全 文 :生 物 技 术 2011 年 21( 1)
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裂褶菌培养、鉴定及氨基酸组成分析
潘欣1,2,邹立扣3* ,岳爱玲3,张悦3,姚琼3,罗燕3,李蓓3
( 1.成都理工大学旅游与城乡规划学院,四川 成都 610059; 2.四川农业大学林学院,四川 雅安 625014;
3. 四川农业大学都江堰校区微生物学实验室,四川 都江堰 611830)
摘要:目的:获得裂褶菌的纯培养物,鉴定培养菌丝,并分析子实体及菌丝氨基酸含量。方法:利用孢子分离法、组织分离法
培养菌丝,扫描电镜观测其菌丝特征,结合 ITS区序列分析,并利用出菇试验分析其菌丝体,全自动氨基酸分析仪分别测定裂褶
菌子实体、菌丝体氨基酸组成。结果: 菌丝体 ITS区序列与子实体完全一致,出菇试验亦表明裂褶菌菌丝体培养成功,子实体及
菌丝体均含有丰富的氨基酸成分,两者氨基酸种类及含量相当,菌丝体总氨基酸含量 14. 01%,子实体总氨基酸含量 15. 59%,其
中菌丝体必需氨基酸的含量( 38. 60% ) 比子实体稍高( 37. 95% ) 。结论:裂褶菌菌丝亦具有丰富的营养价值,可作为重要的氨基
酸来源及功能性食品。
关键词:裂褶菌;培养; 鉴定;氨基酸
中图分类号: Q93 - 331; Q939. 5 文献标识码: A doi: 10. 3969 / j. issn. 1004 - 311X. 2011. 01. 020
Cultivation,Identification of Schizophyllum commune and Analysis
of Its Amino Acid Compositon
PAN Xin1,2,ZOU Li - kou3* ,YUE Ai - ling3,ZHANG Yue3,YAO Qiong3,LUO Yan3,LI Bei3
( 1. College of Tourism and Urban and Rural Planning,Chengdu University of Technology,Chengdu 610059,China;
2. College of Forestry,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China;
3. Lab of Microbiology,Dujiangyan Campus of Sichuan Agricultural University,Dujiangyan 611830,China)
Abstract: Objective: The aim of the study is to obtain and identify the mycelium of Schizophyllum commune,and analyze the amino acids
composition of mycelium and fruiting body. Method: The mycelium was cultivated and purified on the PDA plates at 25℃ for three to five
days. Both morphological and molecular methods were used to identify the fungi. Apart from this,mushroom was also obtained. The inter-
nal transcribed spacer ( ITS) region in rRNA gene was cloned and sequenced,and the sequence was compared with others species in the
Genbank. Besides,the component of amino acid was analyzed using amino acid auto analyzer. Result: The results showed that the ITS
sequence was same between mycelium and fruiting body. The molecular marker of ITS sequence was necessary and useful. The total amino
acids account for 14. 01% and 15. 59% in the mycelium and the fruiting body. The composition of mycelium essential amino acids was
higher ( 38. 60% ) than that of fruiting body ( 37. 95% ) . Conclusion: Therefore,S. commune especially the mycelium is nutritious and
can be developed to be a functional product.
