全 文 ：第 30卷第 3期
2009年 6月
宁夏师范学院学报(自然科学)
JournalofNingxiaTeachersUniversity(NaturalScience)
Vol.30 No.3
Jun.2009
裂褶菌深层发酵工艺的初步研究
郑　正
(清远职业技术学院 , 广东 清远　511510)
　　摘　要:裂褶菌是一种药食兼用菌 , 含多种有效成分.采用单因子试验 ,研究了裂褶菌液体深层培养过程中
通气量以及搅拌转速对裂褶菌丝体生长的影响.试验结果表明 ,在不同通气量和搅拌转速下裂褶菌生长具有明
显差异 ,在通气量为 150L/h,搅拌转速 200r/min条件下菌体得率最高 , 达到 15.45g/L.试验结果为裂褶菌的进
一步放大培养提供了参考依据.
关键词:裂褶菌;菌丝体;通气量;搅拌转速
中图分类号:TQ92　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1674-1331(2009)03-0032-04
收稿日期:2009-05-07
作者简介:郑正(1983-), 男 ,江苏人 , 实验员.
1　引言
裂褶菌是一种药食兼用菌 ,含多种有效成分 ,
其子实体与液体培养产物可供作药用 , 裂褶菌胞
外多糖是一种特有的 、稳定的 、电中性的多糖.其
研究始于 60年代.在 1969年 , N.Komatsu等人 [ 1]
就从裂褶菌中分离提取到了裂褶菌胞外多糖 ,并
证明了它具有抗肿瘤活性.早在 1985年的日本 ,
台糖科研制药已成功地运用深层发酵技术进行大
规模工业化生产裂褶多糖 ,其注射针剂已临床应
用于治疗子宫颈癌 ,当年产值便达到一亿两千八
百万美元 [ 2] .国内 ,南京大学的李兆兰等人在 90
年代对裂褶菌多糖的分离 、提取 、构象及其培养工
艺进行过较为全面的研究 ,在对小鼠进行的药理
试验表明 ,胞内多糖可恢复免疫功能 ,在延缓衰老
等方面意义重大 [ 3 -5] .山东省新药药理研究中心
刘兆平主任对裂褶多糖的药效学的研究 ,表明裂
褶菌多糖能提升白细胞 ,增强巨噬细胞的吞噬活
性 ,对实验小鼠的耐缺氧和抗疲劳有明显的
作用[ 3] .
裂褶多糖主要来自固料栽培的裂褶菌子实
体 ,而传统的固料栽培具有周期长 、占地大 、受季
节和原料限制等缺点 ,难以进行大规模生产 ,不能
满足人们的需要 ,所以 80年代后 ,裂褶菌的研究
由固料栽培的裂褶菌子实体转向对其进行深层培
养的研究 [ 6] .A.PROKOP等人对单核裂褶菌和双
核裂褶菌之胞外 β-1, 3-/β-1, 6-葡聚糖的生产进行
研究 ,单核裂褶菌株杂交后 ,得到的某些双核菌丝
体经 120h的深层培养后能产约 12g/L的胞外 β -
1, 3-/β-1, 6-葡聚糖 [ 7] .国内裂褶菌深层培养的研
究尚限于试验阶段 ,工业化生产尚未见有报道.上
海师范大学的夏鉴清和钱秀萍[ 8] 、浙江医学研究
院药物所的王凤仙 [ 9] 、华南理工大学的江学斌 [ 10]
等曾对裂褶菌的深层培养有过一定的研究.
本文主要进行裂褶菌 10L发酵罐培养 ,对培
养过程中影响菌体生长的重要参数通气量和搅拌
转速进行研究 ,以获得裂褶菌液体深层培养的最
适工艺条件 ,为其进一步的大规模培养提供参考
依据.
2　材料和方法
2.1　实验材料
2.1.1　菌种
裂褶菌 (Schizophylumcommune):天津科技
大学天津工业微生物重点实验室提供.
2.1.2　培养基
第 3期 郑正:裂褶菌深层发酵工艺的初步研究
斜面种子培养基:PDA培养基(g/L)
马铃薯 200g/L,葡萄糖 20g/L, MgSO4· 7H2O
1.5g/L, KH2PO4 3g/L, VB1 0.01g/L,琼脂 20g/L,
加入 20%的土豆汁至 1L.
液体种子培养基 (g/L):葡萄糖 30g/L,黄豆
粉 10g/L,酵母膏 1.0g/L, MgSO4· 7H2O0.5g/L,
KH2PO4 1.0g/L, VB1 0.01g/L, pH6.0.
发酵培养基(g/L):12°Brix麦芽汁 , 0.5%NH4Cl.
