全 文 ：第 29卷第 4期　　　　　　　　　　　　　上海师范大学学报 (自然科学版 ) Vol. 29 , No. 4
2 00 0年 1 2月　　　　　　　　　　 J. of Shanghai Teach ers Univ. ( Natural Sciences) Dec . 2 0 0 0
甜叶菊叶片离体培养及试管无性系的建立
娄玉霞 , 宋磊 , 李新国 , 程国福
(上海师范大学 生物与化学工程学院 , 上海奉贤 201418)
摘　要: 研究了离体条件下甜叶菊 ( Stivia rebaudiana Bertoni)叶片愈伤组织诱导和植株再生
技术 .离体培养以 M S为基本培养基并附加 300 mg /L水解酪蛋白 .离体叶片在 BA 0. 5 mg /L和
N AA 0. 5 mg /L的培养基上诱导形成愈伤组织 .在 BA 0. 5 mg /L和 NAA0. 05 mg /L的培养基
上可诱导愈伤组织分化不定芽 ,分化频率为 100% .不定芽在 White基本培养基并附加 N AA0.
01 mg / L的培养基上诱导生根 ,生根率可达 100% .炼苗后移栽 ,成活率达 95%以上 .
关键词: 甜叶菊 ; 叶片 ; 愈伤组织 ;再生植株
中图分类号: Q322　　文献标识码: A　　文章编号: 1000-5137( 2000) 04-0074-04
0　引　言
　　　　　　　　　　
收稿日期: 2000-07-03
作者简介: 娄玉霞 ( 1970-) ,女 ,上海师范大学生物与化学工程学院助教 .宋磊 ( 1972-) ,女 ,上海师范大
学生物与化学工程学院助教 .
甜叶菊属菊科植物 .叶片中含有的甜叶菊糖甙是已被广泛应用于食品饮料的一种天然
甜味剂 .其甜度是蔗糖的 300倍 ,热量仅为蔗糖的 1 /300,而且具有降低血糖、促进代谢、预防
小儿龋齿等功效 [1 ] ,因此特别适用于糖尿病、肥胖症和高血压患者使用 .但是 ,由于甜叶菊为
异花授粉植物 [2 ] ,用种子繁殖的后代难以保持原有的优良性状 ,而且种子小 ,极易丧失活力 ,
因此 ,依靠种子繁殖难以满足生产需要 .为此 ,我们开展了甜叶菊叶片愈伤组织再生植株的
研究 .这一研究对于甜叶菊种质资源的保护、开发和利用以及利用生物技术对甜叶菊进行遗
传改良研究都有重要意义 .
1　材料与方法
以当年生的种子实生苗为材料 ,选择旺盛生长时期的植株 ,取着生于植株最顶端的新展
开的幼叶做外植体 ,进行愈伤组织诱导和不定芽分化 .
实验采用的基本培养基为 MS培养基并附加 300 mg /L水解酪蛋白 ,内含 2%蔗糖和
0. 7%琼脂 .培养温度为 25± 1℃ ,光照强度 2000Lux ,光照时间 12h d- 1 .愈伤组织诱导培养
基为附加不同浓度 BA, N AA和 2, 4-D的基本培养基 .不定芽分化培养基为附加不同浓度
BA和 NAA的基本培养基 .
1. 1　愈伤组织诱导和继代
新展开的幼叶经灭菌处理后 ,叶正面朝上整片接种于愈伤组织诱导培养基上 .愈伤组织
诱导培养基 MS1为附加 BA 0. 5 mg /L和 NAA 0. 5 mg /L的基本培养基 ; M S2为附加 BA 0.
5 mg /L、 NAA0. 1 mg /L和 2, 4-D 0. 5 mg /L的基本培养基 ; M S3为附加 BA 0. 5 mg /L和
NAA0. 1 mg /L的基本培养基 .
愈伤组织的继代培养基为原愈伤组织诱导培养基 ,每 30天继代一次 .
1. 2　愈伤组织不定芽分化
愈伤组织不定芽分化培养基 Mb1为附加 BA 0. 5 mg /L和 NAA0. 1 mg /L的基本培养
基 ; M b2为附加 BA 0. 5 mg /L和 NAA0. 05 mg /L的基本培养基 ; Mb3为附加 BA 0. 5 mg /L
和 NAA0. 01 mg /L的基本培养基 ; M b4为附加 BA 0. 5 mg /L的基本培养基 .
诱导不定芽分化的愈伤组织大小为 1cm× 1cm× 0. 5cm左右 .
1. 3　试管苗生根
取生长旺盛、健壮、高 1. 5～ 2. 0cm不定芽进行生根诱导 .生根培养基为 White基本培养
基并附加不同浓度的 NAA.
