全 文 ：上海农业学报 10 88 , 4 ( 1 ) : 17一 2 2
刁 e t a 刀g r f c u l t u r a e S h a ” g h a `
草菇和银丝草菇的原生质体分离
及 菌 丝 再 生
王辅德 宛新衫 叶叙丰 叶桂珍 夏镇澳
(中国科学院上海植物生理研究所 , 上海 )
摘 要 本文报道了草菇 (犷 o l v a r i e l l a v o l v a e e a )和银丝草菇 ( 犷 . b o m 6 , c i n a )菌丝原生质体
的分离 、 纯化 、 培养和再生 。 结果表明: 1 . 溶 壁 酶 、 纤维素酶能破壁分离原生质体 , p一葡糖普
酸酶有增效作用 ; 2 . 用于分离原生质体的菌丝年龄以 2天为宜 , 酶解时间 2 一 4 小时即可 , 3 . 所
得的原生质体活力可达 9 0 . 9一 9 1 . 8% , 4 . 原生质体再生菌丝有多种方式 。
关越词 原生质体 ; 菌丝体 ; 溶壁酶 ; 菌丝再生 , 草菇 , 银丝草菇
草菇 (犷 o l o a r i e l l a o o l o a e e a ) , 银丝草菇 ( 厂 . b o m b夕e i n a ) 同属担子菌纲包脚菇属 , 是美
味的食用菌 . 草菇子实体的生长发育最适温度为邓一 3 2℃ 。 而在这样高的温度条件下 , 无论
是蘑菇 、 香菇或平菇都难以生产 。 因此 , 种植草菇可调节高温季节食用菌的生产 , 有利于做
到食用菌的周年供应 。
近年来 , 原生质体融合技术日趋完善 , 在遗传育种学上引起了广泛的重视 。 通过原生质
体诱导融合 , 为远缘杂交开辟了一条新的途径 。 在食用菌方面如金针菇 、 平菇 、 木耳 、 草菇
等〔’ 一 ’ 1 , 近来也开展了一些原生质体的研究工作 .
草菇一般栽培品种的子实体为鼠灰色 , 罐头菇或鲜菇色泽都深 , 欠美观 , 难以适应国际
市场的更高要求 。 银丝草菇的子实体为白色或略带浅黄 , 色泽美观 , 但它在我国很少栽培 ,
菌种驯化也不够理想 , 产量不高 。 用原生质体融合技术将两种草菇进行杂交有可能改善草菇
子实体的色泽或提高银丝草菇的产量 . 本文报道这两种草菇菌丝的原生质体分离 、 培养和菌
丝再生的结果 , 为诱导融合打下基础 。
材 料 与 方 法
(一 ) 菌种 草菇 (犷o l v a , f e l l a v o l” a e e a ) , 银丝草菇 (犷 . b o m b g c i o a )均由福建省三明真菌
研究所提供 .
(二 ) 培养甚 菌丝斜面培养基为常规的马铃薯培养基 ; 菌丝液体培养基为马铃 薯 培养
基再添加 0 . 3% K H : P O ` , 0 . 16 % M g S O ` · 7 H : O , 0 . 0 1 % V B : ; 原生质体再生 培养 基的组
成为 20 %的马铃薯汁 1 0 % , K H : p o ` 0 . 2 % , ( N H 一) : 5 0 ` 0 . 4 % , M g s o ` · 7H : 0 0 . 1% ,
本文于 1日87 年 9月 19 日收到 。
8 1上 海 农 业 学 报 4卷
V B 0 1
.
0 1 %
, 蔗糖 1 . 5% , 用 0 . 6 M K C I 作渗透压稳定剂 。
(三 ) 醉制剂 纤维素酶 E A 3书 67( 本所自制 ) ; 纤维素酶 ( O n oz u k a R 一10) ; 蜗牛酶 (本
所自制 ) 日一葡糖普酸酶 (上海生化所东风生化试剂厂 ) ; 溶壁酶 (广东微生物所 ) 。
( 四 ) 菌丝培养 将供试菌接种在马铃薯琼脂培养基上于 3 4℃培养七天 , 然 后再 将新鲜
菌丝接种于菌丝液体培养基内在 3生一 3 6℃ 静置培养 。 试验时取用不同菌龄的菌丝 .
