全 文 ：菊花脑叶片组织培养再生植株的研究
费建业 ,黄文苑 ,白 卉 ,杨 阳 ,贲爱玲 ,蔡小宁＊　(南京晓庄学院生命科学系,江苏南京 211171)
摘要　[目的] 建立菊花脑叶片组织培养再生技术。[方法] 以菊花脑叶片作为外植体 ,以MS为基本培养基 ,通过添加不同激素设计 10
种培养基 ,研究不同种类和浓度的激素组合对菊花脑不定芽和根诱导率的影响 , 筛选愈伤组织诱导、芽诱导及生根的最佳培养基。[结
果] 将无菌苗的叶片外植体接种于最佳愈伤组织诱导培养基MS+2.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/LNAA ,培养 15 d可获 98.0%的诱导率;之后
将带有少量外植体的愈伤组织切下 ,接种到最佳芽诱导培养基MS+1.0 mg/ L 6-BA+0.5 mg/L NAA上培养 ,可获 94.0%的出芽率;然后
再将 1 cm以上的再生芽转接至最佳生根培养基MS+IBA 0.05 mg/L上生根 ,生根率达 100%;生根 25 d以上的幼苗经炼苗和移栽后 ,成
活率在 95%以上。[结论] 建立了菊花脑叶片组织培养再生植株的技术程序。
关键词　菊花脑;叶片;组织培养;再生植株
中图分类号　S 603.6　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2009)17-07872-03
Plant Regeneration in the Tissue Culture of Chrysanthemum nankingense Leaves
FEI Jian-ye et al　(Department of Life Science, Nanjing Xiaozhuang University , Nanjing, Jiangsu 211171)
Abstract 　[Objective] The study aimed to establish the high efficient tissue-culture regeneration system for the leaf of Chrysanthemum nankingense.
[Method] With the leaves of C.nankingense as explants andMS medium as basicmedium , 10 kinds of mediawere designed by adding various hormone
intoMS medium so as to research the effect of various hormone combination and concentrations on induction rate of adventitious bud and rooting of
Chrysanthemum nankingense leaves , and screen the optimal medium for callus induction , bud induction and rooting.[ Result] The leaf explants of asepsis
seedlingswere cultured on the optimum medium of MS+2.0 mg/L 6-BA +0.2 mg/L NAA for inducing callus for 15 d , which got the induction of
98.0%, and then the callus with less explant were cultured on optimal medium of MS+1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA for bud induction , which got
the budding rate of 94.0%, afterward the regenerated buds with length of over 1cm were cultured on optimal rooting medium of MS+IBA 0.05 mg/L ,
which got rooting rate of 100%, finally the seedlings that rooted for over 25 d had survival rate of over 95% after hardening and transplanting.[ Conclu-
sion] In the experiment , the tissue-culture regeneration technique procedure for C.nankingense leaf was established.
Key words　 Chrysanthemum nankingense;Leaf;Tissue culture;Regenerated plant
基金项目　南京晓庄学院重点项目(2007NXY01);生态学校级重点学
