全 文 ：第 23 卷 第 2 期
2 9 , z 年 3 月
海 洋 与 湖 沼
O C E A N O L O G I A E T L IM N O L O G I A S I N IC A
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条斑紫菜藻胆蛋白性质的研究
n l
. 不同环境条件下 R 一藻红蛋白
吸收光谱类型的转变 *
杨紫查 曾繁杰 蒋丽金 刘惠平
〔中国科学院感光化学研究所 , 北京 10 0 10 1)
提要 条斑紫菜的 R 一藻红蛋白在 p H : 5 . 8一 8 . 4 的几种缓冲液中保存 , 经过大约 4 个
星期 ,其吸收光谱由原有的双峰型转变为三峰型 ;在 p H ~ 8 . 4 的聚丙烯酸胺梯度凝胶电泳后
或在微量四甲基乙二胺作用下发生了同样的变化 。 但在变性剂 S D S 或尿素存在下 ,吸收光谱
中 5 4 0 n m 和 5 65n m 的峰强度比逐渐改变 ,直至 , 65n m 吸收峰消失 ,始终没有从双峰型转变
为三峰型的迹象。 显然 ,条斑紫菜 R一藻红蛋白吸收光谱类型的转变不是变性引起的 。
关键词 条斑紫菜 R 一藻红蛋白 吸收光谱 双峰型 三峰型
R 一藻红蛋白 (以下简称 R 一 P E )是红藻光合作用中捕获光能和传递光能的一种色素蛋
白。 依照它们吸收光谱的差别分为两种类型 。 低等红藻中存在双峰型 R一 P E , 即其吸收
光谱中在可见光区有 4 9 8n m 和 5 6 5n m 的吸收峰和在 5 4 0n m 处的吸收肩。 高等红藻
R
一
P E 大多是三峰型 ,除 4 9 8n m 和 5 6 5n m 的吸收峰外 , 在 5 4 0n m 处也有尖锐的吸收
峰。 潘忠正等川和 H ir o se 等 〔3 ,许多作者都对 R一 P E 的两种光谱类型进行了讨论 。 我们
发现 , 低等红藻条斑紫菜的 R 一 P E 由于环境因素的影响 , 其双峰型的吸收光谱可以转变
为三峰型 。
一 、 双峰型吸收光谱转变为三峰型
1
.
8 种缓冲液对 R 一 P E 吸收光谱的影响
R 一 P E ( ;
m : 二 ~ 5 6 5 n m
, 尸 m a x 一 , 7 8 n m ; A 5 6 5 n。 : A Z。。 n m 一 2 : l ) 以不同的缓冲液配 成
心 . 2 5m g /m l 的溶液 , 密封于若干试管中 , 在 4℃ 暗处放置 。 在 l , 7 , 28 和 56 天时各取出
一支样品测定吸收光谱和荧光光谱 。 对照样品为多管藻 R 一 P E 。 表 1列出所用的 8 种缓
冲溶液 , 光谱测定结果见图 l一 4。
中国科学院侮洋研究所实验海洋生物 学开放研究实验室研究报告第 37 号 。
国家自然科学基金资助项 目。
接受 日期 ; 1 99 1 年 3 月 15 旧 。
杨紫聋等 : 条斑紫菜藻胆蛋白性质的研究 1 1 .
