全 文 ：条斑紫菜丝状孢子体 cDN A文库构建
及抗病相关基因鉴定
杨官品 1　刘永健 1　孙　雪 1　沈怀舜 2　许　璞 2　张学成 1
( 1中国海洋大学海洋生命学院 ,青岛 266003; 2江苏省海洋水产研究所 ,南通 226007)
摘　要　经过微量总 RNA抽提、 cDN A合成、 cDN A扩增和克隆等步骤 ,构建了微量条斑紫菜丝状孢
子体 cDNA文库 ,并进行了小规模表达序列标签分析。从 170条标签序列中鉴定出 6条抗病相关基因
序列。 这些序列可用于研制抗病单核苷酸多态性标记 ,辅助紫菜抗性遗传改良。
关键词　条斑紫菜 ; cDNA PCR文库 ; cDNA文库 ;表达序列标签 ;抗病基因
中图法分类号　 Q344+. 13　　　　　文章编号　 1001-1862( 2003) 01-047-06
紫菜是红藻门、红毛菜科、紫菜属 ( Porphyra )大型海藻的总称 ,全世界约有 130余种 ,广泛
分布于寒带到亚热带海域潮间带 [1 ]。我国约有 19种 ,其中 ,南方的坛紫菜 (P . hai tanensis )和北
方的条斑紫菜 (P . yezoensis )是主要养殖种。条斑紫菜生活史包括二倍性丝状孢子体和单倍性
叶状配子体 2个异型世代。叶状体是养殖收获对象 ,而丝状体是人工育苗的操作对象。用不同
的方法 ,我国已培育出众多遗传上纯合的紫菜品系 [2 ]。紫菜的大规模、高密度养殖要求养殖品
系具有高抗病性 ,但对成百品系进行鉴定 ,以选择优良抗性品系是非常困难的 ,需要高效的筛
选和鉴定方法。抗性连锁分子标记可以辅助有关性状的选择 ,但到目前为止还没有紫菜分子标
记连锁图谱及相关研究资料可以利用。 抗病相关基因的单核苷酸多态性 ( single nucleotide
polymo rphism, SN P)分析是研究紫菜抗病遗传基础、辅助抗性品系选择的新手段 ,但也缺少
相关研究基础。
表达序列标签 ( expressed sequence tag s, EST)是通过随机对 cDN A克隆单方向、单反应
测序获取的特定组织在特定时期表达基因的一段序列。 EST分析就是获得这些标签 ,用它们
定义其对应的功能基因 ,并依据标签序列与公共数据库中已知功能序列的同源性推演标签定
义序列功能的过程。 ES T分析是鉴定分离功能基因的高通量途径之一。条斑紫菜叶状配子体
已有不同规模的 ES T分析 [3, 4 ]。为分离丝状孢子体生长发育、抗病抗逆、生理代谢等相关基因 ,
作者也开展了小规模条斑紫菜丝状孢子体 EST分析 [ 5]。
条斑紫菜丝状孢子体形体微小、生长缓慢 ,因此 ,获得大量丝状体以分离 mRNA、用传统
方法构建 cDN A文库是非常困难的。在进行条斑紫菜丝状孢子体 EST分析时 ,本文组合使用
了 cDN A PCR文库和传统 cDN A文库构建方法。cDN A PCR文库就是在微量总 RNA基础上
合成 cDN A,扩增形成足够量的 cDN A混合物 ,并用特异引物扩增分离目的基因的过程 [6 ]。 该
第 33卷　第 1期　
2003年 1月　 　　
青 岛海 洋 大学 学 报
