全 文 ：浙 江 农 林 大 学 学 报， 2014， 31（2）： 322 - 328
Journal of Zhejiang A & F University
doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2014.02.024
无患子 SRAP-PCR反应体系的优化
彭珠清1， 范辉华2， 刘 宝1， 刘 燕1， 李 静1
（1. 福建农林大学 林学院， 福建 福州 350002； 2. 福建林业科学研究院， 福建 福州 350012）
摘要： 建立适合无患子 Sapindus mukurossi 的相关序列扩增多态性-聚合酶链式反应（SRAP-PCR）最佳反应体系， 为
研究无患子种质资源的遗传多样性、 亲缘关系及遗传改良等奠定基础。 以南平产的无患子叶片为材料， 采用单因
素法对体系中的 DNA 模板、 镁离子、 三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）， 引物和 TaqDNA 聚合酶等 5 因素进行优化。
确立了适合无患子 SRAP的最佳反应体系（20 μL）： 1× PCR缓冲液， 50 ng模板 DNA， 2.0 mmol·L－1镁离子， 0.2 mmol·L－1
dNTPs， 0.5×16.67 nkat （0.5 U） TaqDNA 聚合酶， 0.4 μmol·L－1引物。 利用该体系对 12 份无患子种源材料进行 PCR
扩增， 获得了清晰、 稳定的 DNA谱带， 说明优化后的体系适宜无患子地理种源的遗传多样性分析。 图 7表 3参 19
关键词： 林木育种学； 无患子； SRAP-PCR； 反应体系； 优化
中图分类号： S722.3 文献标志码： A 文章编号： 2095-0756（2014）02-0322-07
Optimization of SRAP-PCR in Sapindus mukurossi
PENG Zhuqing1， FAN Huihua2， LIU Bao1， LIU Yan1， LI Jing1
（ 1. Forestry College， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， Fujian， China； 2. Fujian
Academy of Forestry， Fuzhou 350012， Fujian， China）
Abstract： Establish an optimal sequence-related amplified polymorphism （SRAP）-PCR reaction system was to
lay the foundation of studying genetic diversity, relationship analysis and genetic improvement in Sapindus
mukurossi. The leaves from Nanping, Fujian Province were as material. Five influence factors including tem-
plate DNA, Mg2+, dNTPs, primers and TaqDNA polymerase were optimized with single factor method．The opti-
mum reaction system by the volume of 20 μL was established as follows: 1×PCR buffer, 50 ng DNA template,
2.0 mmol·L－1 Mg2+, 0.2 mmol·L－1 dNTPs, 0.5×16.67 nkat TaqDNA polymerase and 0.4 μmol·L－1 primers. Using
the optimization system, 12 different source materials of Sapindus mukurossi were detected a clear and stable
results. It shows that the optimazed SRAP-PCR system could be suitable for the genetic diversity analysis of
Sapindus mukurossi geographical provenance. ［Ch, 7 fig. 3 tab. 19 ref.］