表 1 实验所用的 忿种缓冲溶液
Ta b
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1 T he ei g h tk i n d so f b uf f er o sl u ti o n i n thx e ePr ei m n e t
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从图 1一 3 可 以看出 , R一 P E 在缓冲液
1 : 2 , 3 , 5 中 1天时其吸收光谱特征不变。 在
缓冲液 4 , 6 , 7 , 8 中则失去原有特征。 5 6 5n m
的吸收或成为肩峰或消失。 但无论在哪一种
缓冲液中 , 当保存至 28 天时 , 吸收光谱中都
出现了三峰型特征 。 在同样条件下 , 多管藻
R
一
P E 在可见光区保持原有的三 个吸 收峰 ,
仅.各峰的相对强度稍有变化 。
以上全部试样的荧光发 射 光 谱 形 状 不
变. ,但从图 4 可以看出 , 各试样的荧光强度都
有不同程度的变化 , 尤以在缓冲液 4 和 8 中
的变化最大 。
2
. 在聚丙烯酞胺梯度凝胶电泳中吸收光
谱的变化
使用 P五a r m a o ia 梯度凝胶电泳方法 , 用
4一 30 关 聚丙烯酞胺线性梯度凝胶薄板 , 用
p l任一 5 . 4 , o . o g m o l / L 的 T r i s 一硼酸缓冲液
(含 0 . 9 3 9 / L E D T A N a )作电极液 。 样品为
经过粗分离的 R一 P E。 用 P h a r m a c i a 成套的
` 之、
、 一之认
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波长 ( n m )
图 I R 一 P E 在 8种缓冲液中
1天时的吸收光谱
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.
1 T h e a b s o r P t i o n s P e c t r a o f R
一
P E i n
e i g h t K i n d s o f b u f f e r s o l u t i o n f o r o n e d a y
图 l , 2 , 4中数字为缓冲液代号 ,参见表 1 。
高分子量电泳校准蛋白 ,在 150 V 下电泳 1 h7 , 然后用岛津 C s 一 90 0 色谱扫描仪测定胶
板上的红色带 (只得到一条红色带 ) 的吸收光谱 。 对照样品多管藻 R 一 P E 电泳后也只得
到一条红色带 。 测定结果表明 , 条斑紫菜 R 一 P E 与多管藻 R 一 P E 在电泳中有相同的迁移
距离 , 并且其吸收光谱由双峰型转变为三峰型 。 根据与标准分子 量蛋白的比较 ,峰型转变
后的 R 一 P E 的分子量为 1 9 5 0 0 0 道尔顿 。 电泳结果见图 5 , 6o
3
. 在微盆四 甲基乙二胺作用下吸收光谱的变化
R 一 P E 粗品经 s e p h a d e x G 一 2 0 0 凝胶柱层析 (洗脱液为 p H 一 6 . 8 , o . o s m o l / L 的磷
酸钠缓冲液 ) , 再经经基磷灰石柱层析 ( p H ~ 6 . 8 , 0 . 02 m ol / L 磷酸钠缓冲液洗脱 )后 , 在
4 0
·
0 0 09 离心 3 0m i n , 得到纯的 R 一 p E ( A S` 5 : A Z。。 ~ 8 : 1) 。
2 1 6 海 洋 与 湖 沼 2 3 卷
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图 Z R 一 P E 在 6种缓冲液中 28 天时的
吸收光谱
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2 T h e a b s o r p t i o n s p e e t r a o f R
一
P E
i n s i x k i n d s o f b u f f e r s o l u t i o n f o r 2 8 d a y s
图 3 R一 P E 在 T ir 卜硼酸缓冲液中 1一 56
天的吸收光谱
F i g
.
3 T h e a b s o r p t i o n s p e c t r a o f R
一
P E
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一
B o r i e a e i d b u f f e r s o l u t i o n f r o m
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图
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4 T h e e h a n g e
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R一 P E 在 5种缓冲液中保存时荧光强度的变化
f l u o r e s c e n c e s t r e n g t h o f th e R一 P E d u r i n g t h e 5 t o r a g e P e r i o d
i n f i v e k i n d s o f b u f f e r s o l u t i o n
取纯 R一 P E 各 3 m l , 分别加人 l 多 的四甲基!乙二胺 ( T EM E D ) 若千 m l (此时各
试样的 p H 值均低于 8 . 0 ) , 于密封的试管中在 , 5一 60 ℃ 水浴中加热 , 分钟 , 迅速冷却至
室温 , 分别测定吸收光谱和荧光光谱。
由图 7 , 8 可见 , 条斑紫菜 R 一 P E 的双峰型吸收光谱当加人 5川 T EM ED 时 已发生
变化 ,至加人 10 一 20 川 T E M E D 时 , 转变为三峰型 。 它在 2 8 0n m 的吸收明显增强 , 并
在 5 9 5n m 处出现一吸收肩 ,峰型变化后的 R 一 P E 的荧光发射光谱不变 , 但其激发光谱与
变化前相比 , , 4 0n m 处的强度稍大 。
2期 杨紫首等 : 条斑紫菜藻胆蛋白性质的研究 川· 1 27
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图 , 用 P h ar m ac ia 成套校准蛋白在 峪一 30 %
凝胶板上测定条斑紫菜兰峰型 R一 P E 的分子量
F i g 5 T h e m o l e c u l a r w e i g h t o f t r i a d e t y p e o f
R
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图 6 电泳后条斑紫菜 R 一 P E
的吸收光谱
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6 T h e a b s o r p t i o n s p e c t r a o f p o r P
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图 7 加人不同量 T E M E D 后吸收光谱 图 8 加入 20 风 T E M E D 后的吸收光谱 (
的变化 (单位 : 川 )
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,
7 T h e e h a n g e o f a b s o r p t i o n s p e e t r a F i g
.