2　结果与分析
2. 1　愈伤组织的诱导和继代培养
由表 1可以看出 ,甜叶菊叶片在 MS1 , M S2 , M S3培养基上培养 25 d后形成两种不同类型
的愈伤组织 , M S1和 MS3上形成的愈伤组织为淡黄色、致密、呈颗粒状 ; M S2上形成的为浅褐
色、疏松、水浸状 .这表明:外源激素种类不同对诱导甜叶菊愈伤组织形态起着不同的调节作
用 .这与王凯基等报道的结果一致 [3 ] .
表 1　不同激素对愈伤组织诱导的影响
培养基 外植体数 愈伤组织诱导率 (% ) 愈伤组织特征
MS1 56 100 淡黄色、致密、颗粒状
MS2 50 100 浅褐色、疏松、水浸状
MS3 65 100 淡黄色、致密、颗粒状
　　不同培养基上愈伤组织形成速度不同 . M S1和 MS2上的叶片培养 7天左右就在切口处及
叶尖形成了愈伤组织 ,而 MS3上的叶片在培养 15 d后才在切口处形成愈伤组织 . 3种不同培
养基上诱导形成的愈伤组织培养 30 d后转接到新鲜的原配方培养基上进行继代增殖培养 .
经过两次继代培养后 ,愈伤组织均有增殖 ,但增殖速度不同 , M S1与 MS2中愈伤组织增殖较
快 , M S3中增殖较慢 .愈伤组织状态并没有发生变化 .
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2. 2　愈伤组织不定芽分化
将 MS1 , M S2 , M S3上经两次继代培养的愈伤组织转接到不定芽分化培养基上进行分化
培养 . 10 d左右 , M S1上的愈伤组织除继续增殖外 ,其上形成许多淡绿色的小颗粒 ,随后绿色
渐深 (见封三图版Ⅰ ) .至 28天 ,转至新鲜的分化培养基上 ,约 10天有不定芽分化形成 (图版
Ⅱ ) ; M S3上的愈伤组织也有不定芽分化形成 ,但分化速度和分化的芽数都不及 MS1上的 ;而
MS2上形成的愈伤组织转接到分化培养基上 ,虽有明显增殖 ,但未见不定芽形成 .由此可见 ,
BA与 NAA组合的培养基诱导形成的愈伤组织易分化形成不定芽 ,而 BA与 2, 4-D, N AA
组合的培养基诱导形成的愈伤组织不易分化形成不定芽 ;相同条件下 ,不加 2, 4-D诱导形成
的愈伤组织能够再分化 .由此推断 , 2, 4-D的加入是抑制再分化的主要原因 .就不同浓度水
平 BA和 NAA对不定芽诱导效果进行比较 (表 2)
表 2　不同浓度 BA和 N AA对甜叶菊叶片愈伤组织分化不定芽的影响
BA( mg /L) NAA( mg /L) 愈伤组织块数 分化率 (% ) 每块愈伤组织分化芽数
0. 5 0. 1 30 54. 5 > 4
0. 5 0. 05 30 100 > 10
0. 5 0. 01 30 65. 7 < 5
0. 5 0 30 0 0
　　从表 2可看出 ,分化培养基中含有 BA 0. 5 mg /L和 NAA0. 01～ 0. 1 mg /L均可诱导愈
伤组织分化不定芽 ,但诱导频率和不定芽数量上差异明显 .其中以 BA 0. 5 mg /L和 NAA
0. 05 mg /L的处理诱导效果最好 ,分化率达 100% ,每块愈伤组织分化不定芽数多于 10个 (图
版Ⅲ ) .在不含 NAA的培养基中 ,愈伤组织只形成很硬的绿色组织 ,无不定芽分化 .可见 ,
N AA对甜叶菊愈伤组织的不定芽分化是必需的 .
通过对愈伤组织继代培养与不定芽分化关系的研究发现 ,随着继代次数的增加愈伤组
织的不定芽分化能力降低 ,而且继代次数越多 ,畸形苗出现比率越大 .如要获得大量保持原
性状的试管苗 ,愈伤组织继代次数少于两次为宜 .
在研究中发现 ,分化形成的不定芽有部分出现玻璃化现象 ,原因有待进一步研究 .
Dolev
[ 5]用降低培养基中的相对湿度或增加培养基中的琼脂含量的方法解决苗玻璃化问题 ,
效果很好 .我们采用的办法是苗长至 1 cm左右插于无激素的 MS基本培养基上进行壮苗 ,
有效防止了玻璃化苗产生 ,玻璃化苗逐渐转为正常苗 .