Key words: forest tree breeding; Sapindus mukurossi; SRAP-PCR; reaction system; optimization
无患子 Sapindus mukurossi 属于无患子科 Sapindaceae 无患子属 Sapindus， 是一种非常有潜力的经济
树种， 其果可以用来制作洗涤剂， 种仁能提取生物柴油， 树形美观， 可用于园林观赏等。 日本、 法国、
中国台湾等对其蕴含的经济价值有一定的开发利用， 而中国大陆虽早在几百年前就已对其有初步利用，
但深度开发这方面却尚在起步阶段［1-3］。 目前， 对无患子的研究主要集中在生物学特性、 繁殖技术［1,4］、 化
学成分和分离提取技术及其利用价值的开发研究 ［5－7］等方面， 而在分子生物学方面的研究报道不多 ［8-9］。
分子标记技术是研究种质资源遗传背景的重要手段， 2001 年美国加州大学蔬菜作物系 Li 与 Quiros 博士
提出了一种新型的基于聚合酶链式反应（PCR）的标记方法的相关序列扩增多态性（sequence-related ampli-
收稿日期： 2013-05-05； 修回日期： 2013-09-23
基金项目： 国家林业公益性行业科研专项（201104100）
作者简介： 彭珠清， 从事植物地理学研究。 E-mail： 13489945975@126.com。 通信作者： 范辉华， 教授级高级
工程师， 从事森林培育学研究。 E-mail： jofhh@163.com
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fied polymorphism，SRAP）标记方法 ［8，10］。 该标记通过独特的双引物设计对基因的 ORFs（open reading
frames）的特定区域进行扩增。 与其他分子标记相比， 该方法具有简单高效、 多态性高、 重复性较好等特
点， 并已成功应用于多种蔬菜、 经济树种的种质资源分析中［5-7,11-13］。 但在无患子的遗传多样性以及种质
鉴定等方面还鲜见报道。 为此， 本研究以无患子叶片为材料， 采用单因素优化的方法建立无患子 SRAP-
PCR 的最佳反应体系， 旨在为不同地理种源无患子的遗传多样性分析、 亲缘关系鉴定、 遗传图谱构建、
遗传改良等奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料来源
试验材料采于福建顺昌无患子种源收集区， 共 12个种源地 36份种质材料。 本优化试验以福建南平
种源地的基因组 DNA为试验材料。
1．2 主要试剂
试验中所用的三磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTP）s， TaqDNA 酶， 琼脂糖和 DNA 标记物均购自上海生工
生物工程有限公司， 其中 100 bp 标记物是加 DNA 梯度。 所用的 SRAP 引物序列由上海生物工程（上海）
股份有限公司合成， 其序列参照 Li等［10］和 Ren等［14］的方法。
优化试验引物选用 me2-em7 组合， 体系验证引物选用 me2-em7 和 me6-em1， 序列具体如表 1。
1.3 无患子总 DNA的提取
无患子总 DNA 提取采用改良的十六烷基三甲基
溴化铵（CTAB）法 ［15-16］。 DNA 的浓度和纯度， 分别用
质量浓度为 1%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计
分析检测。 样品稀释至 10 μg·L－1 后， 置－20 ℃冰箱
保存备用。
1．4 反应体系的优化
SRAP-PCR 基本反应体系 ： 在 20.0 μL 总体积
中， 含 2.0 μL 10×PCR 缓冲液（free Mg2+）， 2.0 mmol·
L－1 镁离子（Mg2+）， 0.2 mmol·L－1 dNTPs， 2.0×16.67 nkat（2.0 U） TaqDNA聚合酶， 正反引物各 0.5 μmol·L－1，
用双蒸水补足至 20 μL。
SRAP-PCR 扩增程序为： 94 ℃预变性 3 min； 94 ℃变性 l min， 35 ℃复性 l min， 72 ℃延伸 l min；
共 5 个循环。 随后 94 ℃变性 l min， 50 ℃复性 1min， 72 ℃延伸 l min， 共 35 个循环； 最后 72 ℃延伸 10
min。 PCR仪为 ABI梯度 PCR仪。
本试验采用单因素法对反应体系进行优化， 分别调整模板 DNA， 镁离子， dNTPs， 引物， TaqDNA 聚合
酶各因子的用量（表 2）。
表 2 反应体系各因子水平
Table 2 Reaction system in each factor level