)
、 发射光谱 ( - · - ·一 )和激发光谱 (… … )
8
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M E o (
u n i t : 拼1)
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一 s e e n e e
T h e a b s o r P t i o n s p e e t r a (
- - -一 ) , f lu o r e ·
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-
· - ·一 ) a n d e : c i t a t i o n s p e e t r a
(
· · · · · · …… ) o f R 一 P E a f t e r a d d i n g 2 0拌1 T E M E D
二 、 R 一 P E 在 S D S 和尿素溶液中吸收光谱的变化
1
.
R
一
P E 在 S D S 溶液中吸收光谱的变化
海 洋 与 湖 沼 2 3卷
分别取 1% 的 SD S 水溶液若干 m l, 各加人蒸馏水至体积 4 m l 。 在各份溶液中分
别加人纯的 R 一 P E 4 0川 , 摇匀 , 在室温下放置 30 m in 后测定吸收光谱 。 对照样品为
R 一 P E 水溶液 。 图 9 为不同浓度 S D S 溶液中 R 一 P E 吸收光谱的比较 。 在 s D s 浓度 为
0
.
0 6 % 和 0 . 0 12 多 时 , R 一 P E 吸收光谱形状不变 。 当浓度增至 0 . 0 60 多 以至达到 1外
时 , 在 5 6 5n rn 处形成一吸收肩 ,且 4 9 8 n m 和 2 8 0 n m 的吸收相对增强 。
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图 9 不同浓度 S D S 溶液中 R一 P E
吸收光谱的比较
图 10 不同浓度尿素溶液中 R一 P E
吸收光谱的变化
F 19
.
9 T h e a b s o r P t i o n s P e e t r a o f R
一
P E i n
d i f f e r e n t S D S c o n e e n t r a t i o n s
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1
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T h e a b s o r P t i o n s P e e t r a o f
d i f f e r e n t u r e a
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0 if C e n t t a t 10 n S
* 6
.
o m o l / L 尿素同时加热 Zm i n o
2
.