2. 3　试管苗生根与移栽
待健壮的不定芽长至 2 cm左右时 ,剪离愈伤组织 ,扦插于生根培养基上诱导生根 .先经
3天暗培养后再进行光照培养 .研究发现 ,甜叶菊试管苗生根需要较低水平的外源 NAA,对
其浓度的要求不严格 , N AA0～ 0. 1 mg /L均能诱导试管苗生根 .但以 White基本培养基附
加 NAA 0. 01 mg /L上产生的根最壮、最多 ,生根率达 100% (图版Ⅳ ) .这与樊映汉等报道的
试管苗生根所需 NAA浓度不同 [4 ] .待根长至 2cm左右 ,打开试管瓶口置于室内阳光下炼苗
两天 ,取出生根苗 ,洗去根上附着的培养基 ,栽种于 14cm口径的花盆中 (图版Ⅴ ) .花盆中的
营养土或基质要经过消毒处理 ,湿度保持 80%左右 , 10天后成活率达 95%以上 (图版Ⅵ ) .
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3　结　论
( 1)以甜叶菊幼叶为外植体 ,在附加 BA 0. 5 mg /L和 NAA 0. 5 mg /L的 MS培养基上
诱导形成的愈伤组织适于诱导不定芽分化 .
( 2)在附加 BA 0. 5 mg /L和 NAA0. 05 mg /L的培养基上愈伤组织不定芽分化率及不
定芽分化数量最佳 .
( 3)为了在短时间内获得大量保持原性状且整齐均一的无性系后代 ,愈伤组织继代增
殖时间不宜过久 ,以两次继代后进行分化培养为最佳 .
( 4)在附加 NAA0. 01 mg /L的 White培养基上 ,试管苗生根率达 100% ,移栽成活率达
95%以上 .
参考文献:
[ 1]　徐沛楷 .日本等国对甜叶菊的研究 [ J]. 国外科技 , 1985, 10: 31-34.
[ 2]　吴国柱 .甜叶菊主要生物学特性的初步观察 [ J].江西农业科技 , 1984, 7: 22-26.
[ 3]　王凯基 .甜叶菊离体茎诱导完整植株初报 [ J].植物生理学通讯 , 1980( 3): 32-33.
[ 4]　樊映汉 .甜叶菊 ( Stev ia rebaudiana Beroni)的茎尖培养 [ J].植物生理学通讯 , 1981( 3): 28-31.
[ 5 ]　 DOLEV E. Control o f vitrifica tion in proliferating shoo ts of M26. in: Somers DA( ed) . Th e Intrnation-
al Association for Pant Tissue Cultur e. 6th Inter . Cong . Plant Tissue Cell Culture , M inneapolis, 1986.
Minneso ta : Univ ersity of M inneso ta , 1986, 242.
The Tissue Culture and Plantlet Regeneration
in Vitro of Stevia Rebaudiana Bertoni
LOU Yu-xia, SONG Lei, LI Xin-guo, CHENG Guo-fu
( Colleg e of Biolog y and Chemical engineering , Shanghai
Teachers Univ ersity, Shanghai FengXian 201418, China)
Abstract: The research of callus induction and plantlet r eg enera tion in vitro of Stevia rebaudiana Ber toni was
carried out using the tender leaves and MS medium as the basic medium. The effects of plant g row th regula-
tor s on the plantlet reg eneration were compa red. Callus can be induced from th e excised leaves tha t w ere cul-
tured on the basic medium supplemented with 0. 5 mg /L BA and 0. 5 mg / L NAA. Fo r the adventitious bud
regenera tion of the callus, supplement with 0. 5 mg /L BA and 0. 05 mg /L NAA was appropriate, giving a r e-
generation f requency of 100% . Rooting occur red on the White medium supplemented with 0. 01 mg /L NAA.
The roo ting ra te could reach up to 100% . Th e technique of soma tic cell cloning o f Stev ia rebaud iana Ber toni
wa s established in v itro.
Key words: Stevia rebaudiana Bertoni; leav es; callus; plantlet reg eneration in v itro
77　第 4期　　　　　　　　　　　娄玉霞等:甜叶菊叶片离体培养及试管无性系的建立
《甜叶菊叶片离体培养及试管无性系的建立》 ( 74～ 77页 )图版说明
Ⅰ 　经不定芽诱导培养甜叶菊愈伤组织 ,产生绿色斑块　　　Ⅱ 　甜叶菊愈伤组织开始分化形成不定芽
Ⅲ 　甜叶菊愈伤组织上分化形成了大量不定芽 Ⅳ 　甜叶菊试管苗生根情况
Ⅴ 　刚刚移栽的甜叶菊试管苗 Ⅵ 　移栽成活后长大的甜叶菊试管苗