Key words: Schizophyllum commune; cultivation; identification; amino acids
收稿日期: 2010 - 10 - 03; 修回日期: 2010 - 12 - 11
作者简介:潘欣( 1979 - ) ,女,博士,讲师,从事森林生态及大型真菌研
究。* 联系作者:邹立扣( 1979 - ) ,男,博士,副教授,硕导,从事微生
物及分子生物学研究,Email: zoulk124@ 163. com。
裂褶菌 ( Schizophyllum commune) 又名白参、灰树花,有特
殊的浓郁香味,性平,昧甘,能滋补强壮、扶正固本、镇静作用,
治疗神经衰弱、精神不振、头昏耳鸣、虚汗,是一种高档食、药
用菌,其代谢产物具有较好的药用价值[1]。裂褶菌在真菌分
类上隶属于菌物界 ( Fungi) 真菌门 ( Eumycota) 、担子菌亚门
( Basidiomycotina) 、层菌纲 ( Hymenomycetes ) 、伞菌目 ( Agari-
cales) 、裂褶菌科 ( Schizophyllaceae ) 、裂褶菌属 ( Schizophyl-
lum) [2]。裂褶菌子实体 或菌丝体 含有丰富的免疫性多糖、蛋
白质 、生物活性 L型氨基酸 、多种必需氨基酸和微量元素等,
这些物质分别对心血管和肝、肾等多种器官疾病具有防治作
用,并具有抗癌、抗衰老、抗炎症等功效[3,4]。近年来,日本及
欧美等国在分子生物学、抗癌活性物质和优良菌株的选育等
方面进行了广泛的研究,国内的研究重点集中于发酵条件、人
工驯化栽培和药用价值[5,6]。裂褶菌中含有多种活性成分,尤
其对裂褶菌多糖( Schizophyllan,SPG) 研究报道较多[3,7],但对
裂褶菌的分子鉴定、氨基酸组成分析等报道较少。鉴于此,本
文对裂褶菌的培养特性、菌丝特征进行了描述,结合分子生物
学方法对菌丝体进行鉴定,并利用全自动氨基酸分析仪分析
裂褶菌子实体及菌丝体氨基酸组成。
1 材料与方法
1. 1 材料
裂褶菌子实体样品采集自四川西昌,大肠杆菌 JM109 由
四川农业大都江堰校区学微生物学实验室保存。分子量标准
DL2000、pMD19 - T载体、TaqDNA 聚合酶及连接试剂盒购自
45
2011 年 21( 1) 生 物 技 术
宝生物工程( 大连) 有限公司。小量胶回收试剂盒购自天根生
化科技( 北京) 有限公司。PDA固体、PDA液体培养基。
1. 2 仪器
扫描电子显微镜( JSM - 5900LV型,日本电子株式会社) ,
全自动氨基酸分析仪( HITACHI L - 8800) ,凝胶成像系统( Bio
- RAD) ,SW - SJ - 2FD型双人单面净化工作台( 苏州净化) ,
显微镜( Leica) ,PCR 仪( BIO - RAD) ,电泳仪 ( BIO - RAD) ,
高速冷冻离心机( Eppendorf 5804R) ,气浴摇震培养箱,小型涡
旋振荡器,水浴锅及恒温培养箱等。
1. 3 方法
1. 3. 1 裂褶菌的分离与培养
取裂褶菌样品,去掉表面杂质,用无菌水进行清洗消毒,
冲洗 2 次,将收集的孢子接种到 PDA培养基上,或取裂褶菌组
织样,用无菌手术剪剪成直径约 0. 5cm 的小菌块,用 0. 1%浓
度的升汞溶液消毒 3 min,75%乙醇溶液中浸泡 1min,用无菌
水冲洗干净后,用接种针移入 PDA固体培养基,置于培养箱内
25℃培养 3d ~ 5d,并保证一定湿度,每天观察培养情况。待长
出菌丝后,在菌落边缘用无菌接种针挑取带有菌丝的培养基
块,移入新 PDA培养皿中,继续放于 25℃恒温条件下培养,待
长出菌丝后显微镜观察菌丝特征。
1. 3. 2 菌落及菌丝形态特征
获得纯化菌种后,转接至 PDA固体培养基,每日测定其菌
落大小,观察并记录其菌落特征,并记录。扫描电子显微镜观
测其菌丝形态,取培养 7d 菌丝备用,扫描电镜样品制备及观
察按孔祥林等( 2008) 报道,取培养菌丝置于盖玻片上,加 4%
戊二醛 2 滴固定 5min ~ 10min ,再用滤纸同上法吸掉多余水
份,用滤纸吸掉多余水份,自然干燥。用 Hitachi 离子溅射仪
喷金提高样品导电性,条件: 真空 10Pa,电流 15mA,时间 80s。
用 JSM - 5900LV型扫描电镜,加速电压 20kV,用双面导电胶
条将干燥后的盖玻片粘在样品座上放入扫描电镜观察。
1. 3. 3 裂褶菌菌丝体的培养
将分离纯化后的菌丝接种于 PDA 液体培养基,25℃、