水平 DNA用量/ng
镁离子浓度/
（mmol·L－1）
dNTPs浓度/
（mmol·L－1）
TaqDNA/
（×16.67 nkat）
引物浓度/
（μmol·L－1）
1 10 1.00 0.05 0.5 0.2
2 20 1.25 0.10 0.6 0.3
3 30 1.50 0.15 0.7 0.4
4 40 1.75 0.20 0.8 0.5
5 50 2.00 0.25 0.9 0.6
6 60 2.25 0.30 1.0 0.7
7 70 2.50 0.35 1.2 0.8
8 80 2.75 0.40 1.5 0.9
9 90 3.00 0.45 2.0 1.0
10 100
表 1 引物序列
Table 1 Primer sequence
引物名称 引物序列
me2 5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′
me6 5′-TGAGTCCAAACCGGTAA-3′
em1 5′-GACTGCGTACGAATTAAT-3′
em7 5′-GACTGCGTACGAATTCAA-3′
说明： me2和 me6为正向引物； em1 和 em7 为反向引物。
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1.5 PCR产物的检测
将 PCR产物与上样缓冲液（5 1）： 混合后于质量分数为 1.5%琼脂糖凝胶上电泳， 用溴化乙锭（EB）染
色后， 在凝胶成像系统（AlphaImager HP）上观察。
2 结果与分析
2．1 无患子基因组 DNA检测
无患子叶片内富含多酚、 多糖、 蛋白质及其他次生代谢物质 ［14］， 操作时易发生褐变， 干扰 DNA 的
提取， 这些物质若残留在 DNA 样品中将会严重影响 PCR 的效果， 导致 DNA 的酶切、 扩增失败， 对后
续试验研究的开展有很大的影响。 本研究采用改良的 CTAB 法， 成功提取出质量较高的基因组 DNA，
条带较为清晰、 完整、 无拖尾， 符合 SRAP分子标记对 DNA质量的要求（图 1）。
图 1 不同无患子总 DNA电泳检测图
Figure 1 Electrophoresis of total genomic DNA from 12 different Sapindus mukurossi provenances
经紫外分光光度计测定， 其 D260/D280为1.2~2.2（表 3）， 经纯化均能达到 1.8 左右的比值。 所有样品
质量浓度均大于 430 μg·L－1， 在 SRAP分析中可获得较为清晰、 稳定的扩增结果产物。
表 3 无患子总 DNA浓度检测
Table 3 Concentration detection of total genomic DNA from 12 different Sapindus mukurossi provenances
序号 产地 D260 /D280
DNA质量浓度
（μg·L－1）
1 广西钦州 0.121 0.089 0.056 1.361 605.0
2 福建南平 0.149 0.116 0.081 1.285 745.0
3 福建清流 0.158 0.104 0.05 1.515 790.0
4 福建三明 0.319 0.157 0.008 2.030 1 595.0
5 福建漳州龙海 0.342 0.160 －0.006 2.134 1 710.0
6 福建顺昌高阳 0.219 0.119 0.026 1.834 1 095.0
7 浙江杭州 0.149 0.097 0.043 1.534 745.0
8 江西樟树 0.164 0.089 0.013 1.835 820.0
9 福建顺昌 0.086 0.043 0.002 1.983 430.0
10 印度 0.156 0.113 0.065 1.377 780.0
11 福建永安 0.130 0.088 0.045 1.486 650.0
12 印度（林科院） 0.118 0.085 0.046 1.379 590.0
D260 D280 D310
2.2 模板 DNA对 PCR扩增的影响
本试验设定了 10个用量梯度（10~100 ng）， 研究不同模板 DNA 用量对 PCR 扩增的影响。 模板 DNA
使用量在设定范围内， 都能扩增出几乎相同的清晰条带（图 2）。 10 ng 时条带比较模糊； 70~100 ng 时，
条带较淡、 呈波浪状， 20~60 ng 时主带比较清晰。 DNA 较长时间保存会部分降解， 致使有效含量降低。
考虑到试验时间较长， 为避免 DNA降解对试验结果的影响， 最终选择 50 ng作为模板优化用量。