科项目(2005-2008);江苏省高校自然科学基金项目
(08KDJ180011);江苏省高等学校大学生实践创新训练计划
项目(2007-2009)。
作者简介　费建业(1986-),女 , 江苏盐城人 , 本科生 , 专业:生物技
术。 ＊通讯作者 ,研究员 , E-mail:bioxncai@yahoo.com.cn。
收稿日期　2009-03-02
　　菊花脑(Chrysanthemum nankingense)为菊科菊属多年生宿
根性草本植物 ,其嫩梢 、叶可以食用。菊花脑营养丰富 ,含有
多种人体必需的氨基酸 、纤维素以及大量的微量元素。此
外 ,还含有黄酮类和挥发油等芳香物质 ,有浓郁的芳香味 ,对
病原微生物有较强的抑制作用 。菊花脑具有清热解毒 、润
喉 、开胃 、降血压 、治便秘 、明目等功效 ,是一种具有药用价值
的保健蔬菜[ 1-2] 。目前 ,人们已经开展了菊花脑栽培技
术[ 1-2] 、药用化学成分[ 3-4] 、加工技术[ 5] 、保鲜技术[ 6] 、植物
保护[ 7] 、胚胎发育[ 8] 、种间杂交[ 9] 、染色体加倍[ 10]等方面的研
究 ,但有关菊花脑组织培养的研究尚未见报道。笔者以菊花
脑叶片为外植体 ,研究了不同植物生长调节剂组合对愈伤组
织形成和不定芽分化 、生根的影响 ,旨在为菊花脑的生物技
术育种奠定基础。
1　材料与方法
1.1　培养基的配制　以MS为基本培养基 ,添加不同组合
的植物生长调节剂 ,含蔗糖 30.0 g/L ,琼脂 4.8 g/L ,灭菌前用
1 mol/L NaOH或 1 mol/L HCl将培养基 pH值调到 5.8 , 121 ℃
高压灭菌 20min。
1.2　无菌苗的获得　取 84消毒液和蒸馏水按体积比 1∶1
混合均匀后配制成灭菌液。取适量的菊花脑种子(南京明华
种业有限责任公司生产),放在离心管里 ,加入配制好的灭菌
液 ,浸泡 8 min。将离心管通过离心机以 4 000 r/min离心 2
min ,倒掉灭菌液。再在无菌操作台上 ,向离心管中加入无菌
水 ,轻微振荡后 ,4 000 r/min离心 2 min ,倾去无菌水 ,重复用
无菌水洗涤 3次 。然后将灭过菌的菊花脑种子接种到配制
好的不加激素的培养基上 ,放到温室中培养。培养温度 28
℃,光照强度 2 000 lx , 每天光照 12 h。2个星期左右后即可
看到长出的菊花脑幼苗 ,然后在无菌操作台上 ,将幼苗转入
同样配方的培养基中继代培养 ,每瓶种植 4 ～ 6棵菊花脑幼
苗 , 1个月后取外植体进行后续培养。
1.3　叶片外植体的接种　选取苗龄约 25 d的菊花脑无菌
苗为试材 ,在无菌操作台上挑选较上端幼嫩叶片 ,切成大约
1 cm×5mm大小的叶片切块 ,正面向上接种在培养基上 ,放
在温室中培养 。培养温度 28 ℃,光照强度 2 000 lx ,每天光照
12 h 。1个月后观察愈伤组织 、不定芽诱导的情况 。
1.4　根的诱导　当在培养基中诱导出的芽长度超过 1 cm
时 ,从芽丛上切下来 ,接种到生根培养基上 ,诱导生根。培养
温度 28 ℃,光照强度 2 000 lx ,每日光照 12 h。30 d后观察生
根的情况。
2　结果与分析
2.1　愈伤组织的诱导　为研究不同植物生长调节剂组合对
愈伤组织诱导的影响 ,设计了 10种不同的培养基。叶片外
植体在 4号 、7号 、1号培养基上培养约 5 d后 ,外植体切口部
分逐渐膨大形成各种愈伤组织 ,15 d后 ,可观察到接种的叶
片有绿色的愈伤组织产生 。9号 、10号培养基中由于未加任
何生长调节剂 ,愈伤组织的诱导率较低 ,且生长较迟缓;1 ～ 8
号培养基中由于添加了NAA 、6-BA ,故愈伤组织长势良好且
生长较快。不同植物生长调节剂组合对愈伤组织诱导率的
影响见表 1 。由表 1可知 , 6-BA与NAA的不同浓度配比对愈
伤组织诱导率的效果明显不同;当 6-BA 与 NAA的浓度配比
为 10～ 15时 ,愈伤组织的诱导率最高 ,如 1号 、4号和 7号培
养基的诱导率分别为 92.0%、98.0%、94.0%,其中以 4号培
安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri.Sci.2009 ,37(17):7872-7874　　　　　　　　　　　　　　　　　　责任编辑　金琼琼　责任校对　张士敏
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2009.17.118
养基愈伤组织的诱导率最高。
表1　不同植物生长调节剂组合对菊花脑叶片愈伤组织诱导的影响
Table 1　The effects of different plant growth regulators combinations on
callus induction of Chrysanthemum nankingense leaves
培养基编号
No.of
media
基本成分
Basic
components
生长调节剂浓度∥mg/ L
Growth regulators
6-BA NAA
接种数
Inoculation
number
愈伤数
Calli
number
诱导率∥%