R
一
P E 在不同浓度尿素溶液中吸收光谱的变化
取 0 . 5 , 2 , 4 和 s m o l / L 的尿素溶液各 3m l , 分别加人 3 0户 I R 一 p E , 室温下放置 4h
后测定各试样的吸收光谱 , 得到图 1 0。 图 10 表明随尿素浓度增加 , R 一 P E 在可见光区的
吸光度逐渐降低 , 2 8 0n m 吸收增强 。 至 s m ol / L 尿素时 , 5 4 0n m 和 5 6 5n m 的吸光度
相同 , 4 9 8n m 的相对强度明显增大 。 将不同尿素浓度的 R 一 P E 溶液在 65 ℃加热 Zm in ,
可见 R 一 P E 在 5 6 5 n m 的吸光度逐渐低于 , 4 o n m 的 ;至 6 m ol /L 尿素时 , 5 65 n m 的吸
收峰消失 ;在 5 4 0n m 附近形成一宽阔的吸收肩。
三 、 讨 论
条斑紫菜的 R 一 P E 经过聚丙烯酸胺凝胶电泳 , 其双峰型的吸收光谱转变为三峰型 。
此时它的荧光发射光谱与电泳前的相同 。根据与标准分子量蛋白的比较 ,它的分子量与同
时电泳的多管藻 R 一 P E 的分子量相同 , 都是 1 9 50 0 0 道尔顿 ,说明它是 R 一 P E 的多聚体。
在用四甲基乙二胺处理 R 一 P E 时 , 试样的 p H 值保持在 .8 0 以下 , 基本避免了碱
杨紫置等 : 条斑紫菜藻胆蛋白性质的研究 川·
性条件下导致的蛋白变性 。 当四甲基乙二胺的量加到 2 0夙 并在 6 5℃ 加热 l mi n 后 ,
R 一 P E 吸收光谱中 5 4 0n m 处的吸收肩变为一明显的吸收峰。 此时它的荧光发射光谱 不
变 , 而激发光谱中 , 4 0n m 处的强度稍变大 。
在电泳条件和在微量胺作用下 R一 P E 吸收光谱的变化 , 都是在短时间内发生 的 ,而
R 一 p E 在 8 种缓冲溶液中保存了较长的时间 , 根据其吸收光谱和荧光强度的变化 ,可以探
讨其变化过程 。
由实验结果可见 , 作为对照样品的多管藻 R 一 p E , 始终保持了它的三峰型的光谱特
征 , 表明此种类型的 R一 P E , 具有较稳定的构象 。
条斑紫菜 R 一 P E 在 8 种缓冲溶液中起始的吸收光谱表现为两大类 。 一类 ,在 1 , 2 , 3 , 、
5 的四种缓冲液中保持原有特征不变 ;另一类 , 在 4 , 6 , 7 , 8 的四种缓冲液中失去原有光谱
特征 ,在 5 6 5n m 处的最大吸收或形成肩峰或基本消失 , 但它们在可见光区与紫外光区的
最大吸收的比值保持在 1 左右 ,说明溶液中变性的 R 一 P E 不多。 当 R 一 P E 在 8 种缓冲溶
液中保存至 28 天以后 , 溶液中都出现了与多管藻的 R 一 P E 类似的吸收光谱 。 它们在可
见光区与紫外光区的最大吸收的比值仍保持在 l 左右 , 表明 R 一 P E 的吸收光谱在由双峰
型转变为三峰型的过程中 ,也没有明显的变性发生 。
从 R 一 P E 在 , 种缓冲液中保存期间荧光强度的变化曲线可见 ,在 28 天内 , 1 , 2 , 3 的
三种 (特别是在 2 中 )荧光强度变化较小 ,这与它们的特征吸收光谱的保持是相一致的 。在
28 天以后 ,也 即在光谱中出现了 5 4 0n m 的明显吸收后 ,它们的荧光强度以缓慢的速度逐
渐降低 ,至 56 天实验结束时为止 , 前后的荧光强度变化缓慢 , 始终未发生一个陡变的过
程 。 而在缓冲液 8 中 ,保存 14 天以后 , 荧光发射突然增强 , 保持一周以后再缓慢下降 , 但
至 % 天时仍比起始的强度大许多。 这一过程正是 R一 P E 多聚体发生解聚的过程 1[] 。 在
前一类情况下未观察到荧光发射的突然增强 , 表明没有明显的解聚发生 。 据此二种现象
可以估计 , 吸收光谱由双峰型向三峰型的转变 , 可以发生于多聚体 ,也可以发生于低聚体
或单体 。 聚丙烯酸胺凝胶电泳的结果证明了三峰型 R 一 P E 多聚体的存在。
R 一 P E 在缓冲液 4 中的吸收光谱变化最大 ( 5 6 5n m 吸收峰消失 , 同时出现 6 10n m 的
吸收 ) , 与此相应 , 其荧光强度的变化也最明显 。 虽然其发射光谱形状不变 , 但起始时发生
了荧光碎灭现象 。 至保存一周后 , 强度逐渐上升 。 从第 2 周至第 8 周变化不大 。 这一现`
象似乎表明 ,在缓冲液 4 的条件下 , 起始只有少数 R 一 P E 分子保持了其特征构象 , 因而只
有很弱的荧光发射 。 此时大部分 R 一 P E 的构象处于不断变化之中并逐渐地向着较稳定