120r /min振荡培养 5 ~ 7d,8 000 × g离心 5min后收集菌丝体,
用吸水纸尽量吸干水分,用无菌水洗涤菌丝体,离心去除上
清,重复 3 次后 4℃保存备用。
1. 3. 4 裂褶菌的分子生物学鉴定
采用改良二次沉淀法[8,9],分别提取的子实体及培养菌丝
体 DNA,用超纯水将 DNA 溶解后在 0. 8%琼脂糖凝胶上电泳
检测,- 20℃冰箱保存备用。采用真菌通用引物 ITS4 和 ITS5,
由上海生工生物工程有限公司提供,其序列如下: ITS4 ( 5’-
TCCTCCGCTTATTGATATGC ) 和 ITS5 5 ’ - GGAAGTA-
AAAGTCGTAACAAG) 。PCR扩增体系 50μL:超纯水 41μL,10
× Buffer ( 含 1. 5mmol /L Mg2 + ) 5. 0μL,10mmol /L dNTP
1. 0μL,引物各 1. 0μL,模板 DNA 0. 5μL,TaqDNA 聚合酶
0. 5μL。反应参数为: 94℃预变性 5min; 94℃变性 1min,50℃
退火 1min,72℃延伸 1min,循环 30 次; 72℃延伸 10min。扩增
产物经胶回收,连接 pMD19 - T载体,转化大肠杆菌 JM109 感
受态细胞,进行蓝白筛选和菌落 PCR 鉴定。将阳性转化子穿
刺培养后,送上海生工生物工程技术服务有限公司测序,利用
ClusterW软件对 ITS 序列进行整理,blast ( http: / /blast. ncbi.
nlm. nih. gov /Blast. cgi) 比对分析序列。
1. 3. 5 栽培验证试验
按棉籽壳 80%、豆秸 8%、麸皮 10%、蔗糖 1%、石膏 1%、
含水量 60%的比例准备原种及栽培种培养基,发菌及出菇管
理按万勇( 2004) 报道[6]。
1. 3. 6 氨基酸成分分析
将烘干的裂褶菌子实体、菌丝体粉碎,50℃烘干至恒重,研
制粉末,用电子天平测重,待用。取适量试样,加 10ml 6mol /L
盐酸,排除空气后 110℃下水解 22 ~ 24h。取一定量定容过滤
后的水解液,真空除去盐酸后以 0. 02mol /L 盐酸溶解定容后
上机测试。仪器色谱条件: 色谱柱 4. 6 × 60mm,阳离子树脂,
日立 2622SC; 检测波长 570nm、440nm; 洗脱液流量 0. 4
ml /min;反应液流量 0. 35ml /min;柱温 57℃ ;反应温度 135℃。
2 结果与分析
2. 1 裂褶菌培养及菌丝特性
获得纯化菌种后,转接至 PDA培养基,观察并记录其菌落
特征。PDA培养基上 25℃条件下,落呈白色绒毛状,每日测定
其菌落大小,结果显示裂褶菌生长迅速,8d 内即满皿,见表 1。
菌丝白色,蓬松,气生菌丝旺盛,无色素产生,菌丝无隔( 图 1、
图 2) 。
表 1 裂褶菌菌落半径( cm)
Table 1 The semidiameter of S. commune colony
第 1d 第 2d 第 3d 第 4d 第 5d 第 6d 第 7d 第 8d
半径 1 0. 4 1. 6 2. 0 2. 5 3. 0 3. 6 4. 0 满皿
半径 2 0. 2 1. 4 1. 8 2. 4 3. 0 3. 8 4. 2 满皿
图 1 裂褶菌培养 7d菌落形态( 左:正面,右:反面)
Fig. 1 Colony morphology of S. commune
图 2 电镜下裂褶菌菌丝
Fig. 2 SEM image of S. commune mycelium
2. 2 ITS区序列比较
ITS区序列分析表明裂褶菌菌丝体与子实体的 ITS 区序
列完全一致,其序列长度为 660bp ( 图 3 ) ,GC% = 46. 52%,
blast 分析后发现其与 Genbank 中 Schizophyllum commune
xsd08036( FJ478109) 、S. commune z3 ( EF155505 ) 、S. commune
( AB428350) 、S. commune ( AB369910 ) 、S. commune HNO323
( AF280758) 的同源率高达 99% ~ 100%,由此可见本实验中
裂褶菌菌丝体培养成功,可用于下步实验。
2. 3 子实体的形态特征
培养基上长出的子实体米白色,菌盖、菌柄表面密被绒
毛,菌柄侧生,质韧,菌盖扇形或肾形,边缘内卷,常掌状开裂。
菌肉薄,淡黄色。菌褶窄,从基辐射状而出,沿边缘纵裂而反