( 五 ) 原生质体分离 取不同菌龄的菌丝 , 以 20 Om g Zm l的菌丝量加入不同组成 的酶溶液 ,
于 8 生一3 6℃保温 , 保温结束后用 2 0 0 目尼龙丝网再在其上加一薄层脱脂棉滤去残 留的菌丝 ,
然后用 10 O rP m 离心 5 分 钟收集原生质体 。 原生质体经 O . 6 M K CI 和原生质体培养基洗涤
后备用 。 根据需要 , 原生质体再用 2 1 %的蔗糖溶液迸行 离心纯化 。 试验前原 生质体用荧光
增白剂染色检查去壁是否完全 , 再以荧光素双醋酸醋染色以确证原生质体的活力 汇8 , “ 〕。 原生
质体计数用血球计数板进行 。
(六 ) 原生质体培养 将制得的原生质体稀释至 」x l少一 l x 1 0 5 2m l 浓度备用 。 固体双层
培养是用直径 c3 m 的培养皿 , 先加一层 含 0 . 6 %琼脂的培养基 , 凝固后取 0 . 1一 0 . 2 m l 原生
质体悬浮液涂布于其表面 , 稍停片刻再在其上加一薄层含 0 . 3 %琼脂的相同 成分的培养基 ,
置斜一 3 6℃培养 。 液体浅层培养是在直径 c3 m 的培养 皿 中加入 1一 1 . 6m l 的原生 质体悬浮
液 ,于 3 4一 3石℃培养 。
结 果 与 讨 论
(一 ) 原生质体分离 对于高等担子菌细胞壁的成分 , 一般认为除纤维素 、 半纤维素外 ,
还含有日一葡聚糖 、 几丁质 、 壳聚糖等特殊多糖 I’ 〕。 试验用了纤维素酶 E A 3一 6 7 , 纤 维素
酶 O n o z u k a R一1 0 , 蜗牛酶 , 日一葡糖普酸酶及溶壁酶等 。 从表 1 的资料可 以看出 除溶 壁酶
脱壁效果较好外 , 其它几种酶的效果均不够理想或无效 。 溶壁酶合适浓度如表 2 所示 , 1%
T a b l e
表 1 不 同 醉 类脱 壁 的效 果
P r o t o P l a s t s i s o l a t i o n b y v a r i o u s e n z y m e s
酶 类
E n z y m e
原生质体数 x 10 5 / m l
N u m be r o f p : o t o p l a s t s 欠 2 05 / m l
草
V
,
菇
v o l v a e e a
银丝草菇
V
,
b o 川b夕 e n` e
溶
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一一一一一…一一。一。一一一?w a l l z y m e蜗 牛 酶 } 。 i -蜗S 里轰e n z y m e纤维素酶E A 3一8 67C e l l u l a s e E A : 一 8阶日一葡糖普酸酶日一 g l u e u r o n i d a s e
纤维素酶O n o z u k a R 一 1 0
C e l l u l a s e O n o z u k a R 一 1 0
1 期 王辅德等 : 草菇和银丝草菇的原生质体分离及菌丝再生 拍
已足 , 浓度再增高 , 其脱壁效果并未增加 .
溶壁酶和其它酶协同脱壁的效果见表 3 . 除果胶酶外其 它的酶都有 增效作用 , 日一葡糖
普酸酶更为 明显 。 山田理 [ ’ ]和 A be 等 [“ 〕曾报道过从金针菇 、 糙皮侧耳 、 香 菇等菌丝中游离
原生质体需要用 日/ 葡糖普酸酶 。
表 2 溶壁醉浓度对原生质体游离的影晌
T a b l e 2 I n f l u e n e e o f l y w a l l z y m e e o n e e n t r a t i o n o n t h e i s o l a t i o n o f p r o t o p l a s t s
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T a b l e
裹 3 醉组合与草菇原生质体分离的效果
E n z y m e e o m b i n a t i o n a n d P r o t o P l a s t i s o l a t i o n o f 犷 . 口 o l v a c e a
组 合 酶 类 原生质休数 x l沪 /过 1N u m b e r o f P r o t o P l a s t x 1 0, /扭 1
溶壁酶 1% ( A )
L y w a l l z y m e l % ( A )
A + 果胶酶 0 . 5 % ( B )
A + M a e e r o z v m e R
一 1 0 0
.
5 % ( 5 )
A + B + 蜗牛酶 0 . 5% ( C )
A + B + S n a i l e n z y m e 0
.
