U /μL RNA酶抑制剂
1μL, 42℃反应 1 h。
1. 3. 3　 PCR扩增　反应体系 20μL,上述反转录产
物 2μL, 10倍 PCR缓冲液 (含 Mg2+ ) 2μL, 10
mmol /L dN TP 0. 6μL,下游引物 0. 5μL,上游引物
0. 5μL, 2 U /μL Taq酶 1μL和 DEPC水 13. 4μL。
反应程序为 [2 ]: 94℃ 5 min; 94℃ 40 s, 72℃ 90 s,
30个循环 ; 72℃ 8 min。
1. 3. 4　产物电泳检测　取 PCR产物 8μL于 100
V电压下 1%琼脂糖凝胶电泳 40 min, EB染色 ,在
凝胶成像仪上观察结果。
2　结果与分析
2. 1　 DAS-ELISA检测结果
　　表 1为加入底物后 60 min的 OD405值。 其中 6
号样品为强阳性反应 ,其 OD405值是阴性的 11倍 ,说
明在 6号样品中检测到了建兰花叶病毒。
2. 2　 RT-PCR检测结果
由图 1可知 , 6号样品能够特异性扩增到大小
为 670 bp的条带 ,与预期结果一致 ,表明 6号样品
DAS-ELISA检测为 CymMV阳性。
[收稿日期 ]　 2005-07-08
[作者简介 ]　张永江 ( 1977- ) ,男 ,山东寿光人 ,助理研究员 ,硕士 ,主要从事植物检疫病毒学研究。 E-mail: zh angyipvi@ yeah. net
DOI : 10. 13207 /j . cnki . jnwaf u. 2005. s1. 037
表 1　 DAS-ELISA法检测 CymMV的 OD405值
Table 1　 The values o f OD405 detected
in DAS-ELISA o f CymMV
样品及对照
Sam ples and CK
OD405值
OD405 values
样品 Samples
1 0. 062
2 0. 059
3 0. 059
4 0. 059
5 0. 058
6 0. 709
7 0. 067
8 0. 062
阴性对照 Negat ive CK 0. 064
阳性对照 Posit ive CK 0. 708
缓冲液对照 Buf fer CK 0. 061
图 1　 6号样品 RT-PCR扩增产物凝胶电泳结果
M.标准 ( DL-2000) ; 1. CymMV DAS-ELISA阳性样品
Fig . 1　 Elec tropho resis o f the sam ple
6 product from IC-RT-PC R
1. Marker ( DL-2000) ; 1. Posi tiv e sample of CymMV
3　讨　论
经 DAS-ELISA和 RT-PCR2种方法检测 ,确
认送检样品中 6号为建兰花叶病毒阳性。 目前香草
兰生产上的种苗一般为 0. 5～ 1 m长的壮蔓切段 ,
因此一旦母株带毒 ,其后代均带有病毒 ,将会给日后
的生产造成病害隐患。因此有必要对母株的带毒情
况进行检测 ,并在此基础上开展脱毒、无毒苗快速繁
殖的研究工作。 本实验采用的两种检测技术可应用
于香草兰的种苗检测及检疫 ,剔除带毒苗 ,保障安全
生产。
[参考文献 ]
[1 ]　魏梅生 ,黄　冲 . A蛋白斑点免疫金染色和双抗体夹心酶联检测齿兰环斑病毒的比较 [ J] .植物检疫 , 2000, 14( 6): 344- 346.
[2 ]　潘俊松 ,刘志昕 ,吴　豪 ,等 .建兰花叶病毒外壳蛋白基因序列分析及病毒检测 [ J ].农业生物技术学报 , 1999, 7( 4): 325- 328.
Pathogeny identification on virus disease of
Vanilla planifolia in Hainan Province
ZHANG Yong- jiang, LI Gui-fen, SHI Zong-wei
( Animal and Plant Quarant ine Institute,CAIQ,Beijing 100029,China)
Abstract: The pathogeny on vi rus disease of Vanilla planifolia in Hainan province w as identi fied by
DAS-ELISA and RT-PCR, the Cymbidium mosaic vi rus ( CymMV ) w as detected on the sample.
Key words: Vanil la plani folia; pathogeny; identification
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