卷( 图 4) ,虽然子实体培养成功,但周期较长( 35d左右) 。
2. 4 氨基酸组成
从表 2 可知,裂褶菌子实体及菌丝体中氨基酸种类齐全,
含量较高。菌丝体、子实体总氨基酸含量分别为 14. 01%、
15. 59%,必需氨基酸含量分别为为 5. 41%、5. 91%,非必需氨
基酸含量为 8. 60%、9. 68% ,必需氨基酸含量占氨基酸总量
E / ( E + N) 的 38. 90%、37. 95%,必需氨基酸与非必需氨基酸
比值 E /N 为 0. 63、0. 61。
55
生 物 技 术 2011 年 21( 1)
图 3 裂褶菌 ITS区序列
Fig. 3 The ITS sequence of of S. commune cultivated mycelium and fruiting body
图 4 裂褶菌子实体形态
Fig. 4 The morphology of cultivated S. commune
3 讨论
传统的真菌种类鉴定主要是依据子实体的特征,菌丝体
很少能直接用于种类鉴定,部分种类可通过出菇试验进行种
类鉴定,但时间较长且很多种类尚不能用人工培养方法培育
子实体。将子实体与菌丝体 ITS区序列进行比较,本研究成功
培养出裂褶菌菌丝体,为下一步的研究及利用开发奠定了基
础,大量研究表明这种分子鉴定方法是切实可行的,鉴定结果
是可靠的,而依靠菌丝体鉴定往往会出现失误[11]。
本研究中菌丝缬氨酸、赖氨酸、谷氨酸及精氨酸的含量与
邓百万( 2003) 等报道相差较大[12],其菌丝体需要利用 ITS 区
进一步确认。郝利民等( 2007) 测定了裂褶菌发酵液中氨基酸
表 2 裂褶菌子实体、菌丝体氨基酸组成与含量
Table 2 The amino acids composition in fruiting body and mycelium of S. commune
氨基酸成分
占干物质含量( % )
子实体 菌丝体
氨基酸成分
占干物质含量( % )
子实体 菌丝体
非必需氨基酸( N) 必需氨基酸( E)
天门冬氨酸 Asp 1. 71510 1. 74767 苯丙氨酸 Phe 0. 602025 0. 610100
酪氨酸 Tyr 0. 400765 0. 387714 赖氨酸 Lys 1. 09583 0. 925165
谷氨酸 Glu 2. 53648 2. 20272 异亮氨酸 Ile 0. 658361 0. 606173
甘氨酸 Gly 0. 826629 0. 661164 缬氨酸 Val 1. 27045 1. 26016
组氨酸 His 0. 4633041 0. 350039 蛋氨酸 Met 0. 335186 0. 346824
丝氨酸 Ser 0. 843432 0. 687771 亮氨酸 Leu 1. 18765 1. 00673
精氨酸 Arg 1. 03207 0. 913255 苏氨酸 Thr 0. 767566 0. 651426
脯氨酸 Pro 0. 646524 0. 589772 E / ( E + N) ( % ) 37. 95 38. 60
丙氨酸 Ala 1. 14622 1. 00401 E /N 0. 61 0. 63
半胱氨酸 Cys 0. 0655655 0. 056556
组成,结果表明发酵液中含有 14 种游离氨基酸,其中包括 7 种
人体必需氨基酸,不含蛋氨酸、精氨酸及脯氨酸,其氨基酸组
成受发酵液成分的影响较大[13]。各类氨基酸含量均比平
菇[15]、白灵菇[16]等报道要高,子实体及菌丝体中高含量的天
门冬氨酸和谷氨酸等鲜味氨基酸赋予了裂褶菌鲜美的口味,
缬氨酸和亮氨酸可促进正常生长,修复组织,调节血糖,并给
身体提供能量。赖氨酸和精氨酸能促进儿童生长和发育。因
此,从氨基酸的组成和含量来看,裂褶菌是高氨基酸含量的食
用菌佳品,裂褶菌菌丝与子实体氨基酸含量相当,亦具有丰富
的营养价值,通过菌丝的优化发酵[14],可作为重要的氨基酸来
源。
裂褶菌既可作为食用菌进行栽培,以子实体作为一种保
健食品上市,又可以利用工业发酵术培养菌丝体,开发制作食
品。裂褶菌从栽培种制作至出菇时间较长,ITS 区基因片段的
PCR扩增及测序简便、快捷,可以作为裂褶菌菌丝体鉴定的有
效手段,其 ITS区长度为 660bp,裂褶菌子实体及菌丝体中氨
基酸种类齐全,含量较高,菌丝体总氨基酸含量 14. 01%,子实
体总氨基酸含量 15. 59%,其中菌丝体必需氨基酸的含量( 38.