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2．3 镁离子浓度对 PCR扩增的影响
镁离子浓度对 PCR扩增影响较大。 镁离子浓度过高时， TaqDNA聚合酶催化非特异性扩增， 降低反
应的忠实性； 反之， 镁离子浓度过低时， 则又会使 TaqDNA聚合酶的活性下降， 反应产物减少。 当镁离
子浓度为 1.00 mmol·L－1时， 未扩增出条带； 当 Mg2+浓度为 1.25~1.75 mmol·L－1时， 条带模糊， 出现缺失
现象； 当镁离子浓度为 2.00~2.50 mmol·L－1 时， 扩增带型基本一致； 当镁离子浓度增至 2.75， 3.00
mmol·L－1时， 条带呈弥散趋势（图 3）。 高浓度镁离子易产生非特异性产物， 为避免高浓度镁离子对后续
试验的影响。 本研究最终选择 2.00 mmol·L－1作为镁离子的优化浓度。
图 2 模板 DNA用量对 PCR扩增的影
Figure 2 Effect of DNA template concentration on PCR amplification
图 3 镁离子浓度对 PCR扩增的影响
Figure 3 Effect of Mg2+ concentration on PCR amplification
2.4 dNTPs浓度对 PCR扩增的影响
dNTPs 对 SRAP-PCR 反应有极其重要的作用， dNTPs 浓度过高会增加 DNA 聚合酶的错配率， 而浓
度过低又会降低产量。 dNTPs 浓度为 0.05~0.15 mmol·L－1时， 条带较少且模糊， 0.20~0.25 mmol·L－1时条
带较为清晰， 在 0.30~0.45 mmol·L－1时条带又开始模糊， 最终确定 0.20 mmol·L－1 为 dNTPs 的优化浓度
（图 4）。
2.5 TaqDNA聚合酶用量对 PCR扩增的影响
TaqDNA 聚合酶的用量与反应体积、 酶活性等因素有关。 一般酶用量过多会使非特异性增加、 弥散
背景增强， 用量过少则会降低产量， 使条带不够明亮。 当 TaqDNA 聚合酶用量为 0.5×16.67 nkat（0.5
U）和1.0×16.67 nkat （1.0 U）时， 条带均较多， 但 0.5×16.67 nkat （0.5 U）时， 条带亮度更佳； 当 TaqDNA
聚合酶用量（0.6~0.9）×16.67 nkat（0.6~0.9 U）时， 条带较少； 当 TaqDNA 聚合酶用量为（1.2~2.0）×16.67
nkat（1.2~2.0 U）时， 条带少（图 5）。 综上， 当 TaqDNA聚合酶用量为 0.5×16.67 nkat（0.5 U）时， 扩增效果
最理想， 以此作为 TaqDNA聚合酶的优化用量。
图 4 dNTPs浓度对 PC R扩增的影响
Figure 4 Effect of dNTPs concentration on PCR amplification
图 5 TaqDNA用量对 PCR扩增的影响
Figure 5 Effect of TaqDNA concentration on PCR amplification
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2.6 引物浓度对 PCR扩增的影响
引物过多会产生引物二聚体， 引物过低则降低产量。 在设定的引物浓度范围内， PCR产物量基本相
同（图 6）。 当引物浓度为 0.2~0.4 μmol·L－1有较清晰、 一致的条带， 且 0.4 μmol·L－1时， 条带较亮； 当引
物浓度为 0.5~1.0 μmol·L－1开始条带渐变弱， 扩增效果不佳， 均较模糊。 综上， 选择 0.4 μmol·L－1作为
引物的优化浓度。
2.7 SRAP-PCR反应体系的确立
本研究用引物组合 m2e7 和 m6e1 在无患子材料
中进行 SRAP-PCR 优化反应体系验证， 扩增结果比
较稳定、 条带清晰（图 7）， 且引物组合 m6e1 扩增出
的多态性条带较引物组合 m2e7 多， 表现出更高的多
态性。 由此说明， 该体系适宜无患子 SRAP-PCR 反
应。
通过对反应体系的验证， 从结果的稳定性和经
济性出发， 确立了适合无患子的 SRAP-PCR 反应体
系为： 在 20 μL 反应体系中， 含模板 DNA 为 50 ng，
镁离子 2.0 mmol·L－1， dNTPs 0.2 mmol·L－1， TaqDNA
聚合酶 0.5×16.67 nkat（0.5 U）, 引物 0.4 μmol·L－1。
图 7 优化体系验证图（左 m2e7， 右 m6e1）