JOU RNAL O F OCEAN UNIV ERSITY OF QINGDAO 　　　　
33( 1): 047～ 052
Jan. , 2003
江苏省海洋水产研究所所长基金项目资助
收稿日期: 2002-07-09;修订日期: 2002-10-09
杨官品 ,男 , 1963年出生 ,博士 ,教授。
方法用 PCR扩增克服了构建传统 cDN A文库对 RNA量的要求 ,替代了传统方法中阳性克隆
的鉴定与筛选。但是 , ES T分析要求对不同基因的 cDN A进行测序 ,必须获得带有单一 cDN A
插入片段的重组子。进行条斑紫菜丝状孢子体 EST分析时 ,用微量丝状孢子体材料构建 cD-
N A PCR文库 ,并进一步将 cDN A插入载体 ,以获得重组子进行测序。本文报道了详细实验过
程 ,供同类研究参考。
1　材料与方法
1. 1　总 RNA分离　　用 UN IC- 10柱离心式 Trizo l总 RNA抽提试剂盒 (上海生工 )提取总
RNA,基本按产品使用指南进行。详细操作步骤如下: ( 1)筛绢过滤收集悬浮培养的条斑紫菜
丝状体 50mg左右 ,无菌蒸馏水冲洗 ,吸干水分 ,转入陶瓷研钵中 ; ( 2)加液氮研磨成粉末 ,刮
出粉末并转移到另一加有 0. 4mLTrizol的研钵中 ,继续研磨至粘度最小 ; ( 3)将约 500μL研磨
液转移到离心管中 ,加入 100μL氯仿:异戊醇 ( 24: 1, v: v ) ,剧烈振荡成乳状 ,微型台式离心机
上 (下同 ) 12 000r /min室温离心 5min; ( 4)取出约 450μL上清液 ,加 150μL无水乙醇 ,混匀 ,并
转到 UN IQ-10柱中 ,室温放置 2min,离心 1min; ( 5)弃废液 ,加入 450μLRW溶液 ,室温离心
1min; ( 6) 在柱中央加 DEPC处理水 50μL,室温放置 2min(从此步开始 , RN A失去保护 ,需用
DEPC处理的水、离心管等 ) ,离心 1min,获得总 RNA(总 RNA可在 - 20℃或 - 70℃短期储
存 ,但最好立即进行 cDN A合成 ) ,取 10μL进行常规电泳检测。
1. 2 cDN A合成、纯化、扩增及克隆　　组合使用 cDN A合成试剂盒、 cDN A PCR文库试剂
盒、 LA TaqTM试剂盒合成和扩增 cDN A(大连宝生物工程公司 )。 ( 1)取总 RNA溶液 10μL,
65℃处理 5min,冰水冷却 ; ( 2)按顺序配制 cDN A第 1链合成体系: 65℃处理的总 RNA4μL;
5x第 1链合成缓冲液 2μL; dN TP混合物 ( 10nmol /L each ) 1μL; RNase抑制物 ( 20uni ts /μL)
1μL; Oligo dT-RA引物 ( 50pmol /μL) 1μL; RAV-2逆转录酶 ( 20uni ts /μL) 1μL。按 30℃ 10min,
42℃ 1h , 80℃ 5min顺序合成 cDN A第 1链 (在 PCR仪上进行 ) ; ( 3)按下列顺序配制第 2链合
成体系:第 1链产物 10μL; 5x第 2链合成缓冲液 10μL; DEPC处理水 22. 5μL;混匀后加 E.