5 % ( C )
A + B + C + 日一葡糖普酸酶 0 . 3%
A + B + C + 日一 g l u e u r o n i d a s e 0 . 3%
菌丝的培养时间对原生质体游离的得率影响较大 (如图 1 所示 ) 。
两种草菇的脱壁效果都是以较幼嫩的菌丝 (培养 2天 ) 较好 , 原生质体的得率高 。 酶解时间 ,
草菇以 2一4 小时为宜 , 银丝草菇则以 4一 6 小时为宜 。 时间过长原生质体得率反而下降 . 所
得的原生质体经荧光增白剂染色 , 镜检证明脱壁效果 良好 , 圆形的原生质体周围未见有残壁
存在 . 原生质体的活力用荧光素双 醋酸醋染色后 , 在荧光显微镜下计数 , 有活力的原生质体
草菇占 91 . 8 % , 银丝草菇占 9 0 . 9 % 。
( 二 ) 原生质体培养和菌丝再生 原生质体经过滤 , 洗涤纯化后 , 以 1一 6 义 1 0丫m l 密度
悬浮于再生培养基中培养 , 3 一 5 天后 , 在液体浅层 , 悬滴 , 双层固体等方式的培养中都可
观察到有菌丝再生 。 其方式有 : ① 单个原生质体 直接由一端或 二端长 出菌丝 ; ② 原生质
捧先分裂成串再由一端长出菌丝 , ③ 原生质体先长成团 然后由一处或 几处长 出菌丝 〔图版
;琦刃〕, 这几种再生方式山田理 [` 1、 阮一骏等〔6 ]也曾在金针菇、 糙皮侧耳 、 黑木耳 、 毛木耳
令的原生质体培养中观察到 . 阮一骏等认为原生质体生长成串通常是由于胞壁结构不完整 ,
2O 上 海 农 业 学却 拇 衣 报 4 卷
1 0
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图 1 酶解时间对原生质体得率的影响
F 19
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1 I n f l u e n e e o f r e a e t i o n t i m e o n t h e f o r m a t i o n o f P r o t o P l a s t
T b a l e 4
草菇 、 银丝 , 菇 . 生质体的活力
犷 . u o l. a e e a a n d 犷 . bo m b, e i . a P r o t o P l a s t s
种 别
S Pe e i e s
衰 4
V i t a l i t y o f
观察总数
N u m b e r o f
d e t e r m i n a t i o n s
有荧光数
F l u o r e s e e n e e
( p o s i t i v e )
无荧光数
F l u o r e s e e n e e
( n e g a t i v e )
活力 (% )
V i t a l i t y (% )
草犷 . 菇盯 0 1口 a c e a 26 9 2 47 22 9 1。 8
银丝草菇犷 . b o m b g c i” a 3 3 1 3 01 30 9 0
。
9
因而不能发育成菌丝 , 一旦胞壁再生完成 , 串珠状的原生质体就 可以从一 端 或二端长出菌
丝 。
为便于得到由原生质体再生的单菌落 , 曾将浅层培养 2 一 3 天的原生质体悬浮液再转入
固体平皿培养 , 每皿涂布 0 . l m l , 在 34一3 6℃培养 3 天就可在平皿上长出许多单菌落〔图版
8 刁. 菌丝体在上述适宜的条件中不断生长 , 均能获得子实体〔图版 9 」一

22上 海 农 业 学 报 4卷
参 考 文 献
[l 〕 山田理等 , 198 3 : 日本食品工业学会豁 , 30 ( 9 ) : 13一 1 8
〔 2 〕 A B E , M . , e t a l . , 19 82 : A g r i e . B i o l . C h e m . 46 : 195 5
〔 3 〕 何强泰等 , 198 4 : 微生物原生质体融合学术讨论会资料
〔 4 〕 廖汉泉等 , 198如 微生物原生质体融合学术讨论会资料
〔 5 〕 阮一骏等 , 19 8:5 全国食用真菌遗传学术讨论会资料
[ 6 ] C h a n g
,
5
.
T
. ,
19 85 : U n e s e o r e g i o n a l w o r k s h o p o n a p p l i e a t i
o n o f m i e r o b i a l p r o t o p l a , t s
i
n g e n e t i e m a n i p u l a t i o n a n d g e n e t i e e n g i n e e r i n g
,
D e Pa r t m e n t o f B i o l
.
S e i e n e e C e n t e r
,
T h e C h i n e s e U n i v e r s i t y o f H o n g K o n g
[ 7 〕 M a s a t a k e , O H M A S A , 19 8 6 : J a p a n . J . B r e e d . 3 6 : 42 9一 43 3
〔 8 〕 王辅德等 , 198 :1 植物生理学通讯 , 1 : 59 一 61
〔 马〕 王辅德等 , 198:3 细胞生物学杂豁 , 2 : 16 一 18
MY C E L IUM P RO T O P LA S T S ! SO L AT旧N AN D RE G EN E RA一
T 10 N O F V O L V A R I E L L A V O L V A C E A A N D
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A b s t r a e t T h e i s o l a士i o n , p u r i f e a t i o n a n d e u l t u r e o f m y e e l i u m p r o t o p l a s t s a s
w e l l a s r e g e n e r a t i o n o f 犷0 1” a r f e l l a v o l口 a e e a a n d F o l v a r i e l l a b o 川 b夕e i n a w e r e s t u -
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a e h i甲 e d b y u s i n g l y w a l l z y m e a n d e e l l u l a s e a n d a d d i t i v e e f f e e t o f 日一 g l u e u r o n i -
d a s e w a s o b s e r v e d ; 2 ) t h e a g e o f m y e e l i u m s u i t a b l e f o r p r o t o p l a s t s i s o l a t i o n w a s
tw o d a y s a n d t w o 一 f o u r h o u r s o f e n z y m e t r e a t m e n t w e r e e n o u g h ; 3 ) t h e v i t a l i t y
o f p r e p a r e d p r o t o p l a s t s w a s 9 0
.
0一9 1 . 8 % ; 4 ) t h e r e g e n e r a t i o n o f m y e e l i u m
f r o m p r o t o p l a s t s w a s p论r f o r m e d b y d i f f e r e n t f o r m s .
K e y w o r d s P r o t o p l a s t
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