60% ) 比子实体稍高( 37. 95% ) ,裂褶菌菌丝亦具有丰富的营
养价值,可作为重要的氨基酸来源及功能性食品。
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一株碱性纤维素酶产生菌的分离、鉴定及酶谱分析
郭成栓1,欧阳蒲月1,崔堂兵2,郭勇2
( 1.广东食品药品职业学院中药和生物系,广东 广州 510520; 2.华南理工大学 生物科学与工程学院,广东 广州 510640)
摘要:目的:从土样中分离株碱性纤维素酶高产菌株。方法:利用 CMC平板初筛,然后利用摇瓶复筛,筛选酶活力高的菌株,
对分离出的一株高产菌株进行了鉴定并对其所产酶进行了酶谱分析。结果:获得一株碱性纤维素酶高产菌株 H12,酶活力达到
1. 96U /ml。结论:该菌株呈长杆状、革兰氏染色为阳性、产芽孢; 16S rDNA 基因序列为 1 419bp,与短小芽孢杆菌 16S rDNA 基因
序列具有最高的同源性,基于 16S rDNA基因序列的同源性分析以及系统发育分析等方面的多相分类研究,鉴定菌株 H12 为为短
小芽孢杆菌;碱性纤维素酶的酶谱分析只有一条水解条带,酶分子量在 75kD左右。
关键词:碱性纤维素酶;分离; 鉴定;短小芽孢杆菌;酶谱
中图分类号: Q939 文献标识码: A doi: 10. 3969 / j. issn. 1004 - 311X. 2011. 01. 021
Isolation ,Identification,and Zymographic Analysis of a High Alkaline
Cellulase - producing Strain H12
GUO Cheng - shuan1,OU YANG Pu - yue1,CUI Tang - bing2,GUO Yong2
( 1. Deperment of Chinese Medicine and Biology,Guangdong Food and Drug Vocational College,Guangzhou 510520;
2. College of Bioscience and Biotechnology,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)
Abstract: Objective: To obtain high alkaline cellulase - producing strain. Method: In the screening program,A strain with high alkaline
cellulase - producing were identification and the zymographic were analyzed,screening by using CMC plate and shaking flask culture. Re-
sult: A high alkaline cellulase - producing strain H12 was obtaineded and the endoglucanase activiry can reach 1. 96U /ml. Conclusion:
The strain,was Gram - positive Bacillus with spore - forming. Based on the polyphasic studies ,including its phenotypic ,physio - bio-
chemical characteristics,16S rDNA sequence similarity. and phylogenetic analysis by using 16S rDNA sequence ,H12 was identified as
Bacillus pumilus. The zymographic analysis shows: there were only only one hydrolysis and the molecular weight of the enzyme were 75kD.