coli DNA聚合酶 I ( 3. 5uni ts /μL) 6. 5μL, E. coli RNase /连接酶混合物 1. 0μL。 按 12℃ 1h ,
22℃1h, 70℃ 10min顺序反应合成 cDN A第 2链 ; ( 4) 加入 T4 DNA聚合酶 I( 1units /μL)
2μL,混匀后 , 37℃反应 10min,以修平末端 ; ( 5) 加 4μL终止液停止反应。
合成的 cDN A需纯化后才能进行扩增。但是 , 56μL体积无法操作 ,另外 ,微量 cDN A也无
法沉淀。向反应产物加 160μL水 ,使体积变成 216μL,另加入 10μg酵母 tRN A( DEPC处理水
配制 , 5μg /μL, - 20℃保存 )作沉淀载体。用苯酚 /氯仿 ( 25 /24 /1平衡酚 /氯仿 /异戊醇 )、氯仿、
氯仿抽提 ,加入等体积 4mo l /L醋酸铵 ,混匀后加等体积异丙醇 ( 436μL) ,混匀 , - 20℃放置过
夜 , 12 000r /min离心收集沉淀 , 80%乙醇洗涤 ,空气干燥后溶解在 5μL水中。向 5μL cDN A溶
液中加 12 000r /minCA接头 2μL,连接溶液 II 6μL,混匀后加连接溶液 I 12μL,混匀 , 16℃反应
30min。加 25μL4mol /L醋酸胺、 50μL异丙醇 , - 20°C放置 30min, 12 000r /min离心 10min,弃
上清、 80%乙醇洗涤 ,简单干燥 ,溶解在 30μL水中。
按顺序配制 cDN A PCR扩增体系: cDN A溶液 5μL; 10x缓冲液 5μL; dN T P混合液
( 10mmol /L each ) 1μL; RA引物 0. 5μL; CA引物 0. 5μL; M gCl2 ( 25mmo l /L) 4μL; LA Taq酶
2. 5μL;水 31. 5μL。 PCR循环条件: 94℃ 1min接 94℃ 1. 5min, 60℃ 2min, 72℃ 3min 30个循环 ,
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再接 72℃ 8min,用 5μL做电泳检测 ,剩余保存于 - 20℃。电泳确定 cDN A分布和量 ,并判定
cDN A合成、扩增是否成功。如果成功 ,再用 5个反应扩增其余 25μL,合并 PCR产物 ,酚抽提
纯化 ,沉淀 ,溶于 50μL水。
为除去小分子量 cDN A,将扩增的 cDN A用 0. 8%低熔点琼脂糖电泳 ,回收溴酚蓝以上
(包括溴酚蓝 ) DN A(> 0. 5kb)。 回收方法:加热融化琼脂糖胶 ,酚 /氯仿抽提 ,沉淀 ,溶于 10μL
水中。由于 cDN A微量 ,加 10μg酵母 tRN A作沉淀载体。用试剂盒提供的各种已知浓度 DNA
片段对照进行 cDN A定量。
利用 pMD 18-T载体 (大连宝生物工程公司 )进行 cDN A克隆。 固定载体为 50ng ,调整
cDN A量使 cDN A与载体摩尔比在 5～ 15之间 ( cDN A平均分子量按 1. 0 kb计算 ) ,连接并通
过转化确定最佳摩尔比。感受态细胞制备用 CaCl2法 ,受体菌为 JM109。
1. 3重组子鉴定　　用牙签大头端将菌落转移到 20μL水中 ,取 5μL进行 PCR检测 ,其余暂时
保存于 4℃。 检测 PCR反应组成如下: 菌落水溶液 5μL; 10x缓冲液 2μL; dN TP混合液
( 10mmol /L each ) 0. 4μL;引物混合物 ( 0. 5pmo l /μL each ) 0. 8μL( pUC18上正反向测序通用引
物对 ) ;酶 0. 25μL; M gCl2 ( 25mmol /L) 1. 6μL;水 9. 95μL。 PCR循环条件: 94℃ 1. 5min, 55℃
2min, 72℃ 1. 5min 30个循环。 电泳检测。
1. 4测序、 ES T功能基因鉴定　　用牙签将含插入片段的转化子接种在平板上 ,待菌落长到直
径 1mm左右 ,用牙签转移到 40%甘油中 - 20℃保存 ,另穿刺培养 ,进行商业测序。由于 CA引
物在 cDN A5′端 ,且测定的序列与 mRNA相同 ,作者要求公司合成 CA引物并用于测序。获得
cDN A序列后 ,修剪掉载体、引物序列 ,获得不同基因的表达序列标签。 序列格式转换、对线排
列 ( alignment )、分组、同源蛋白搜寻等按杨官品等 [5 ]方法进行。
2　结果与讨论
利用本文报道的方法 ,作者从悬浮培养的条斑紫菜丝状体提取了较高质量的总 RNA。 电
泳显示 3条带 ,依次为小分子 RNA、 18S和 28S RN A。 18S和 28S RN A带清晰 ,表明 RNA降
解少 ,分子完整 (图 1)。提取的 RNA中常有微量 DNA污染 ,但不影响用该方法构建 cDN A文
库。在纯度上 ,提取的总 RNA符合 cDN A合成要求。提取总 RNA用了约 50mg新鲜丝状体 ,