Figure 7 Optimized system verification（left m2e7， right m6e1）
3 讨论
SRAP 标记是一种基于 PCR 的新型分子标记技术， 具有以下优点： ①有一套通用引物， 可任意搭
配， 通过筛选获取适合引物对， 极大降低了引物合成费用。 ②反应条件相对固定， 试验重复性较好， 操
作简易。 因此， 在林木种质资源遗传多样性、 品种鉴定等方面应用前景广阔［17-19］。
SRAP-PCR反应体系主要包含 5 个影响因素， 即 DNA 模板、 镁离子、 dNTPs、 引物和 TaqDNA 聚合
酶。 各个因素用量不同， 将明显影响扩增效果， 进而影响 SRAP 分子标记的可靠性。 高质量 DNA 的获
取是 PCR成功的根本性因素， DNA中残留的蛋白、 酚类等物质， 会抑制 DNA聚合酶。 本研究中， 采用
改良的 CTAB法提取了较高质量的 DNA， 符合 SRAP-PCR反应要求。
PCR混合物中， DNA模板、 引物和 dNTPs的磷酸碱基均可与镁离子结合， 降低镁离子的实际浓度；
而对 TaqDNA 聚合酶起作用的是游离的镁离子， 因此， 镁离子加入量应高于 dNTPs［13］。 本试验中， 镁
离子浓度比 dNTPs 高出 1.8 mmol·L－1。 PCR 扩增产物的大小是由引物限定的， 引物浓度过高， 不仅会促
进非特异性产物的合成， 而且还会增加引物二聚体的形成， 本研究最终选择 0.4 μmol·L－1作为引物的优
化浓度。
本试验采用传统的单因素法， 确立了适合无患子的 SRAP-PCR 反应体系。 利用该体系对 12 个种源
地的无患子进行扩增， 得到了稳定清晰的条带， 效果良好， 说明优化后的体系适宜无患子种质资源的分
图 6 引物浓度对 PCR扩增的影响
Figure 6 Effect of primers concentration on PCR amplification
100
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子标记分析， 但需对 SRAP 引物进行筛选。 SRAP-PCR 优化体系的建立， 为 SRAP 分子标记在无患子地
理种源多态性分析、 遗传图谱构建、 品种鉴定等方面打下良好的基础。
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中国农民发展研讨会在浙江农林大学举行
2013 年 12 月 14 日至 15 日， 由国务院参事室、 浙江农林大学、 浙江省人民政府参事室、 浙江省社
会科学界联合会等共同主办的中国农民发展研讨会在浙江农林大学举行， 来自全国 “三农” 研究领域的
领导、 专家学者共 150余人汇聚一堂， 共商中国农民发展问题。 浙江农林大学党委书记宣勇致欢迎辞。
研讨会以总结中国改革开放以来的农村改革发展， 贯彻党的十八届三中全会精神为主题， 以全面深
化农村改革、 健全城乡发展一体化的体制机制、 促进农民发展为主线， 重点围绕农业现代化、 农村社会
发展、 新型城镇化与农民全面发展等方面， 聚焦农业经营体系、 农村产权制度、 城乡要素市场和社会治
理体制等各项改革。
会议围绕推进城镇化与城乡发展、 明晰集体产权、 建立农民以土地等入股的公司制、 推进村镇城镇
化、 赋予农民更多财产权利、 改革乡村治理机制等议题展开研讨。 与会专家认为， 农民问题是 “三农”
问题的核心， 农民发展是中国发展面临的最大课题。 中国改革发展的实践经验表明， 只有充分调动农民
的积极性， 充分尊重农民的首创精神， 坚持市场化改革取向， 循序渐进地推进农村改革和建设事业， 让
作为最大群体的农民成为改革发展的主力军， 才能为实现全面建设小康社会的宏伟目标奠定坚实的基
础。 党的十八届三中全会为农民全面发展开辟了更广阔的前景， 中国的农村改革又一次站在了新的历史
起点上， 需要进一步全面深化城乡综合配套改革、 健全城乡发展一体化的体制机制。
浙江农林大学中国农民发展研究中心主任、 浙江省人民政府参事顾益康介绍了中国农民 “十大贡
献” 暨中国农民发展研究中心系列研究成果， 主要成果包括《改革开放 35 年农民对中国发展的十大贡
献》《改革开放 35 年中国农民发展报告》《改革开放 35 年中国农民发展指数与区域评价报告》《改革开放
35 年浙江农民发展报告》和《我国西部地区百村发展报告》等。 这些研究报告系统地分析了中国改革开
放以来， 中国农业、 农村和农民发展的历程、 成就、 经验和面临的新挑战， 提出了新时期进一步促进中
国农民全面发展的路径与对策。
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