Induction
rate
1 MS 　1.0 　 0.1 50 46 92.0
2 MS 1.0 0.5 50 38 76.0
3 MS 2.0 0.1 50 42 84.0
4 MS 2.0 0.2 50 49 98.0
5 MS 2.0 1.0 50 41 82.0
6 MS 3.0 0.1 50 36 72.0
7 MS 3.0 0.2 50 47 94.0
8 MS 3.0 1.0 50 43 86.0
9 MS 0 0 50 34 68.0
10 1/2 MS 0 0 50 32 64.0
2.2　不定芽的诱导　叶片在愈伤组织诱导培养基上培养
15 d后 ,在叶片的边缘 ,伤口已形成愈伤组织块 。将带有少
量外植体的愈伤组织切下接种到芽诱导培养基上进行培养 ,
可以观察到接种的愈伤组织继续膨胀 ,约 20 d后愈伤组织的
边缘处可看到芽点 ,而且芽点比较集中 ,在愈伤组织中部的
芽点较少。约 30 d后 ,芽开始从边缘芽点上长出来 ,随后中
部芽点也开始分化出芽(图 1)。不同生长调节剂组合对不定
芽诱导率的影响见表 2。
图 1　菊花脑组织培养诱导不定芽
Fig.1　Induction of adventitious buds of Chrysanthemum nankingense
by tissue culture
　　由表 2可见 ,6-BA的浓度不变 ,不定芽诱导频率随 NAA
浓度的增加而增加;NAA的浓度不变 ,不定芽诱导频率随
6-BA浓度的增加而增加。8种培养基中 , 2号 、5号 、8号培养
基的出芽率较高 ,在 90.0%以上 ,而且芽的数量 、质量均较
高 ,尤其是 2号培养基中的芽不仅数量多而且体积大 ,长势
旺盛;1号 、6号 、7号培养基可形成丛芽 ,但是芽过密集且呈
簇生状堆积于培养基中 ,芽比较小 ,颜色浅 ,长势欠佳;3号 、4
号培养基诱导芽的效果很差 ,而且与培养基接触的愈伤组织
部分褐化。综上所述 ,诱导芽的最佳培养基为MS+1.0 mg/L
6-BA+0.5mg/L NAA。
2.3　根的诱导　将再生出来的高度 1 cm以上的芽转接至生
根培养基 ,结果见表 3。由表 3可见 ,在几种生长调节剂组合
的培养基上 ,生根率均达 100%(图 2)。进一步观察发现 ,在
2号培养基中根出现最早 ,长得也最粗壮 ,后期生长也比较
好;1号培养基中根生长得多而细长 ,根较壮 ,根毛丰富;3 号
培养基中根生长得也较早 ,根粗壮 ,但是根较短 ,颜色深 ,发
黑;4号培养基中根较细 、较长 ,侧根较少;5 号培养基中的情
况与 4号相似 ,根细长 ,较多。综合分析可知 , 2号培养基中
根生长得最快 ,质量最高 。因此 ,2号培养基MS+0.05mg/L
IBA为最佳生根培养基。
表 2　不同生长调节剂组合对菊花脑叶片不定芽再生的影响
Table 2　Effects of different growth regulators on the adventitious bud re-
generation of Chrysanthemum nankingense leaves
培养基编号
No.of
media
基本成分
Basic
components
生长调节剂浓度∥mg/ L
Growth regulators
6-BA NAA
接种数
Inoculation
number
出芽数
Explant
number
with buds
诱导率∥%
Induction
rate
1 MS 1.0 0.1 50 　 21 42.0
2 MS 1.0 0.5 50 47 94.0
3 MS 2.0 0.1 50 8 16.0
4 MS 2.0 0.2 50 8 16.0
5 MS 2.0 1.0 50 45 90.0
6 MS 3.0 0.1 50 17 34.0
7 MS 3.0 0.2 50 22 44.0
8 MS 3.0 1.0 50 49 98.0
表3　不同浓度生长素对菊花脑不定芽根再生的影响
Table 3　Effects of different concentrations of auxin on root regeneration of
adventitious bud of Chrysanthemum nankingense
培养基编号
No.of
media
基本成分
Basic
components
吲哚丁酸浓度∥mg/L
IBA conce-
ntration
接种数
Inoculation
number
生根数
Root
number
生根诱导率∥%
Rooting
induction rate
1 MS 　　0.02 31 31 100
2 MS 0.05 31 31 100
3 MS 0.10 34 34 100
4 MS 0 24 24 100
5 1/ 2MS 0 27 27 100
图 2　菊花脑完整再生植株
Fig.2　Intact regenerated plantlets of Chrysanthemum nankingense
2.4　生根植株的移栽　生根培养 25 d后 ,将生根苗从组培
室转移到有阳光的地方炼苗 ,炼苗 1周后 ,将小苗取出 ,小心
用流水冲洗 ,去掉根表面的培养基残留物 ,移栽到土中 , 1周