在合成 cDN A时仅用了总 RNA的很小部分。因此 ,本文的方法适合构建微量材料 cDN A文
库。构建微量材料 cDN A文库对许多遗传学、发育生物学、生理学问题研究至关重要 ,因为这
些问题有时只发生在极微量的组织中 ,有时可能只是几个、几十个细胞。 从大量组织材料中分
离 mRNA,步骤多、时间长 ,内外源 RNA酶对 mRNA的降解是传统 cDN A文库构建方法非
常难解决的问题。本方法步骤少、过程短 ,可克服这些问题。如果利用酵母 t RN A等沉淀载体 ,
组织量还能进一步减少。另外 ,由于量小 ,控制 RNA酶对 RNA的降解比较容易。如果向从柱
子中洗脱的总 RNA中加 RNA酶抑制济 ,则在提取全程都有变性剂或者抑制济保护 ,使提取
的 RNA非常完整。该方法的建立使许多过去因材料限制无法开展的研究可以方便、快速地进
行。
　　微量 RNA给 cDN A合成和克隆带来操作上的困难。传统方法一般用微克级的 mRNA作
为逆转录底物 ,因此 ,获得的 cDN A够后续的检测和克隆需要。另外 ,在合成 cDN A过程中 ,一
般要加同位素 ,以判断合成成功与否以及检测合成效率。 但是 ,使用微量总 RNA,无法获得足
491期 杨官品 ,等:条斑紫菜丝状孢子体 cDNA文库构建及抗病相关基因鉴定
图 1　条斑紫菜丝状孢子体总 RN A
Fig. 1　 To tal RNA ex t ract o f P .
yezoensis filamentous spo rophy te
够的 cDN A。作者引入了具有较好高保度的 LA Taq聚合酶 ,
以增加 cDN A序列保真度。 同时 ,该酶的保真度是有限的 ,合
成的 cDN A末端仍有悬挂的 A,可进行 TA克隆。由于只有错
配 ,没有引起插入或缺失 ,合成的 cDN A符合绝大多数研究需
要。如果要进一步提高保真度 ,只要用高保真酶即可 ,但合成
的 cDN A末端没有 A。
理论上讲 , PCR过程对不同长度 cDN A是等比例扩增
的。大连宝生物工程公司的 cDN A PCR文库试剂盒能保证任
意 cDN A被特意引物扩增出来 ,说明 cDN A扩增过程中不同
长度 cDN A的扩增效率不存在偏差。图 2显示扩增的 cDN A
分子量分布与用传统方法获得的其它真核生物 cDN A分布相似 ,说明 cDN APCR扩增不会显
著改变不同长度分子量 cDN A的比例。在 cDN A文库构建过程中引入 PCR是合理可行的。经
过 PCR扩增可以从微量总 RNA获得足够量的 cDN A。 这些 cDN A可以作为一个混合体 ,用
基因特异引物进一步扩增目的基因 ,即 cDN A PCR文库 [ 6] ;能被插入载体 ,转化细菌构建传统
cDN A文库 ;也能用于差异展示等分离组织或发育时期特异表达的基因。
图 2　 PCR扩增后的 cDNA。 M,分子量标
记 ; 1和 2,扩增后的 cDN A, 3,酵母 tRN A
Fig. 2　 PCR- am plified cDN A. M ,
molecular ma rker , 1 and 2, amplified
cDNA , 3, yeast t RNA
　　本研究发现 ,利用 pMD 18-T载体进行 cDN A克隆 ,
每 50ng载体能获得 200～ 250个转化子 ,每微克载体能
获得 4 000～ 5 000个转化子 ,其中 ,约 87%的转化子含较
长的插入片段。这样的效率已经能满足诸如 EST分析等
绝大多数研究的要求。除具有传统 cDN A合成方法特点
外 ,该方法可以在极其有限的材料量中开展有关研究。图
3是利用载体上测序通用引物对对转化子进行的 PCR检
测示例。在 15个被鉴定的重组子中 ,只有 2个可能是假
阳性 ,即含很短的插入序列或不含插入片段。
随机挑选 250个转化子 ,进行插入片段鉴定 ,发现最
少有 200个是阳性克隆 ,含有较长的插入片段。将这些克
隆经商业服务进行单方向测序 ,去除质量不高、读序较短
的反应 ,共获得 170条标签序列。依据标签序列间的相似性 ,作者把这些序列分成 106组 ,每组
图 3　重组子 PC R检测 , M ,分子量标记 , 1～ 15,用测序通用引物对转化子进行 PC R扩增的结果
Fig. 3　 Identification o f r ecombinants. M , molecular marke r, 1 through 15, PC R products
am plified fr om randomly picked tr ansfo rmants using univ ersal sequencing primer pairs
50 青　岛　海　洋　大　学　学　报 2 0 0 3年
取 1条序列进行 Blast分析。 从这些标签序列中 ,鉴定出 6个与紫菜抗病相关的标签序列 (表
1)。本研究结果为进一步利用日本、韩国等国研究者发表的序列 ,寻找这些序列的单核苷酸变