Key words: alkaline cellulase ; isolation ; identification ; Bacillus pumilus
收稿日期: 2010 - 09 - 27; 修回日期: 2010 - 11 - 04
基金项目:广东省科技攻关项目( 2005B10401051) ;广东食品药品职业
学院自然科学青年基金项目( 2009YZ005) 资助
作者简介:郭成栓( 1977 - ) ,男,河南南阳人,博士,讲师,从事发酵工
程,酶工程研究。郭勇( 1942 - ) ,男,教授,博导,从事酶工程、植物细
胞培养和基因工程研究,Email: gcs200222@ 163. com。
碱性纤维素酶是一种在碱性条件下可以发挥催化作用的
维素酶,最适 pH在碱性范围,在生产生活中广泛应用于洗涤、
食品、酿酒、造纸、饲料、纺织等行业[1 - 3]。但是当前碱性纤维
素酶产生菌的酶活力普遍较低,已成为碱性纤维素酶生产和
应用的一大瓶颈。因此寻找碱性纤维素酶高产菌株已成为当
前研究的首要任务。作者对采集自全国的几十份土样中的微
生物进行了分离,分离到 1 株碱性纤维素酶高产菌株,该菌株
产生的纤维素酶具有 pH 适应范围广,耐碱性强,热稳定性好
等特点,在工业上具有较强的研究和应用价值。本研究通过
形态、生理生化特性、16S rDNA基因序列同源性分析和系统发
育分析等方面的多相分类研究,对该菌株进行了鉴定,并对该
菌株所产生的碱性纤维素酶进行了酶谱初步分析。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料:采集自全国的几十个土样。
1. 1. 2 试剂: CMC,Sigma 公司; 刚果红,上海试剂三厂; 蛋白
陈,酵母膏,琼脂粉,广东环凯微生物科技公司;其他试剂均为
国产分析纯。
1. 1. 3 仪器:电子天平,JY 型,上海精密科学仪器有限公司;
酸度计,pH3 - 25 型,上海雷磁仪器厂; 垂直净化工作台,上海
阳光实验仪器有限公司; 灭菌锅,SP510 ( YAMATO,Japan) ; 热
循环仪,2400 Gene Amp PCR system( Perkin Elmer,USA) ;WFH
-202B紫外投射分析仪( 上海精科) ; UVP 凝胶成像系统( Bio
- rad,USA) ; 低温冷冻离心机 5810R ( Eppendorf,Germany) ;
恒温水浴锅( Heto,Denmark) ; 78 - 1 型磁力搅拌器,杭州仪表
电机厂;紫外可见分光光度计,( Biomate) ;全温度恒温气浴摇
床,上海智诚仪器厂;电热恒温培养箱,上海森信实验仪器厂。
1. 1. 4 培养基
1. 1. 4. 1 筛选培养基: CMC 1%,( NH4 ) 2 SO4 1%,KNO3
0. 5%,Na2CO3 0. 5%,MgSO4·7H2O 0. 01%,FeSO4·7H2O
0. 015%,MnSO4 0. 000 05%,琼脂 1. 6%,pH 9. 0,121℃灭菌
20min。
1. 1. 4. 2 种子培养基: 1%蛋白胨,1%葡萄糖,1%酵母膏,
K2HPO4 0. 1%,NaH2PO4 0. 1%,MgSO4·7H2O 0. 01%,FeSO4
7H2O 0. 015%,MnSO4 0. 000 05%,pH 7. 0,121℃灭菌 20min。
1. 1. 4. 3 发酵培养基: 1%葡萄糖,2%淀粉,0. 5%麸皮,1%
蛋白胨,1%酵母膏,K2HPO4 0. 1%,NaH2PO4 0. 1%,MgSO4·
7H2O 0. 01%,FeSO4·7H2O 0. 015%,MnSO4 0. 000 05%,pH
7. 0,121℃灭菌 20min。
1. 2 方法
1. 2. 1 菌株的筛选
土样采用十倍稀释法,取适当稀释度的菌悬液涂布于分
离培养基平板上,37℃恒温培养箱中好氧培养 3d。用刚果红
染色筛选平板 20min,然后用 1mol /L的 NaCl洗涤 20min,选取
水解圈和菌落比值较大菌落进行复筛。将初筛选取的菌株接
入种子培养基,在 37℃摇床中,200r /min下培养 24h,以 5%的
接种量接入发酵培养基中于 30℃摇床中,200r /min 下培养
48h,测酶活。
1. 2. 2 菌株的鉴定
1. 2. 2. 1 形态、培养和生理生化鉴定
形态、培养和生理生化特征的鉴定参照《常见细菌系统鉴
定手册》[4]、《伯杰细菌鉴定手册》第八版[5]进行。
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