的构象— 三峰型 R一 P E 的构象变化 。 从第 28 天至 56 天实验结束时为止 , 基本处于三峰型的较稳定的构象中 。 故此阶段内其荧光强度回升并基本保持不变 。
在前一类缓冲液中 ,起始虽无光谱特征的改变 , 但 28 天后 ,溶液中也出现了三峰型的
吸收光谱 。 至此应提出一个问题 , 就是双峰型和三峰型吸收光谱差别的实质是什么? 根
据上面的工作 ,作如下的推论 。
据文献报道 , 有处于不同蛋 白环境的 、 不同构象的藻红胆素发色团 4[] 。 吸收峰在 540
n m 的称为 s 一发色团 ,处于 5 6 5n m 的是 f 发色团。 根据实验中经过变化的 R 一 P E 的吸
收光谱看 , 两种类型光谱的差别不仅仅是 , 4 0n m 与 5 6 5n m 吸收强度之比的差别 , 实质
可能是双峰型 R 一 P E 中有两种 S一发色团。 其一的吸收峰在 5 4 0n m , 另一个的吸收波长
海 洋 与 湖 沼 2 3 卷
稍有红移 。 这两种 S一发色团的吸收谱交盖后表现为一个具有一定宽度的较平滑的峰 , 也
就是形成了在 5 4 0n m 处的吸收肩 。 而三峰型 R 一 P E 只有 5 4 0n m 的一种 S一发色团 , 表
现为一个尖锐的峰。
在上面实验的几种条件下 , 双峰型 R一 P E 经历了一些复杂的变化 , 其中可能包括
了具有较大吸收波长的 S一发色团的构象转变为 5 4 0n m 吸收的 S一发色团构象的这种变
`化 。
条斑紫菜的 R 一 P E 在变性剂 S D S 或在尿素的作用下 , 可以得到 5 4 0n m 处吸光 度
不同的吸收光谱 。 但不论 5 4 0n m 和 5 6 5n m 吸光度比值如何变化 , 在 5 4 0n m 处总表现
为一个较宽的 、 平滑的峰 , 同时 5 6 5n m 的吸收峰发生明显的变化 , 始终未得到一个三峰
型的吸收光谱。 这一情况说明 , R 一 P E 吸收光谱由双峰型变为三峰型的过程和它在变性
剂作用下的变化过程不完全相同 。 这也证明了在本文实验条件下吸收光谱类型的转变不
是变性 , 但是要阐明两种光谱类型的 R 一 P E 的差别 , 还需要进行更深人的研究 。
参 考 文 献
杨紫置等 , 1 9 87 , 条斑紫菜中的藻胆蛋白研究 H . 条斑紫菜的 R一藻红蛋白的聚集一解聚现象 , 中国科学 B 辑 ,
4 : 3 7 1一 3 7 6 .
潘忠正等 , 1 9 8 7 , 青岛海产红藻 R 一藻红蛋白光谱特性的比较研究 , 海洋与湖沼 , 1 8 ( , ) : 41 9一 4 2 , .
H i
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,
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,
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,
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52一 6 5 .
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2 期 杨紫首等 : 条斑紫菜藻胆蛋白性质的研究 1 1 . 2 2 1
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A B s T R人e T
D u r i n g t h e s t o r a g e Pe r i o d o f t h e R
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r i n f r o m P o r Ph y r a y e z o e n s行 i n v a r i o us b u f -
王e r s o l u t i o n s a t PH 5 . 8一 8 . 4 , t h e a lbs o r Pt i o n s P e e t r a l o s t t h e o r i g i n a l e h a r a e t e r i s t i e d i a d e t y详
么 t th e v e r y b e g i n n i n g a n d e h a n g e d t o t r i a d e t y P e a f t e r a n e l a p s e Of a b o u t f o u r w e e k s
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