异 ,研制 SNP标记 ,进行种质鉴定、遗传多样性分析、抗性辅助选择等提供了一定的基础。
表 1　 6个抗逆相关基因的表达序列标签
Table 1　 Six disease resistance r elated expressed sequence tags o f P . yezoensis filamentous spor ophyte
表达序列标签
ESTs
标签长度 ( bp)
Tag leng th
标签数据库号
Accession No.
标签功能
Putativ e func tion
同源蛋白
Da tabase match
PYF82 628 BI304280 Ca ta lase A55092
PYF201 609 BI304376 Ca ta lase C82183
VC1585
PYF126 683 BI304315 Pro teinase IV BAB35895. 1
PYF132 296 BI304319 Exo ribonuclea se AAG08322. 1
Rnase R
PYF158 289 BI304342 Hydro la se AAK45485. 1
PYF161 538 BI304345 Unspecific T02995
monooxygenase
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511期 杨官品 ,等:条斑紫菜丝状孢子体 cDNA文库构建及抗病相关基因鉴定
Construction of the cDNA Library of Filamentous Laver Sporophyte
and the Identif ication of Disease Resistance Gene Tags
Yang Guanpin
1　 Liu Yong jian1　 Sun Xue1　 Shen Huaishun2　Xu Pu2　 Zhang Xuecheng1
( 1 College of Marine Lif e Sciences , Ocean University of China, Qingdao 266003,China)
( 2 The Inst itute of J iangsu Marine Aquaculture , N antong 226007,China)
Abstract　 The cDN A libra ry w as const ructed f rom a small amount of filamentous spo ro-
ph yte o f Porphyra yezoensis by the PCR ampli fica tion of cDN A. The pro tocol includes
steps such as the ex t raction of to tal RN A, cDN A synthesis, cDN A ampli fication and
cloning. The const ructed cDN A library has been used for expressed sequence tag analy-
sis, and six disease resistance gene tag s w ere identi fied. These tags ho ld the potential fo r
being developed into sing le nucleo tide po lymorphism markers, which wil l enhance the
genetic improvement o f lav er resistance perfo rmance.
Key words　 Porphyra yezoensis; cDN A PCR library; cDN A library; expressed sequence
tag; disease resistance gene
海　洋　人　物
采尔蒂斯 , C. ( Conradus Celti s, 1459-02-01～ 1508-02-04)德国学者 ,拉丁文抒情诗人。其
名声在于: 在南日耳曼图书馆觅得一份所谓波伊庭格古地图 ( Tabula Peutingeriana) ,即罗马
帝国的一张地图。该图 1736年成为维也纳图书馆财产。维也纳的版本是罗马帝地图的抄
本 ,称波伊庭格挂图 ,由 11张羊皮卷构成。在一张狭长的地图上有罗马国的道路 ,居民点
(符号有大小区别 ) ,距离标注准确 ,有较大城市的名称。有高山、大河、海岸轮廓等。他还编
了塔西佗 ( Taci tus, C)的名著《日耳曼地方志》 ,并发现了德国第一位女诗人赫罗斯维塔
的手稿。
(刘安国 )
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