2.2　实验方法
2.2.1　菌体培养方法
种子斜面培养:从原始菌种斜面中用接种钩
切 1cm2带培养基的斜面菌丝转入另一支斜面试
管中 ,置于培养箱中 , 26℃,培养 6d.
液体种子培养:从斜面试管中用接种钩切
1cm2带培养基的斜面菌丝转入装液量为 150mL
的 500mL的摇瓶中 , 26℃, 150r/min,培养 3d.
发酵罐分批培养:发酵罐容积 10L, 装液量
7L,接种量 10%, 培养温度 26℃, 通气量 100-
160L/h, pH不调节 ,搅拌转速 100-300r/min,培养
5-6d.
2.2.2　检测方法
(1)菌体量的测定:取一定量发酵液 , 3000r/
min离心 10min,弃上清液 ,菌体用水洗 、再离心 ,
直至上清液不再带有发酵液颜色为止.收集菌体 ,
在 60℃恒温烘箱中烘干至恒重 ,称量 ,菌丝得率由
下式计算:
菌体得率(%)=菌丝干重 (g)/发酵液体积
(mL)×100%
(2)菌液的镜检:用接种环取发酵液少许 ,均
匀涂布于载玻片上 ,用镊子夹住后于酒精灯火焰
上微火烤干 、固定 ,冷却后 ,滴加 0.1%美蓝染色液
一滴 ,染 1-3min,用水轻轻冲洗掉多余的染色液 ,
待干后 ,在显微镜下观察.
(3)还原糖的测定 [ 11] :采用 DNS法(3, 5-二硝
基水杨酸比色法)
3, 5-二硝基水杨酸 6.3g,重蒸苯酚 5g,亚硫酸
氢钠 5g, NaOH2N262mL,酒石酸钾钠热溶液(182g
酒石酸钾钠溶于 500mL水中),搅拌溶解 ,冷却 ,定
容至 1000 mL,配好后存放于棕色瓶中 ,稳定 1周
后使用.准确吸取 1mg/mL的标准葡萄糖溶液(葡
萄糖预先于 105℃烘至恒重)0, 0.1 , 0.2, 0.4, 0.6,
0.8, 1.0, 1.2mL加入比色管中 ,分别加蒸馏水补
至 2.0mL,加 DNS显色液 2.0mL,摇匀后 ,置于沸
水浴中加热 5min,冷却后加蒸馏水至 25mL,以 1
号管作为空白样 ,测定其余管在 540nm波长处的
光密度值.以还原糖含量作横坐标 ,相应光密度为
纵坐标 ,绘制葡萄糖标准曲线(图 1).
图 1　葡萄糖标准曲线
样品经稀释一定倍数取 1.0mL,按同样操作
测光密度值 ,在标准曲线上求得相应的还原糖含
量 ,再乘以稀释倍数即得样品的还原糖含量.
3　结果与讨论
3.1　通气量对菌丝体生长的影响
发酵罐搅拌转速固定为 200r/min,改变发酵
过程中的通气量 ,观察裂褶菌生长情况.
3.1.1　通气量为 100L/h
图 2　100L/h通气量下发酵过程曲线
裂褶菌生长可分为四个时期:0-24h为适应
期 , 24-96h为对数期 , 96-104h为稳定期 , 104h之
后为衰亡期.
从图 2可看出 ,随着培养时间的增加 ,菌体迅
速增长 ,在 96h达到最高.还原糖在前 、中期迅速
·33·
宁夏师范学院学报(自然科学) 2009年 6月
被利用 ,这是菌体生长和产物形成的结果.菌体达
到最大量时的还原糖消耗速率为 0.344 g/L/h.在
多糖达到最高值时 ,还原糖降至 50%以下 ,之后基
本不变.培养 96h后菌体得率系数 Yx/s(每消耗
1g还原糖所产的菌丝干重)为 0.38g/L.
发酵过程中 pH比较稳定 , 后期稍微有所降
低 ,这是由于在发酵过程中裂褶菌会分泌少量的
苹果 酸 的缘 故.经 发 酵 得 到 菌 丝体 干 重
为 12.44g/L.
3.1.2　通气量为 150L/h
图 3　150L/h通气量下发酵过程曲线
从图 3中可看出 , 当通气量提高到 150L/h
时 ,其发酵过程曲线与通气量为 100L/h时的曲线
相差不大.裂褶菌生长也是分为四个时期:0-24h
为适应期 ,菌体生长缓慢;24-96h为对数期 ,菌丝
大量生长;96-104h为稳定期;104h之后为衰亡期.