后即可成活 ,成活率在 95%以上。
3　小结与讨论
由于菊花脑的种子体积太小 ,较难用镊子均匀分拨 。可
用灼烧过的镊子挑取 40～ 50粒的菊花脑种子 ,轻轻放入培养
基后 ,用灭菌处理过的胶头滴管吸取大约 2ml的无菌水注入
787337卷 17期　　　　　　　　　　　　　　　费建业等　菊花脑叶片组织培养再生植株的研究
培养基 ,轻轻摇动培养基 ,这样在无菌水的作用下菊花脑种
子很容易均匀地在培养基中分布开来 ,最后微微倾斜培养
基 ,选取一个好的角度用胶头滴管将无菌水吸出来 。
以往的研究表明 ,激素在植物组织培养中起着决定性作
用。植物细胞具有全能性 ,但对于特定的器官或细胞能否表
现出全能性则取决于是否具有合适的外源激素组合 ,只有细
胞分裂素与生长素的合理配制才能有较高的诱导频率[ 11] 。
通常细胞分裂素与生长素的比例较高 ,有利于芽的分化 ,因
此在试验过程中经常使用较低浓度的生长素[ 12] 。但在菊花
脑的组织培养中 ,生长素的浓度过低 ,反而会降低芽的分化
频率。对菊花脑而言 ,一定浓度的生长素显然有利于不定芽
分化进程的启动。
通过该试验 ,笔者建立了菊花脑叶片组织培养再生植株
的程序 ,即菊花脑种子在培养基中萌发获得无菌苗 ,之后将
叶片外植体接种于愈伤组织诱导培养基MS+2.0mg/L 6-BA
+0.2mg/L NAA上诱导愈伤组织 ,培养 15 d后 ,将带有少量
外植体的愈伤组织切下接种到芽诱导培养基MS+1.0 mg/L
6-BA+0.5mg/L NAA上进行培养 ,然后将再生出来的高度 1
cm以上的芽转接至生根培养基MS+0.05mg/L IBA上生根 ,
生根 25 d以上的苗再进行炼苗和移栽。
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(上接第 7854页)
表 1　不同浓度激素及配比对虎舌红愈伤组织诱导和叶片不定梢再生的影响
Table 1　Effects of different concentrations and types of hormone on the callus induction of Ardisia mamillata
试验号
Treatment
No.
激素配比∥mg/ L
Hormone proportion
TDZ IAA AgNO3
愈伤组织 Calli
诱导率∥%
Induction rate
生长状况
Growth status
不定梢 Adventitious shoots
再生率∥%
Regeneration rate
生长状况
Growth status
1 1.0 0.2 1.0 　46.13 白色 ,结构疏松 　　　0
2 1.0 0.4 3.0 76.50 淡黄色 ,结构较疏松 10.34 植株纤细 ,浅绿色
3 1.0 0.8 5.0 58.14 白色 ,结构疏松 0
4 2.0 0.2 3.0 100.00 黄绿色 ,结构致密 45.80 植株生长健壮 ,颜色正常
5 2.0 0.4 5.0 96.42 黄绿色 ,结构致密 30.29 植株生长健壮 ,颜色正常
6 2.0 0.8 1.0 72.16 淡黄色 ,结构较致密 18.45 植株纤弱 ,少数基部愈伤组织出现生根
7 3.0 0.2 5.0 95.43 黄绿色 ,结构致密 39.76 植株生长健壮 ,颜色正常
8 3.0 0.4 1.0 54.16 淡黄色 ,结构较疏松 26.42 植株纤弱
9 3.0 0.8 3.0 62.18 黄绿色 ,结构致密 25.43 植株健壮
　注:愈伤组织诱导率=发生愈伤组织的叶片数/接种后成活的叶片数×100%;不定梢再生率=发生不定梢的叶片数/接种后成活的叶片数×
100%。
　Note:Callus induction rate = the leaves number wi th calli / the survival leaves number after inoculation×100%.Regeneration rate of adventitious shoots = the
leaves number with adventitious shoots/ the survival leaves number after inoculation ×100%.
湿度 80%以上),移栽成活率达 80%以上。
3　结论与讨论
该研究建立了虎舌红叶片的离体再生体系 ,为遗传转
化研究奠定了基础 ,并为其离体培养提供了一种新的外植
体类型 。研究表明 ,取试管苗顶端叶片作外植体可以获得
较高的不定梢再生率 ,试验中 , 1/2MS+TDZ 2.0 mg/L+IAA
0.2 ～ 0.4 mg/L+AgNO3 3.0 ～ 5.0 mg/L为诱导虎舌红叶片
再生不定梢的适宜培养基 ,但不定梢的再生率不高 ,因此在
激素种类 、浓度配比和培养条件方面还有待进一步研究。
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7874 　　　　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009年