菌体量在 96h达到最高.pH比较稳定 ,在整个发
酵过程中变化不大 ,总体呈下降趋势.
还原糖在前 、中期迅速被利用 ,在菌体量达到
最高后 ,还原糖开始缓慢下降.菌体达到最大量时
的还原糖消耗速率为 0.354g/L/h.此刻还原糖降至
50%以下 ,之后基本不变.培养 96h后菌体得率系数
Yx/s0.45.经发酵得到菌丝体干重为15.45g/L.
通过分析 ,我们发现在一定范围内改变通气
量 ,而搅拌转速维持不变 ,对裂褶菌的发酵过程不
会有太大的影响.但是 ,提高通气量有利于菌体的
生长.
3.2　搅拌转速对菌丝体生长和胞外多糖产量的
影响
通气量固定在一定 150L/h,改变发酵罐搅拌
转速 ,观察菌丝生长情况.
3.2.1　转速为 100r/min
从图 4中可看出 ,菌体量在 128h达到最高 ,
pH比较稳定 ,在整个发酵过程中变化不大 ,总体
呈下降趋势.
图 4　100r/min搅拌转速下发酵过程曲线
还原糖在前 、中期迅速被利用 ,在菌体量达到最
高后 ,还原糖开始缓慢下降.菌体达到最大量时的还
原糖消耗速率为 0.281g(L/h).此时还原糖降至 44%
以下 ,之后基本不变.培养 128h后菌体得率系数 Yx/s
0.41.经发酵得到菌丝体干重为 14.68g/L.
3.2.2　转速为 200r/min
裂褶菌在搅拌转速为 200r/min时的发酵过程
同 3.1.2.
3.2.3　转速为 300r/min
从图 5中可看出 ,裂褶菌在搅拌转速为 300r/
min时的发酵过程曲线与转速为 100r/min时的发
酵过程曲线非常相似.所不同的是菌体非常密集
且呈细小梭状 ,这是由于转速较大的缘故.在整个
发酵过程中 , pH值波动不大 ,总体呈下降趋势.
图 5　300r/min转速下发酵过程曲线
还原糖随着培养时间的增加 ,逐渐被菌体消
耗 ,前 、中期迅速被利用 ,在菌体量达到最高值后 ,
还原糖开始缓慢下降.菌体达到最大量时的还原
糖消耗速率为 0.278g/L/h.此时还原糖降至 50%
左右 ,之后基本不变.培养 108h后菌体得率系数
Yx/s0.43.经发酵得到菌丝体干重为 12.86g/L.
·34·
第 3期 郑正:裂褶菌深层发酵工艺的初步研究
此次分批发酵菌体得率较低 ,分析其主要原
因有以下两个方面:
(1)发酵液粘稠带来的问题:发酵后期随着多
糖的产生 ,发酵液变得非常粘稠.发酵液粘稠会引
起一系列严重的问题 ,如营养物质 、溶解氧等在发
酵罐中会出现差异 ,发酵液不能很好地混合 ,从而
整个系统会出现差异 ,并可能会出现营养梯度 ,在
需氧发酵中出现氧的制约.氧的传输受到限制 ,溶
解氧不能很好地通过液膜 、菌丝丛 、细胞膜扩散到
细胞内需氧的代谢部位 ,导致菌体生长不完全 ,并
且提前自溶.
(2)菌体形态对代谢产物生成的影响:当搅拌
转速变为 300r/min时 ,发酵罐中裂褶菌形成大量
的呈细小梭状的菌体 ,菌体正常生长受到影响.
经综合分析 ,裂褶菌在通气量 150L/h,搅拌转
速 200r/min时的菌体得率最大 ,为 15.45g/L.
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ThePreliminaryStudyontheIn-depthFermentation
ProcessofSchizophyllumCommune
ZHENGZheng
(QingyuanVocationalTechnicalColege, Qingyuan, Guangdong　511510)
Abstruct　Schizophylumcommuneisakindofofficinalandediblefungiwithmanyactiveingredient.Inthispaper, the
effectsofaerationrateandrotatespeedonthegrowthofSchizophylumcommuneduringsubmergedculturewerestudiedbytheway
ofsinglefactorexperiment.Theresultsshowedthatthegrowthrateofmyceliumwereobviousdifferentunderdiferentaerationrate
androtatespeed.Thehighestyieldof15.45g/Lwasobtainedwhenaerationratewas150L/handrotatespeedwas200r/min.The
resultswasoferedsomereferencetothefurthermasscultureofSchizophylumcommune.
Keywords　Schizophylumcommun;Mycelium;Aerationrate;Rotatespeed
[责任编辑　刘碧蕊 ]
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